趙 欣，王 瑩，李春亭，王 巍，桑 銳，李海濤,2*，張雪梅*

(1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112)

乳腺炎是乳腺組織因病原微生物侵害、化學(xué)性刺激、機(jī)械性損傷以及飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)炔涣紬l件刺激下所引發(fā)的炎癥性疾病。奶牛發(fā)生乳腺炎后可導(dǎo)致牛乳產(chǎn)量及乳品質(zhì)大幅下降，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)是大腸桿菌等革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，也是該類病原最強(qiáng)的致病因子之一。Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)是LPS的模式識別受體，LPS能夠激活TLR4引起其下游核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)信號通路活化，釋放大量促炎性細(xì)胞因子，包括腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，1L-1β) 和白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)，從而刺激機(jī)體導(dǎo)致炎癥發(fā)生。

目前，奶牛乳腺炎臨床治療主要以抗生素為主，抗生素在奶牛乳腺炎發(fā)病初期或急性發(fā)作時(shí)有明顯的治療效果，能夠抑制或殺滅病原微生物。但是抗生素的大量使用容易產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留和毒副作用等不良反應(yīng)。蒲公英()又名婆婆丁、黃花地丁、黃花苗等，是一種多年生菊科草本植物。藥理學(xué)研究表明，蒲公英性味甘平、無毒，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物活性，有“天然抗生素”之美稱。因此，本試驗(yàn)通過建立LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型，研究蒲公英提取物對小鼠乳腺炎是否有減輕效應(yīng)及其機(jī)制，為蒲公英的臨床開發(fā)及利用提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級 ICR孕鼠，8 周齡，體質(zhì)量30 g±2 g，購自長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。小鼠飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠盒，自由飲食、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周 后開始試驗(yàn)期。

1.2 主要試劑

LPS購自Sigma公司，地塞米松(dexamethasone，DEX)注射液購自山東魯抗公司，TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒購自Biolegend公司，MPO檢測試劑盒購自南京建成研究所，RIPA裂解液和PMSF均購自碧云天公司，β-Actin購自Santa Cruz公司，兔抗鼠p65、p-p65、IκBα、p-IκB抗體購自CST公司，TLR4抗體購自Abcam公司，兔抗鼠p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK抗體、山羊抗兔IgG二抗購自Santa Cruz公司。

1.3 主要儀器

Miniframs轉(zhuǎn)印儀、IMARK酶標(biāo)儀(美國伯樂)，JY600電泳儀，B15-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，F(xiàn)A135S電子分析天平，E-Gel Imager凝膠成像分析儀，3-30k低溫高速離心機(jī)。

1.4 蒲公英提取物的制備

蒲公英全草購自延吉同仁堂大藥房，提取方法同本實(shí)驗(yàn)室之前的報(bào)道。即取蒲公英全草，蒸餾水浸泡過夜，煎煮3次(分別3、1、1 h)，過濾，合并濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液反復(fù)減壓蒸餾，控制溫度在45 ℃，轉(zhuǎn)速50 r·min，蒸發(fā)后離心30 min，取上清液低壓凍干，試驗(yàn)前加蒸餾水配制成高、中、低劑量。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

母鼠分娩后泌乳5～7 d，將ICR母鼠隨機(jī)分為空白組(CG)、模型組(MG)、陽性組(DEX)及蒲公英提取物高、中、低劑量組(10.0、5.0、2.5 g·kg)，每組10只，蒲公英提取物高、中、低劑量組按照0.2 mL·只灌胃給藥，連續(xù)給藥6 d，2次·d，空白組灌胃等體積生理鹽水，陽性組于建模后6 和12 h腹腔注射5 mg·kgDEX。

1.6 小鼠乳腺炎模型的建立

于末次給藥1 h后，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射適量10%烏拉坦進(jìn)行麻醉，依照文獻(xiàn)報(bào)道建模。對第4對乳房消毒后，充分暴露乳頭，用無菌眼科剪剪去乳頭最尖端0.5 mm，使乳導(dǎo)管充分暴露，采用微量進(jìn)樣器，于乳房基部灌注50 μL 0.2 mg·mL的LPS懸液，空白組小鼠按同樣方法進(jìn)行麻醉，暴露乳導(dǎo)管后采用微量進(jìn)樣器于乳房基部灌注50 μL的生理鹽水。

1.7 ELISA法測定細(xì)胞因子的含量

建模24 h后，將各組小鼠取血，分離血清，ELISA法測定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具體操作按照TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 小鼠血清中MPO的測定

建模24 h后，將各組小鼠取血，分離血清，與血清稀釋液按1∶1比例稀釋，充分混勻制成混合液，之后的操作按照MPO試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 HE染色法觀察乳腺組織病理變化

取10%中性福爾馬林固定的小鼠部分乳腺，流水沖洗24 h，置于生物組織機(jī)脫水，待脫水結(jié)束后進(jìn)行組織塊包埋，隨后用石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為0.5 μm，使用攤片機(jī)攤于潔凈載玻片上，置于烘片機(jī)烘片后,進(jìn)行HE染色以及松節(jié)油封固，鏡下觀察。

1.10 Western blot法檢測乳腺組織中相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)

應(yīng)用RIPA裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取小鼠乳腺組織蛋白，應(yīng)用 BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度，之后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，再轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，TBST洗3次，5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，加一抗(TLR4，p65、IκB、p38、JNK、ERK、p-p65、p-IκB、p-p38、p-JNK、p-ERK)4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，加山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后，加入ECL顯色液后放入顯影儀中進(jìn)行顯影拍照并保存。

1.11 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié) 果

2.1 蒲公英提取物對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠血清中細(xì)胞因子的影響

由圖1可知，模型組與空白組相比，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)量升高，差異極顯著(<0.01)。 蒲公英提取物高、中劑量組與模型組相比，極顯著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量(<0.01)；蒲公英提取物低劑量組與模型組相比，極顯著降低血清中TNF-α和IL-6的表達(dá)量(<0.01)， 顯著降低血清中IL-1β的表達(dá)量(<0.05)。DEX也極顯著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)量(<0.01)。

與空白組比較，##.P<0.01；與模型組比較，*.P<0.05，**.P<0.01。下同Compared with blank group, ##.P<0.01; Compared with model group, *. P<0.05, **. P<0.01. The same as below圖1 蒲公英提取物對小鼠血清中細(xì)胞因子的影響Fig.1 Effect of dandelion extract on serum cytokines in mice

2.2 蒲公英提取物對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠血清中MPO的影響

由圖2可知，模型組與空白組相比，小鼠血清MPO的含量上調(diào)，差異極顯著(<0.01)。蒲公英提取物高、中劑量組與模型組相比，極顯著降低血清中MPO的含量(<0.01)；蒲公英提取物低劑量組與模型組相比，顯著降低血清中MPO的含量(<0.05)。DEX也極顯著降低血清中MPO的含量(<0.01)。

圖2 蒲公英提取物對小鼠血清中MPO的影響Fig.2 Effect of dandelion extract on serum MPO in mice

2.3 蒲公英提取物對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠乳腺病理變化的影響

HE 染色結(jié)果顯示：空白組小鼠乳腺組織具有正常的結(jié)構(gòu)，未出現(xiàn)病理變化(圖3A)。模型組小鼠乳腺組織發(fā)生了明顯的病理變化，主要表現(xiàn)為乳腺內(nèi)有大量炎性細(xì)胞和滲出物浸潤(圖3B)。與模型組比較，蒲公英提取物高、中劑量組明顯減輕了乳腺腺泡內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤程度，僅存在少量滲出物；蒲公英提取物低劑量乳腺腺泡內(nèi)存在一定數(shù)量的炎性細(xì)胞和滲出物(圖3D～F)。陽性組小鼠乳腺細(xì)胞形態(tài)基本正常，乳腺腺泡內(nèi)存在少量滲出物(圖3C)。

A.空白組；B.模型組；C. 陽性組；D. 蒲公英提取物高劑量組；E. 蒲公英提取物中劑量組；F.蒲公英提取物低劑量組。箭頭為小鼠乳腺腺泡結(jié)構(gòu)A. CG； B. MG； C. Positive group； D. Dandelion extract high-dose group； E. Dandelion extract medium-dose group；F. Dandelion extract low-dose group. Arrow shows the acinar structure of mouse mammary gland圖3 蒲公英提取物對小鼠乳腺病理變化的影響Fig.3 Effect of dandelion extract on pathological change of mastitis in mice

2.4 蒲公英提取物對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠TLR4蛋白的影響

通過Western blot方法檢測LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠TLR4蛋白的表達(dá)。由圖4可知，模型組與空白組相比，TLR4蛋白的表達(dá)水平極著顯上調(diào)(<0.01)。 蒲公英提取物高、中、低劑量組與模型組相比，極顯著下調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)水平(<0.01)。DEX也極顯著下調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)水平(<0.01)。

圖4 蒲公英提取物對小鼠TLR4蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of dandelion extract on TLR4 protein expression in mice

2.5 蒲公英提取物對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠NF-κB 信號通路的影響

通過Western blot方法檢測IκB和p65蛋白的磷酸化水平，探究蒲公英提取物對NF-κB信號通路激活情況。由圖5可知，模型組與空白組相比，IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(<0.01)，IκB和p65蛋白的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)；蒲公英提取物高、中劑量組與模型組相比，極顯著下調(diào)IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá)水平(<0.01)，蒲公英提取物低劑量組與模型組相比，顯著下調(diào)IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá)水平(<0.05)。DEX也極顯著上調(diào)IκB和NF-κB p65磷酸化蛋白的表達(dá)水平(<0.01)。

圖5 蒲公英提取物對小鼠NF-κB信號通路的影響Fig.5 Effect of dandelion extract on NF-κB signaling pathway in mice

2.6 蒲公英提取物對LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠MAPKs信號通路的影響

通過Western blot法檢測p38、ERK和JNK蛋白磷酸化水平，探究蒲公英提取物對MAPKs信號通路影響。由圖6可知，模型組與空白組相比，p38、JNK和ERK磷酸化蛋白的表達(dá)水平極顯著上調(diào)(<0.01)； 蒲公英提取物高、中劑量組與模型組相比，p38、JNK和ERK磷酸化蛋白的表達(dá)水平極顯著下調(diào)(<0.01)，蒲公英提取物低劑量組與模型組相比極顯著下調(diào)p38和ERK磷酸化蛋白的表達(dá)水平(<0.01)，顯著下調(diào)JNK磷酸化蛋白的表達(dá)水平(<0.05)。DEX也極顯著下調(diào)p38、JNK和ERK磷酸化蛋白的表達(dá)水平(<0.01)。

圖6 蒲公英提取物對小鼠MAPKs信號通路的影響Fig.6 Effect of dandelion extract on MAPKs signaling pathway in mice

3 討 論

奶牛乳腺炎是由于感染病原體、損傷、過敏或腫瘤引起的乳腺實(shí)質(zhì)炎癥，具有發(fā)病率高、致病因素種類繁多等特點(diǎn)，給畜牧業(yè)和乳制品行業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，并且所引發(fā)的食品安全問題也威脅著人類的身體健康。DEX是臨床上常用的甾體抗炎藥物，在本試驗(yàn)中將其作為陽性藥物使用，但其易產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此尋找有效、安全的天然替代品。蒲公英的抗炎作用已在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中得到了證實(shí)，主要應(yīng)用于治療乳腺炎、胃腸炎、肝炎等疾病。大腸桿菌是乳腺炎最主要的病原之一，LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，乳導(dǎo)管灌注LPS所建立的小鼠乳腺炎模型與臨床上由大腸桿菌感染所引起的奶牛乳腺炎具有相同的癥狀，可用于乳腺炎發(fā)病機(jī)制的探索以及防治藥物的篩選。因此本試驗(yàn)通過LPS誘導(dǎo)建立小鼠乳腺炎模型，探究蒲公英提取物對乳腺炎是否有減輕作用及其機(jī)制。

LPS灌注乳腺導(dǎo)管后，在細(xì)胞膜各種相關(guān)受體的作用下激活一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而釋放炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6等。由巨噬細(xì)胞或乳腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤和活化，損害血管內(nèi)皮細(xì)胞，上調(diào)細(xì)胞黏附分子，促進(jìn)氧自由基的分泌，啟動(dòng)和加重其他炎癥介質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)。IL-6是LPS誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)燒的基本介質(zhì)，并且對白細(xì)胞有趨化作用使其進(jìn)入感染部位，加劇炎癥反應(yīng)過程。在炎性應(yīng)答中，IL-1β 調(diào)節(jié)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附素的表達(dá)導(dǎo)致感染中嗜中性粒細(xì)胞的趨化作用。Nakajima等的研究發(fā)現(xiàn)，在自然感染的乳腺炎中，血清和乳汁中的TNF-α和IL-6表達(dá)量顯著升高。因此抑制這些炎性細(xì)胞因子可以減輕乳腺炎的危害。本試驗(yàn)結(jié)果表明，蒲公英提取物高、中劑量組可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)。Liu等研究了蒲公英提取物對骨骼肌細(xì)胞增殖和減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示，蒲公英提取物顯著降低LPS誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。MPO 主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等合成釋放，也是衡量乳腺炎水平的關(guān)鍵指標(biāo)。本試驗(yàn)中小鼠經(jīng)LPS誘導(dǎo)后血清中MPO含量顯著升高，隨著蒲公英提取物給藥劑量增加顯著降低了小鼠血清中MPO含量。

HE染色法可顯示組織正常和病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)采用HE染色法觀察蒲公英提取物對小鼠乳腺組織損傷影響的情況。本研究中LPS可以引起小鼠乳腺腺泡腔內(nèi)聚集大量的炎性細(xì)胞和滲出物等病理變化，該結(jié)果與唐鑫和歐愛群等的研究結(jié)果相一致，表明小鼠乳腺炎模型構(gòu)建成功。本試驗(yàn)隨著蒲公英提取物給藥劑量增加，明顯減輕了由LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠乳腺病理變化。

TLR4可識別來自革蘭陰性菌的LPS。LPS通過TLR4受體，與TLR4結(jié)合并激活NF-κB，進(jìn)而導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的生成，LPS經(jīng)MyD88依賴性途徑參與炎癥免疫反應(yīng)，是調(diào)控NF-κB和MAPKs的重要途徑。本研究中，隨蒲公英提取物給藥劑量升高明顯減輕由LPS灌注引起乳腺組織中TLR4的表達(dá)。NF-κB信號通路被認(rèn)為是激活炎癥基因表達(dá)從而產(chǎn)生炎癥表型變化的關(guān)鍵參與者，抑制NF-κB激活可以減輕LPS誘導(dǎo)的乳腺炎癥。Chen等通過建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型探究了荷葉堿對乳腺炎的保護(hù)作用，得出荷葉堿通過抑制了TLR4-NFκB信號通路，對小鼠乳腺炎的保護(hù)起到了作用。MAPKs信號通路主要包含P38激酶、c-Jun N末端激酶(JNK)和3種細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)，是信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核的內(nèi)部的重要途徑。ERK活化后，可進(jìn)一步帶動(dòng)其下游底物的激活，進(jìn)而通過對下游蛋白的調(diào)控參與細(xì)胞的生長、增殖、免疫和存活等一系列生物學(xué)過程，JNK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、抗炎和凋亡，p38在氧化應(yīng)激細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、衰老、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等多種生理反應(yīng)過程中起重要作用。JNK 和 p38 的性質(zhì)相似，都屬于應(yīng)激啟動(dòng)的蛋白激酶。Zhang等發(fā)現(xiàn)LPS可以顯著激活MAPKs信號通路誘導(dǎo)乳腺炎發(fā)生，白藜蘆醇預(yù)防后p38和ERK被顯著抑制。這些結(jié)果說明MAPKs信號通路在LPS誘導(dǎo)的奶牛乳房炎中發(fā)揮重要的作用。本研究中蒲公英提取物高、中劑量組極顯著抑制NF-κB和MAPKs信號通路的過度激活，從而減少炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。

4 結(jié) 論

蒲公英提取物能夠降低LPS誘導(dǎo)的乳腺炎小鼠血清中TNF-α、IL-1β 和 IL-6的分泌及MPO的含量，減輕乳腺組織病理變化，抑制TLR4蛋白的表達(dá)，下調(diào)NF-κB和MAPKs通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明蒲公英提取物通過調(diào)控NF-κB和MAPKs信號通路對LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎具有減輕作用。