王 勇，王懷棟，郭永清，俞 英，王楚端，王曉鑠, *

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，包頭014109；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193)

豬RNA病毒的模板有正鏈病毒RNA模板、負(fù)鏈病毒RNA模板和全長(zhǎng)正負(fù)鏈反基因組RNA模板，即雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)模板。dsRNA作為單鏈RNA5 OAS)/ RNaseL系統(tǒng)所識(shí)別，并誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-α / β)的產(chǎn)生。Poly I:C(Polyinosinic： polycytidylic acid)為多聚肌苷酸Poly(I)和多聚胞苷酸Poly(C)的共聚物，通常用于模擬病毒的復(fù)制中間體雙鏈RNA(dsRNA)。通過(guò)合成不同長(zhǎng)度的Poly I:C，研究dsRNA作為病毒或者免疫刺激劑轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的分子免疫機(jī)制。Liu等認(rèn)為短片段的 polymer(～300 bp) 不會(huì)激活MDA-5，但它是RIG-I潛在的配體。相反的，長(zhǎng)片段的 Poly I:C 更偏好激活MDA-5，長(zhǎng)度≥63 kb的PolyI:C 通常用于研究RNA sensing。但關(guān)于dsRNA轉(zhuǎn)染豬細(xì)胞的全基因組甲基化機(jī)制仍沒有被研究。

全基因組甲基化是近些年發(fā)展較快的新興學(xué)科，就像分子生物學(xué)的發(fā)展由單個(gè)基因進(jìn)入全基因組的研究一樣，DNA甲基化也由對(duì)少數(shù)位點(diǎn)的修飾分析進(jìn)入了全基因組水平的“全景式”研究階段。DNA甲基化與人類發(fā)育和腫瘤等疾病密切相關(guān)，特別是CpG島高甲基化導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活。近些年，畜禽重要經(jīng)濟(jì)性狀的DNA甲基化已經(jīng)成為表觀基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一。差異甲基化區(qū)域(differential methylation region，DMR)是指在不同組織類型或疾病狀態(tài)下的細(xì)胞水平上發(fā)生的差異甲基化區(qū)域。2019年，Wang等解析了PolyI:C結(jié)合Aza-CdR共同轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞的甲基化圖譜，定量分析DMR和甲基化標(biāo)記，揭示病毒模擬物Poly I:C對(duì)甲基化抑制劑Aza-CdR具有潛在的抑制作用，這些結(jié)果將提高人類對(duì)哺乳動(dòng)物疾病的了解和診斷具有重要的實(shí)用價(jià)值。全基因組DNA甲基化圖譜通過(guò)分析試驗(yàn)組與對(duì)照組的DMR，以尋找重要的表觀遺傳標(biāo)記(epigenetic marker)，這將有助于了解正常和疾病狀態(tài)下不同基因相互作用的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，不僅可為病毒感染、腫瘤和糖尿病等復(fù)雜疾病的深入研究提供新的理論依據(jù)，還可為環(huán)境因素、營(yíng)養(yǎng)和衰老等研究提供新的方法。

DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮脫氧胞苷[5-aza-2′-deoxycytidine(脫氧胞核嘧啶)，Aza-CdR]，具有很強(qiáng)的甲基化抑制作用，在細(xì)胞培養(yǎng)中可以介導(dǎo)細(xì)胞分化和基因表達(dá)。含Aza-CdR的DNA與甲基化酶形成的穩(wěn)定共價(jià)復(fù)合體使甲基基團(tuán)不能轉(zhuǎn)移到胞嘧啶，導(dǎo)致DNA甲基化反應(yīng)受阻，從而使基因組甲基化水平降低。有研究表明，Aza-CdR會(huì)抑制DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，還可能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)基因表達(dá)變化、細(xì)胞程序性死亡等，也可以抑制病毒RNA成熟所需要的甲基化反應(yīng)。Aza-CdR常用于兩個(gè)領(lǐng)域：1)在DNA甲基化抑制基因表達(dá)的生物功能試驗(yàn)中做驗(yàn)證對(duì)照，進(jìn)而深入挖掘DNA甲基化標(biāo)記；2)用于治療某些特異的腫瘤。2019年，Chen等利用5-Aza-CdR抑制DNMT1表達(dá)，增加腸癌細(xì)胞凋亡的速率。2015年，Roulois等證明低劑量5-Aza-CdR可通過(guò)誘導(dǎo)病毒模擬物靶向應(yīng)對(duì)結(jié)直腸癌啟動(dòng)細(xì)胞(CICs)，這與部分源自內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒元件的dsRNA誘導(dǎo)、MDA5/MAVS RNA識(shí)別通路的激活以及IRF7的下游激活有關(guān)。2009年，Koga等利用MeDIP-chip方法鑒定5個(gè)新的人類黑色素瘤甲基化標(biāo)記，并結(jié)合Aza-CdR進(jìn)行驗(yàn)證。基于此，本研究利用Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬腎上皮細(xì)胞系PK15，模擬dsRNA病毒的感染及抗病毒作用。通過(guò)與非轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比，分析豬腎細(xì)胞全基因組差異甲基化基因并篩選抗病毒相關(guān)通路，為腎感染的病毒性疾病研究提供分子依據(jù)，進(jìn)而揭示 Aza-CdR 和 dsRNA 對(duì)豬腎細(xì)胞的甲基化效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用細(xì)胞及 MeDIP-chip 芯片設(shè)計(jì)

以豬腎上皮細(xì)胞系PK15(購(gòu)自中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心，細(xì)胞編號(hào)：3115CNCB00260)為試驗(yàn)材料，10%熱滅活胎牛血清、100單位·mL青鏈霉素37 ℃、5% CO條件下培養(yǎng)(具體培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[4])。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，饑餓培養(yǎng)2 h， 以達(dá)到細(xì)胞平衡狀態(tài)。使用Poly I:C(P)和Aza-CdR(A)轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，收集處理的細(xì)胞，進(jìn)行DNA甲基化芯片檢測(cè)和分析。共3組細(xì)胞：1)Mock 細(xì)胞(C組)；2)10 μg·mLPolyI:C轉(zhuǎn)染10 h的PK15細(xì)胞(P組)；3)5 μmol·LAza-CdR轉(zhuǎn)染6 h的PK15細(xì)胞(A組)。細(xì)胞的時(shí)間和劑量依賴試驗(yàn)結(jié)果見參考文獻(xiàn)[18]。每組3個(gè)重復(fù)，共計(jì)9個(gè)樣本，用于MeDIP-chip芯片檢測(cè)。9張芯片來(lái)源于Nimbgen公司設(shè)計(jì)的Pig 385 K CpG Island plus Ensembl Promoter Array Methylation Chip，最終完成本試驗(yàn)豬DNA甲基化差異區(qū)域的注釋。

1.2 PK15細(xì)胞DNA的抽提

使用Wizard基因組DNA純化試劑盒(Promega)提取細(xì)胞基因組DNA。利用NanoDropND-2000c分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度后，再使用EZ DNA甲基化金標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(Zymo Research)對(duì)每個(gè)樣本1 μg基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。用20 μL緩沖液洗脫轉(zhuǎn)化的DNA用于免疫共沉淀。

1.3 DNA免疫共沉淀和芯片雜交

基因組DNA 經(jīng)超聲波破碎后，樣本用于免疫共沉淀試驗(yàn)。每個(gè)樣本的免疫共沉淀處理分為3份，第1份是Input DNA，第2份是 MeDIP DNA，第3份是 Mock IP DNA。分別對(duì)9張 MeDIP 芯片進(jìn)行qPCR 質(zhì)檢。1)Input 試驗(yàn)：加入0.4 μg樣本基因組DNA，不加任何抗體；2)MeDIP 試驗(yàn)：加入2 μg 樣本基因組DNA 和5 μg樣本甲基化DNA抗體(抗體來(lái)源于豬 Anti-5-methylcytidine antibody，Diagenode)；3)Mock 試驗(yàn)：加入5 μg的小鼠IgG和2 μg的樣本DNA(小鼠IgG不能和樣本DNA 發(fā)生作用)。MeDIP DNA 和Input DNA 分別用Cy 5和 Cy 3標(biāo)記，檢測(cè)合格后,與豬385 K全基因組CpG島(CGI)和啟動(dòng)子芯片進(jìn)行雜交。

1.4 原始數(shù)據(jù)校正

免疫共沉淀的樣本經(jīng)芯片雜交后得到原始數(shù)據(jù)(raw data)，原始數(shù)據(jù)包括每個(gè)探針的熒光信號(hào)強(qiáng)度，這些數(shù)據(jù)以log(MeDIP / Input)(即 logratio)及value來(lái)表示。logratio即 MeDIP DNA 的熒光信號(hào)和 Input DNA的熒光信號(hào)比值的對(duì)數(shù)值。為了避免技術(shù)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，以便更真實(shí)地反映樣品間DNA甲基化的差異，試驗(yàn)對(duì)芯片得到的原始logratio進(jìn)行校正。利用中位數(shù)中心和分位數(shù)校正(median-centering and quantile normalization)方法對(duì)試驗(yàn)組中每個(gè)樣品的logratio 值進(jìn)行校正，經(jīng)過(guò)校正后所有芯片數(shù)據(jù)的中值都在0左右，并且樣本間在上下區(qū)間的分布也趨于相似，表明數(shù)據(jù)可用于后續(xù)分析。

1.5 芯片數(shù)據(jù)分析

由NimbleScan v2.6(Roche NimbleGen，05933315001)計(jì)算logratio值。logratio值代表每個(gè)探針在MeDIP DNA和Input DNA中的富集強(qiáng)度，值代表每個(gè)探針的紅綠信號(hào)差異是由非生物因素造成的概率，值由修正的KS檢驗(yàn)算法計(jì)算。值越低，表示探針越有可能代表一個(gè)甲基化事件，進(jìn)而找到富集的甲基化峰(enrichment peaks，EPs)。Peaks代表可能的DNA甲基化區(qū)域，由專業(yè)商用軟件SignalMapv1.9(Roche NimbleGen，05225051001)計(jì)算。

1.6 差異甲基化區(qū)域計(jì)算

多樣本之間甲基化區(qū)域的比較由差異甲基化峰(differential enrichment peaks，DEPs)表示，通過(guò)兩兩組別之間的差異值logratio 計(jì)算M值，M值(也稱作Peak DM value值)是指組間的差異甲基化峰值(DEPs)，可代表兩組之間的差異甲基化區(qū)域(DMR)。計(jì)算方法：M=Average(logMeDIP E / Input E)- Average(logMeDIP C / Input C),其中，E代表試驗(yàn)組，C代表對(duì)照組。根據(jù)NimbleScan Algorithm判定DEPs時(shí)有兩個(gè)條件：1)兩組中至少有一組log(MeDIP / Input) > 0.3 和M > 0；2)在一個(gè)Peak 中，兩組中至少有一半的探針變異系數(shù)(coefficient variability，CV)≤0.8。本研究分析了PolyI:C. Control(P. C)和Aza-CdR. Control(A. C)兩個(gè)比較組間的差異甲基化區(qū)域分布特征。

1.7 DNA bisulfite PCR 和 Bisifite clone sequencing

應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)目的基因和持家基因引物，使用Zymo Premix啟動(dòng)PCR熱循環(huán)。PCR熱循環(huán)條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，40～45循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物用于后續(xù)測(cè)序試驗(yàn)。Bisifite clone sequencing前試驗(yàn)主要包括PCR產(chǎn)物切膠回收，感受態(tài)細(xì)胞制備(CaCl法)，載體連接反應(yīng)，質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化。PCR產(chǎn)物克隆至pGM-T載體，使用ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀完成測(cè)序反應(yīng)。挑取8～10個(gè)克隆用于Bisulfite克隆測(cè)序分析。

2 結(jié) 果

2.1 Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的全基因組差異甲基化峰分布

試驗(yàn)分析了兩個(gè)比較組P. C和A. C基因間區(qū)域(intergenic)、基因內(nèi)區(qū)域(introgenic)和啟動(dòng)子區(qū)(promoter)3個(gè)區(qū)域的差異甲基化峰(DEPs)分布。正常的豬腎上皮細(xì)胞在全基因組區(qū)域(intergenic、introgenic、promoter)均有DEPs分布，而Poly I:C(圖1A)和Aza-CdR(圖1B)分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞的DEPs則主要在高密度CpG含量啟動(dòng)子(high-CpG-containing promoters，HCPs)增加顯著，中等密度CpG含量啟動(dòng)子(inter mediate-CpG-containing promoters，ICPs)和低密度CpG含量啟動(dòng)子(low-CpG-containing promoters，LCPs)并沒有顯著增加。結(jié)果說(shuō)明，兩種化學(xué)物質(zhì)處理細(xì)胞后，DNA甲基化的變化主要發(fā)生在啟動(dòng)子位置，特別是與啟動(dòng)子甲基化的密度相關(guān)聯(lián)。

為更進(jìn)一步確認(rèn)富集的差異甲基化峰(DEPs)在全基因組的分布，試驗(yàn)將DEPs分為上調(diào)的甲基化峰和下調(diào)的甲基化峰。若差異探針分布在Poly I:C處理組(或Aza-CdR組)中而不分布在Control對(duì)照組中，則為上調(diào)的甲基化峰；若差異探針分布在Control對(duì)照組中而不分布在Poly I:C處理組(或Aza-CdR組)中，則為下調(diào)的甲基化峰。在兩個(gè)比較組P. C和A. C中，高密度CpG島啟動(dòng)子(HCPs)下調(diào)的DEPs 較多，分別為394個(gè)下調(diào)DEPs(81%，92個(gè)上調(diào)DEPs，圖1C)和223個(gè)下調(diào)DEPs(54%，190個(gè)上調(diào)，圖1D)，初步推斷Poly I:C和Aza-CdR對(duì)豬PK5細(xì)胞均具有去甲基化作用，而這一現(xiàn)象在ICPs和LCPs中并沒有被發(fā)現(xiàn)。

A. Poly I:C轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞的差異甲基化峰(DEPs)數(shù);B. Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞的DEPs數(shù)；C. Poly I:C轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞的DEPs分布;D. Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞的DEPs分布A. The number of differential methylation peaks (DEPs) of Poly I: C transfected porcine PK15 cells; B. The number of DEPs of porcine PK15 cells transfected with Aza-CdR; C. DEPs distribution of Poly I: C transfected porcine PK15 cells; D. DEPs in porcine PK15 cells transfected with Aza-CdR圖1 Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞的全基因組差異甲基化峰分布Fig.1 Genome differential methylation peaks in PK15 cells transfected with Poly I:C and Aza-CdR

2.2 Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的染色體差異甲基化峰分布

為進(jìn)一步研究染色體上不同密度的CpG島及甲基化峰在染色體上的分布情況，試驗(yàn)分析了甲基化峰值Peak DM value與染色體的關(guān)系。利用R軟件繪制箱型圖，結(jié)果如圖2所示，橫軸代表不同的染色體，縱軸代表不同染色體上富集的差異甲基化峰值。結(jié)果說(shuō)明，不同染色體上甲基化水平不同。當(dāng)Poly I:C轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞后，染色體水平上甲基化峰值均<0.5(圖2A)；當(dāng)Aza-CdR轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，染色體水平上甲基化峰值在0.5左右波動(dòng)(圖2B)。結(jié)果證明，Poly I:C可能具有去甲基化作用，而Aza-CdR除了具有去甲基化作用，對(duì)某些區(qū)域也會(huì)上調(diào)甲基化，如1、10、11和18號(hào)染色體區(qū)域Peak DM value值(即M值)分別為0.52、0.58、0.57和0.56(圖2B)。

圖2 Poly I:C(A)和Aza-CdR(B)轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的染色體差異甲基化峰分布Fig.2 Chromosome differential methylation peaks in PK15 cells transfected with Poly I:C (A) and Aza-CdR(B)

2.3 Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的啟動(dòng)子差異甲基化峰分布

將啟動(dòng)子-1 500—+500 bp區(qū)劃分為3個(gè)區(qū)域：-1 500—-500 bp(遠(yuǎn)端啟動(dòng)子，distal promoter)，-500—-200 bp(中端啟動(dòng)子，middle promoter)和-200—+500 bp(近端啟動(dòng)子和第一外顯子，proximal promoter and first exson)。結(jié)果揭示，在P. C和A. C兩個(gè)比較組中，-200—+500 bp區(qū)域中的甲基化陽(yáng)性富集峰最多(綠色)，其次為-500—-200 bp區(qū)域(紅色)，最后為-1 500 —-500 bp(藍(lán)色)(圖3)。結(jié)果表明，Poly I:C和Aza-CdR具有比較相似的啟動(dòng)子甲基化分布特征。

圖3 Poly I:C(A)和Aza-CdR(B)轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的啟動(dòng)子差異甲基化峰分布Fig.3 Promoter differential methylation peaks in PK15 cells transfected with Poly I:C (A) and Aza-CdR (B)

在差異甲基化區(qū)域DMR中，Peaks內(nèi)探針的平均-lg(值)反映了陽(yáng)性富集的可能性大小(即Peak Score，Cut off = 2，值<0.01)。若Peak Score ≥ 2，則這個(gè)Peak極顯著代了一個(gè)甲基化事件。發(fā)現(xiàn)甲基化的富集程度在Poly I:C和Aza-CdR對(duì)Control組中的-200—+200 bp 區(qū)域富集程度較高[圖4，- lg (值) ≥ 2,<0.01]。試驗(yàn)用3種不同顏色的線代表-800—+200 bp區(qū)域差異表達(dá)基因3種不同的表達(dá)水平，綠色線代表表達(dá)量最低(1 st)，紅色線代表表達(dá)量最高(3rd)。通過(guò)與表達(dá)譜差異基因的結(jié)合分析，如圖4 所示，在-200—+200 bp的近端啟動(dòng)子及第一外顯子區(qū)域，甲基化富集水平(代表甲基化程度)與差異基因的表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖4箭頭所示)。結(jié)果表明，PK15細(xì)胞的DNA甲基化影響基因表達(dá)與甲基化修飾的位置相關(guān)。在0—+ 200 bp(P. C和A. C，圖4A和4B黑色箭頭所示)區(qū)域和-800—-600 bp (A. C，圖4B紅色箭頭所示)區(qū)域內(nèi)基因表達(dá)受DNA甲基化調(diào)控，即甲基化富集程度越高表達(dá)量越低；而在-600—0 bp區(qū)域，DNA甲基化不調(diào)控基因表達(dá)。

A. Poly I:C轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞;B. Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15 細(xì)胞A. Poly I: C transfected porcine PK15 cells; B. PK15 cells transfected with Aza-CdR圖4 啟動(dòng)子差異甲基化峰的分布及其與表達(dá)的關(guān)系Fig.4 Promoter methylation peaks amd its relationship with gene expression

圖5結(jié)果顯示了差異甲基化峰在染色體上的富集情況[- lg (值)≥2,<0.01]。Poly I:C處理細(xì)胞的啟動(dòng)子中等密度的ICPs主要富集在9號(hào)和17號(hào)染色體上，而HCP和LCP富集程度較一致(圖5A)；Aza-CdR處理細(xì)胞的啟動(dòng)子CpG島密度與染色體分布無(wú)明顯的相關(guān)性(圖5B)。

圖5 Poly I:C(A)和Aza-CdR(B)轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的染色體上啟動(dòng)子差異甲基化峰分布Fig.5 Chromosome promoter differential methylation peaks in PK15 transfected withPoly I:C (A) and Aza-CdR (B)

2.4 Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的全基因組差異甲基化基因GO分析

和表達(dá)譜分析一樣，本研究對(duì)差異甲基化基因進(jìn)行功能分類，利用Gene Ontology(GO)注釋結(jié)合fisher’s exact test(值<0.05)檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。如圖6所示，這些在P. C比較組中上調(diào)和下調(diào)的差異甲基化基因都有各自獨(dú)特的富集GO terms，基于<0.05 的條件下，結(jié)果揭示Poly I:C 主要參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控、細(xì)胞成分組成及發(fā)育過(guò)程等，其中，富集程度最高的基因參與了巨噬細(xì)胞分化的調(diào)控(圖6A)；Aza-CdR 主要參與調(diào)控Rho信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、對(duì)病毒響應(yīng)的防御、調(diào)控器官生長(zhǎng)等(圖6B)。

圖6 Poly I:C(A)和Aza-CdR(B)轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的差異甲基化基因GO分析Fig.6 GO analysis of differential methylation genes in PK15 cells transfected with Poly I:C (A) and Aza-CdR (B)

2.5 篩選Poly I:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞的啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域DMR

分析P. C(表1)和A. C(表2)比較組中的差異甲基化基因發(fā)現(xiàn)，Poly I:C轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma(PPARG)、Follistatin(FST)等基因啟動(dòng)子甲基化下調(diào)，主要參與細(xì)胞分化、發(fā)育的調(diào)控。Aza-CdR除了具有調(diào)節(jié) DNA 甲基化的修飾作用外，它還具有調(diào)控其他表觀遺傳修飾、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及參與機(jī)體免疫反應(yīng)的作用，例如DFP3在調(diào)控心肌細(xì)胞發(fā)育方面發(fā)揮作用、BNIP3L參與病毒的繁殖等過(guò)程，這些基因的復(fù)雜調(diào)控可通過(guò)調(diào)節(jié)DNA 的甲基化來(lái)抑制或增強(qiáng)基因表達(dá)。為了明確差異甲基化區(qū)域DMR，試驗(yàn)選擇BCL2/腺病毒E1B相互作用蛋白3樣基因(BNIP3L，BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3-like)進(jìn)行比對(duì)，利用NimbleGen公司的Signalmap軟件分析基因啟動(dòng)子區(qū)富集的差異甲基化峰，結(jié)果顯示，在14號(hào)染色體的10459946—10460615 bp區(qū)段共有669 bp Peak Length CG位點(diǎn)發(fā)生去甲基化(圖7)。

表1 Poly I:C處理豬PK5細(xì)胞后啟動(dòng)子差異甲基化基因

表2 Aza-CdR處理豬PK5細(xì)胞后啟動(dòng)子差異甲基化基因

圖7 豬BNIP3L基因的啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域DMRFig.7 Promoter differential methylation region of porcine BNIP3L gene

2.6 驗(yàn)證PolyI:C和Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬PK15 BNIP3L基因啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域DMR

為了獲得更精確的3L啟動(dòng)子甲基化差異信息，使用高敏感的bisulfite測(cè)序方法測(cè)定3L基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異變化，檢測(cè)上述區(qū)域20個(gè)CpG位點(diǎn)(Chr14: 10459946—10460615 bp)。與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(DNA甲基化程度為93.8%)相比，Poly I:C處理的DNA甲基化水平顯著降低至35.0 %，Aza-CdR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞DNA甲基化程度降低至26.3%(圖8A)。

A. BNIP3L基因啟動(dòng)子甲基化克隆測(cè)序分析；B. BNIP3L基因mRNA表達(dá)量分析A. Clone-sequencing of BNIP3L gene promoter; B. mRNA expression level of BNIP3L gene圖8 豬BNIP3L基因的啟動(dòng)子差異甲基化區(qū)域DMR的驗(yàn)證Fig.8 Validation of promoter differential methylation region of porcine BNIP3L gene

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PolyI:C通過(guò)去甲基化機(jī)制啟動(dòng)3L基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，試驗(yàn)引入甲基化抑制劑Aza-CdR分析去甲基化與轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)系。試驗(yàn)使用0.1、1.0、5.0 μmol·LAza-CdR處理細(xì)胞，同時(shí)在10.0 μg·mLPolyI:C轉(zhuǎn)染4 h后再使用Aza-CdR不同濃度處理細(xì)胞6 h，分析3L基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.1、1.0、5.0 μmol·LAza-CdR和10.0 μg·mLPoly I:C單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí)均顯著表達(dá)BNIP3L基因(<0.05)(圖8B)。然而，5.0 μmol·LAza-CdR 單獨(dú)處理細(xì)胞時(shí)，與未處理的細(xì)胞相比，BNIP3L差異表達(dá)2倍以上，并達(dá)到及其差異顯著水平(<0.01)。

3 討 論

本研究首次在全基因組范圍研究豬腎細(xì)胞的 DNA 甲基化圖譜的試驗(yàn)，獲得了 3組樣本(Control細(xì)胞，Poly I:C轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Aza-CdR轉(zhuǎn)染細(xì)胞)所有特有的全基因組甲基化分布特點(diǎn)。豬腎細(xì)胞全基因組DNA甲基化主要分布于5′調(diào)控區(qū)域。試驗(yàn)在組間比較后，特別是在P. C和A. C比較中發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在 基因組上的分布特征與CpG島密度與距離TSS的位置有關(guān)。Poly I:C對(duì)PK15作用使得TSS附近200 bp(-200—+500 bp 處，即近啟動(dòng)子區(qū)和第一外顯子區(qū))低甲基化啟動(dòng)子增多(圖3)，可能這種低甲基化模式更利于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合進(jìn)而起始轉(zhuǎn)錄。Tang等報(bào)道dsRNA轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞(HEK293T)和人肺上皮細(xì)胞(A549)后激活I(lǐng)L6啟動(dòng)子，增加IL6轉(zhuǎn)錄表達(dá)。該研究同時(shí)使用DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2′-deoxycytidine處理細(xì)胞作為對(duì)照，IL6表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果表明dsRNA通過(guò)抑制DNMT活性從而誘導(dǎo)啟動(dòng)子去甲基化激活I(lǐng)L6表達(dá)，發(fā)揮抗流感病毒的作用。Li等研究發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染的細(xì)胞中，病毒中間產(chǎn)物dsRNA使得IL32啟動(dòng)子去甲基化增加轉(zhuǎn)錄因子CREB對(duì)IL32的結(jié)合上調(diào)其表達(dá)，證明dsRNA具有抑制DNMT1活性作用。通過(guò)抑制IL32的6個(gè)亞型均在病毒感染的細(xì)胞中阻礙病毒復(fù)制，特別是IL32-γ具有較強(qiáng)的抗病毒活性。Wu等使用深度測(cè)序技術(shù)對(duì)Poly I:C刺激和PRRSV感染的豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)錄組分析，以比較先天免疫激活和失活狀態(tài)下的不同miRNA譜。測(cè)序后，在PAMs中觀察到267個(gè)已知成熟miRNAs和64個(gè)新miRNAs，與模擬對(duì)照細(xì)胞相比，共197個(gè)miRNAs在Poly I:C刺激的PAMs中表達(dá)顯著不同。Tran-Thi等研究了豬衛(wèi)星細(xì)胞(PSCs)在骨骼肌的構(gòu)建、發(fā)育和自我更新中起著重要的作用。Poly I:C在刺激PSCs后0、12、24和48 h可模擬病毒感染的增殖和分化。

早在1980年，Jones和Taylor就已發(fā)現(xiàn)5-氮雜胞苷(5-azacytidine)可以抑制活體細(xì)胞DNA甲基化，使DNA甲基化對(duì)自然狀態(tài)的基因組DNA影響的研究成為可能。前期研究通過(guò)引入Aza-CdR研究病毒類似物dsRNA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞后對(duì)全基因組表達(dá)的影響，結(jié)果揭示，Aza-CdR可逆轉(zhuǎn)基因表達(dá)，這與基因的甲基化狀態(tài)密切相關(guān)。Venolia等早在1982年用5-azacytidine處理過(guò)細(xì)胞DNA轉(zhuǎn)染其他細(xì)胞時(shí)，失活X染色體相關(guān)的次黃嘌呤酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因得到表達(dá)，而對(duì)照的沒有用5-azacytidine處理過(guò)的細(xì)胞 DNA 不能使該基因表達(dá)。另外，Aza-CdR對(duì)細(xì)胞的多樣效應(yīng)(主要包括DNA去甲基化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng))具有細(xì)胞依賴以及時(shí)間劑量處理性特點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用。因此，在使用時(shí)要慎重考慮其特征。

前期研究利用Agilent豬4 × 44 K全基因組表達(dá)譜芯片分析了Poly I:C和Aza-CdR單獨(dú)處理組(P. C和A. C)的差異表達(dá)基因的變化，在兩個(gè)比較組中均篩選出與免疫反應(yīng)、細(xì)胞發(fā)育分化及細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路，這些通路中基因的表達(dá)差異可能與DNA甲基化的調(diào)控密切相關(guān)。與此同時(shí)，研究利用豬385 K MeDIP-chip芯片技術(shù)篩選得到DGAT、FST、BNIP3L、DPF3等與細(xì)胞發(fā)育分化、病毒復(fù)制、炎癥反應(yīng)相關(guān)的重要甲基化調(diào)控基因。這些結(jié)果揭示，Poly I:C和Aza-CdR對(duì)PK15細(xì)胞的去甲基化作用可調(diào)控免疫相關(guān)的信號(hào)通路。結(jié)合甲基化芯片與表達(dá)譜芯片研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Aza-CdR具有負(fù)向調(diào)控病毒繁殖的功能，并且可減弱PolyI:C對(duì)細(xì)胞的反應(yīng)。最近的研究證實(shí)，Lnc-Dpf3的新型長(zhǎng)鏈非編碼RNA可通過(guò)抑制樹突狀細(xì)胞體內(nèi)遷移進(jìn)而抑制炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。BNIP3L的過(guò)表達(dá)可挽救線粒體自噬缺陷并對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用。本研究也篩選到這兩個(gè)關(guān)鍵基因，抗病毒相關(guān)基因3L 和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因3，以期作為候選甲基化差異基因用于今后的驗(yàn)證試驗(yàn)，這些系統(tǒng)的分析將有利于理解病毒感染豬宿主細(xì)胞的免疫反應(yīng)分子機(jī)理，為豬和其傳染性病毒的互作提供遺傳基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

目前，使用Aza-CdR轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞的全基因組甲基化圖譜仍未研究，本試驗(yàn)首次比較研究了Aza-CdR和dsRNA對(duì)豬腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的甲基化效應(yīng)。試驗(yàn)初步揭示，Poly I:C與Aza-CdR的作用相似具有去甲基化作用，這與最近的一些報(bào)道相一致。Aza-CdR和dsRNA并不是對(duì)豬所有基因具有去甲基化作用，主要針對(duì)特有基因的特有啟動(dòng)子，譬如在與病毒復(fù)制有關(guān)基因3L 和炎癥反應(yīng)相關(guān)基因3的啟動(dòng)子區(qū)域中，這些特有啟動(dòng)子的CpG島對(duì)Aza-CdR和dsRNA具有特別的敏感性。