李 楊，周 棟，尹彥龍，張廣凍，相彩霞，支飛杰，白芙蓉，林鵬飛，靳亞平，王愛華

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室，楊凌 712100)

布魯氏菌()引起的布魯氏菌病(簡稱布病)作為一種嚴重的人畜共患病流行于世界170多 個國家和地區(qū)，造成每年約50萬人感染。近年來，我國由于養(yǎng)殖量的快速提升和動物及其產(chǎn)品流動性的增加，布病已經(jīng)擴散至全國各個省區(qū)，牛羊布病防控形勢嚴峻。因此，全面闡明布魯氏菌的病原特點、揭示其免疫逃逸、毒力調(diào)控機制等致病機理，探尋新的、有效的治療靶點，成為布病防控亟待解決的關(guān)鍵和該領(lǐng)域研究的核心。

細胞凋亡是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞程序性死亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)是誘導細胞凋亡的主要通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激能增強非折疊蛋白反應，在蛋白糖基化作用和專有伴侶分子(binding immunoglobulin protein, BiP; also known as GRP78)的輔助下，維持細胞穩(wěn)態(tài)；但強烈或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，細胞無法維持穩(wěn)態(tài)，將引起C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達與活化，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡發(fā)生。布魯氏菌在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能夠激活適度的ER Stress，抑制CHOP誘導的細胞凋亡，確保自身在胞內(nèi)的生存與增殖。

外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)是布魯氏菌細胞壁的主要組成成分，具有較強的免疫原性和保護性，在維持菌體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、營養(yǎng)攝取、激活宿主免疫應答中發(fā)揮重要作用，影響細菌毒力。OMP16在不同布魯氏菌菌株中高度保守，能被免疫系統(tǒng)模式受體識別，作為自佐劑疫苗和病原檢測靶點已被廣泛研究；本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，布魯氏菌缺失16基因菌體致死，低表達16降低布魯氏菌在巨噬細胞及小鼠體內(nèi)的存活，改變機體免疫因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達，但OMP16蛋白對巨噬細胞凋亡及免疫活性的調(diào)控研究仍未闡明。本試驗利用OMP16處理RAW264.7細胞為模型，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的標志性因子GRP78和CHOP的表達、細胞凋亡及細胞上清液中免疫因子的變化，為深入研究宿主細胞與布魯氏菌感染互作關(guān)系提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系與菌株

小鼠RAW264.7巨噬細胞系由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物生物技術(shù)重點實驗室保存。RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱中，細胞長至70%～80%時傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.2 材料和儀器

DMEM細胞培養(yǎng)基購于Hyclone公司；MTT試劑購于Sigma公司；凱基全蛋白提取試劑盒，凱基BCA蛋白測定試劑盒，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒均購于凱基生物公司；抗Caspase-3標簽抗體購于Abcam公司；抗GRP78標簽抗體，抗CHOP標簽抗體購于SANTA公司；PrimeScriptRT reagent ki、RNAiso Plus和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

離心機購于德國Eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購于美國BioRAD公司。

1.3 OMP16蛋白表達與純化

按照實驗室建立的OMP16原核表達純化方法，表達純化OMP16蛋白。pET-32a-OMP32重組質(zhì)粒測序驗證后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，1 mmol·LIPTG，30 ℃誘導表達12 h，收集菌體后超聲破碎，SDS-PAGE檢測蛋白表達形式，按Ni-NAT說明書步驟純化并收集蛋白，PBS透析，TritonX-114去除內(nèi)毒素，BCA法檢測蛋白濃度后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MTT試驗

將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)期的RAW264.7細胞，按照2×10個細胞·孔接種于96孔板，細胞融合80%時，將OMP16蛋白按用0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 μg·mL的濃度梯度添加于培養(yǎng)液中；24 h后添加MTT試劑，20 μL·孔，37 ℃ 培養(yǎng)4 h后，加入150 μL DMSO試劑，充分輕搖混勻，于490 nm處測量吸光值。

1.5 Hoechst 試驗

將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)期的RAW264.7細胞，按照5×10個細胞·孔均勻接種于48孔板，置于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜；OMP16蛋白按照設(shè)置的濃度梯度添加入48孔板內(nèi)，24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.5 mL固定液固定10 min， 洗滌后，每孔0.5 mL細胞染色液，避光放置于4 ℃冰箱20～30 min；洗滌后，使用熒光倒置顯微鏡檢測。

1.6 免疫熒光試驗

將RAW264.7細胞接種于事先在孔底放有圓形爬片的24孔板中，置于37 ℃、5% CO飽和濕度條件培養(yǎng)過夜；加入OMP16蛋白作用36 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，4% 多聚甲醛固定細胞爬片30 min，PBS洗滌3次；加入0.5%Triton-100，室溫透膜20 min，PBS洗滌3次；5%牛血清白蛋白，室溫封閉1 h；孵育1∶100稀釋的Caspase-3抗體，4 ℃ 過夜，PBS洗滌3次；室溫避光孵育1∶2 000稀釋的GFP標記抗兔熒光二抗1 h，洗滌3次；滴加DAPI染核，避光孵育15 min，PBS洗滌3次；用中性樹脂封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.7 Western blot檢測

利用RIPA裂解液提取OMP16刺激的RAW264.7細胞總蛋白，BCA蛋白含量檢測試劑盒測定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE跑膠分離后，60 V恒壓濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，1∶200 稀釋的Caspase-3抗體和1∶2 000稀釋的β-actin 抗體4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次，1∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記抗兔二抗，室溫孵育1 h， 使用凝膠成像系統(tǒng)曝光檢測。使用Image J 軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與β-actin灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達水平。

1.8 熒光定量PCR檢測

利用Trizol裂解液提取OMP16刺激的RAW264.7細胞總RNA，測定濃度后，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA合成cDNA。根據(jù)GenBank中山羊78(NM_001163434.1)及P(NM_007837.3)的序列號設(shè)計引物，78-F(5′-AGAAACTCCGGCGTGAGGTAGA-3′)、78-R(5′-TTCCTGGACAGGCTTCATGGTA-3′)以及-F(5′-AGCTGGAAGCCTGGTATGAGGA-3′)、-R(5′-AGCTAGGGACGCA-GGGTCAA-3′)以及內(nèi)參序列-F(5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′)、-R(5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′)。以cDNA為模板，參照TaKaRa公司的PrimeScriptRT reagent Kit說明書，進行定量PCR反應體系配制：SYBRPremix Ex TaqII 10 μL, DNAase/RNase-free水 6.8 μL，cDNA1.6 μL，PCR Forward Primer (10 μmol·L) 0.8 μL，PCR Reverse Primer (10 μmol·L) 0.8 μL，總體積20 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個 循環(huán)，72 ℃3 min。以為內(nèi)參，采用2-△△計算78和的轉(zhuǎn)錄情況。

1.9 流式細胞術(shù)檢測

取生長良好的RAW264.7細胞均勻鋪板在六孔板內(nèi)，設(shè)置對照組及OMP16刺激組，收集數(shù)量為1×10左右的細胞，PBS洗滌后加入200 μL Binding Buffer重懸細胞；加入10 μL Annexin V-FITC混勻，避光室溫條件下反應15 min；加入300 μL Binding Buffer及5 μL PI，1 h之內(nèi)用流式細胞儀檢測。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié) 果

2.1 OMP16最佳作用濃度及時間篩選

RAW264.7細胞與0.1、1、10、50、100 μg·mL的濃度的OMP16作用24 h后，通過MTT與Hoechst方法確定OMP16作用的最佳濃度(圖1、2)。

*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001圖1 MTT法篩選OMP16作用于RAW264.7細胞最佳濃度Fig.1 The optimal concentration of OMP16 on RAW264.7 screened by MTT assay

圖1顯示，當OMP16濃度達到10 μg·mL時，顯著影響細胞活性(<0.05)，當濃度達到100 μg·mL時，OMP16極顯著影響細胞活性(<0.001)。 0.1及1 μg·mLOMP16刺激后，細胞凋亡較少(圖2)，50 μg·mLOMP16處理后細胞開始大量凋亡，直至100 μg·mLOMP16處理時細胞已全部凋亡，10 μg·mLOMP16刺激可引起部分細胞凋亡。綜上，確定10 μg·mL為OMP16作用于RAW264.7細胞的最佳濃度。

圖2 Hoechst法篩選OMP16作用于RAW264.7細胞最佳濃度Fig.2 The optimal concentration of OMP16 on RAW264.7 screened by Hoechst assay

根據(jù)上述確定的濃度10 μg·mL，設(shè)計6個時間點，設(shè)置空白對照組及OMP16刺激組，分別將稀釋好的10 μg·mLOMP16培養(yǎng)液添加到RAW264.7細胞培養(yǎng)孔，作用相應時間后采用MTT法確定最佳作用時間點，如圖3所示，可以看出OMP16明顯抑制RAW264.7細胞的生長；在24～36 h， OMP16處理的RAW264.7細胞與正常組細胞生長差異極顯著(<0.001)。綜上，確定36 h 為OMP16作用于RAW264.7細胞的最佳時間。

***.P<0.001圖3 MTT法篩選OMP16作用于RAW264.7細胞最佳時間Fig.3 The optimal action time of OMP16 on RAW264.7 by MTT assay

2.2 OMP16對RAW264.7細胞凋亡的影響

為確定OMP16對細胞凋亡通路的影響，采用免疫熒光法及Western blot檢測Caspase-3蛋白的表達。如圖4 A圖所示，OMP16處理后Caspase-3的總量顯著增多；如圖4 B圖所示，與對照組相比，OMP16組Caspase-3/β-actin比值極顯著升高(<0.001)。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，OMP16能引起RAW264.7細胞顯著的早期凋亡與晚期凋亡(圖4 C，表1)。

A. 細胞爬片免疫熒光法；B. Western blot法(檢測Caspase-3,***.P<0.001); C. 流式細胞術(shù)A. Cell immunofluorescence assay; B. Western blot assay(detect Caspase-3,***.P<0.001); C. FCM assay圖4 OMP16對RAW264.7細胞凋亡的檢測Fig.4 The detection of apoptosis in RAW264.7 stimulated by OMP16

表1 流式細胞術(shù)凋亡率統(tǒng)計

2.3 OMP16 對RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

ER Stress是誘導細胞凋亡的重要通路。為了探討OMP16引起的RAW264.7細胞凋亡是否與ER Stress有關(guān)，Wsetern blot檢測了兩個ER Stress與凋亡相關(guān)蛋白GRP78與CHOP的表達。如圖5所示，OMP16處理極顯著的引起了CHOP表達的升高(<0.001)，GRP78的表達在24 h(<0.01) 和36 h(<0.001)同樣出現(xiàn)顯著的升高。

**.P<0.01; ***.P<0.001圖5 RAW264.7細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激主要因子檢測結(jié)果Fig.5 The results of ERS’ main factors in RAW264.7

2.4 OMP16對RAW264.7細胞免疫因子影響分析

為了探討OMP16對巨噬細胞RAW264.7細胞的免疫活性影響，作者檢測了對照組細胞與OMP16刺激組細胞-1β、-6、-α mRNA的轉(zhuǎn)錄情況，如圖6所示，-1β、-6、-α在OMP16刺激36 h后，轉(zhuǎn)錄量均顯著上升(<0.01，<0.01，<0.05)。

*.P<0.05; **.P<0.01圖6 RT-qPCR檢測RAW264.7細胞免疫因子轉(zhuǎn)錄情況Fig.6 The transcription of immune factors in RAW264.7 detected by RT-qPCR assay

3 討 論

布魯氏菌病是世界范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康、公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)健康發(fā)展的重大人畜共患病。由于布魯氏菌為胞內(nèi)感染菌，體液免疫和抗生素很難發(fā)揮作用，在人尚缺乏成功的疫苗，應用于家畜的疫苗對人畜均具有殘余毒力。因此，深入研究其毒力因子，揭示其致病機制對于創(chuàng)制新的疫苗和治療靶點均具有重要科學意義。

布魯氏菌在吞噬細胞內(nèi)長期存活是建立和維持慢性感染的基礎(chǔ)。抑制細胞凋亡是布魯氏菌逃避免疫反應并建立慢性感染的重要策略。布魯氏菌進化出許多特有的毒力因子或毒力系統(tǒng)，如脂多糖、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)及其效應因子VceC、BspC等，調(diào)控宿主細胞的凋亡及免疫應答。16基因是布魯氏菌存活的必需基因，OMP16蛋白位于布魯氏菌細胞膜的外側(cè)。前期研究表明，16基因在不同菌株中高度保守，降低OMP16的表達，能有效降低布魯氏菌在胞內(nèi)及小鼠體內(nèi)的存活。本研究發(fā)現(xiàn)OMP16感染能夠降低巨噬細胞的活性，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞各種蛋白合成、加工、運輸和分泌的主要場所，對維持細胞穩(wěn)態(tài)極為重要。當病原菌感染細胞，胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)不能及時得到恢復，就會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)促凋亡分子CHOP和Caspas-3的表達活化，進而導致細胞凋亡。粗糙型布魯氏菌能夠引發(fā)巨噬細胞線粒體膜通透性的改變促進凋亡，而光滑型布魯氏菌能夠抑制巨噬細胞的自發(fā)性凋亡。當光滑型布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)的增殖達到一定程度后，可以分裂成對巨噬細胞具有細胞毒性作用的粗糙型菌株進而促進布魯氏菌的擴散。而在此過程中，毒力因子發(fā)揮重要作用。效應蛋白BspJ作為核調(diào)節(jié)蛋白抑制巨噬細胞的凋亡，在小鼠模型中，VceC誘導胎盤滋養(yǎng)層細胞產(chǎn)生炎性因子，并導致宿主細胞的凋亡。而在山羊滋養(yǎng)層細胞中，VceC則通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路抑制CHOP引起的細胞凋亡。外膜蛋白OMP31則能抑制TNF-α誘導的巨噬細胞凋亡。本研究表明，OMP16能夠增強GRP78和CHOP的表達，促進巨噬細胞RAW264.7的凋亡。Caspase-3作為細胞凋亡中最主要的終末剪切酶，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。本試驗發(fā)現(xiàn)OMP16能夠引起巨噬細胞Caspase-3表達量顯著增多。不同布魯氏菌菌株以及不同毒力因子等引起的凋亡反應差異，可能是由于菌株致病機制差異以及感染細胞不同所引起。

布魯氏菌入侵機體后可引起促炎因子的表達釋放，感染初期的炎性反應能夠協(xié)助布魯氏菌實現(xiàn)免疫逃逸。在本研究中，OMP16誘導巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α。IL-1β是經(jīng)典的炎癥因子能夠趨化、激活中性粒細胞，過量表達能誘導巨噬細胞凋亡。研究表明,感染RAW 264.7細胞增加了IL-1β的表達和分泌。OMP25刺激巨噬細胞分泌大量IL-1β。IL-6具有功能二象性，并強烈參與抗炎和促炎功能。布魯氏菌及其外膜蛋白OMP10、OMP19、OMP25和OMP28顯著誘導巨噬細胞IL-6、TNF-α高水平表達。此外，流產(chǎn)通過IL-6減少宿主MHC-II和CIITA的表達。對細胞因子的調(diào)控，是布魯氏菌破宿主壞免疫監(jiān)視，造成持續(xù)性感染的策略之一，OMP16的發(fā)病機制有待更加深入是研究。

綜上所述，布魯氏菌OMP16能夠誘導RAW264.7凋亡，OMP16顯著引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的發(fā)生，CHOP作為連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與細胞凋亡的關(guān)鍵通路蛋白，其上調(diào)表達，可能是OMP16通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵分子與靶點，具體的機制需要進一步試驗驗證。

4 結(jié) 論

布魯氏菌OMP16激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，上調(diào)CHOP的表達，并誘導細胞凋亡。