范婷婷，王文翔，馬 毅，趙國耀，徐凌洋，陳 燕，張路培，高會江，李俊雅*，高 雪*

(1．中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193； 2. 天津市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300000)

雜種優(yōu)勢(heterosis)是一種廣泛存在于動植物中的生物學現象，指具有遺傳差異的兩個親本雜交，其F1代在生產性能、抗病性、抗逆性等方面一定程度上優(yōu)于雙親的現象。目前，雜種優(yōu)勢測定大多通過對不同親本間雜種后代生產性能的評價，篩選出最佳的雜交親本，但該方法耗費大量的人力、物力、財力和時間成本，且缺乏預見性。因此，尋找一種簡單有效的方法，在育種早期預測出目標親本間潛在的雜種優(yōu)勢，對提高育種效率，加快育種進程具有重要意義。

20世紀80年代，隨著分子生物學技術的發(fā)展，DNA遺傳標記興起，這使得利用DNA遺傳標記來預測和估計畜禽基因組雜種優(yōu)勢及其組分成為可能。吳常信指出，通過分析品種或品系間DNA遺傳多態(tài)，計算兩個雜交品種或品系間的遺傳距離來預測雜種優(yōu)勢，要比根據其它材料更穩(wěn)定，更準確。隨后隨機擴增多態(tài)DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)和微衛(wèi)星DNA(simple sequence repeat, SSR)等標記在畜禽雜種優(yōu)勢預測上得到廣泛應用。近年來，隨著快速、高通量SNP分型技術的發(fā)展，尤其SNP芯片問世，基于SNP標記研究畜禽遺傳多態(tài)性和關聯分析等來探究畜禽雜種優(yōu)勢的報道越來越多。Amuzu-Aweh等等利用53 000個基因組SNPs對白來航雞產蛋量、蛋重的雜種優(yōu)勢進行了預測，發(fā)現利用等位基因頻率平方差(SDAF)預測產蛋量和蛋重的雜種優(yōu)勢準確性達到50%，節(jié)省了約50%的現場測試成本。徐忠等等利用胴體與肉品質、繁殖、健康和生長4種性狀的基因組特異性SNPs標記估算了杜洛克、大白和長白與我國地方豬種金華豬間的遺傳距離，預測了金華豬不同雜交模式下的雜種優(yōu)勢。范婷婷等則利用覆蓋全基因組和與性狀相關的SNPs標記預測了西門塔爾牛與我國8個地方黃牛品種間的雜種優(yōu)勢，結果發(fā)現西門塔爾牛與南丹牛雜交優(yōu)勢最高。這些研究雖然篩選出較優(yōu)的雜交組合，但未對較優(yōu)組合進行實際雜交效果驗證。

近年來，由于肉牛業(yè)和奶業(yè)市場的雙向需求，在實際生產中，西門塔爾牛、和牛常被用來雜交改良中低產荷斯坦牛以提高后代公牛的產肉性能，但它們與荷斯坦牛的雜種優(yōu)勢研究少有報道。因此，本研究以和牛、西門塔爾牛為父本，荷斯坦牛為母本構建不同的雜交組合，利用Illumina BovineHD770K和GGP Bovine 100 K基因芯片進行基因分型，分別用性狀特異性SNPs和全基因組SNPs兩種標記估算親本間的遺傳距離，預測各雜交組合在生長發(fā)育和胴體性狀上的雜種優(yōu)勢，并構建較優(yōu)組合的實際雜交群體，通過分析親本間的一般配合力和特殊配合力來評估實際雜交效果，為指導牛的雜種優(yōu)勢利用和選種選配提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1.1.1 雜種優(yōu)勢預測群體 雜種優(yōu)勢預測群體包括和牛(Wagyu, W)、西門塔爾牛(Simmental, S)和荷斯坦牛(Holstein, H)。和牛來自遼寧省大連市甘井子區(qū)大連雪龍牧場，共464頭；西門塔爾牛來自內蒙古錫林郭勒盟烏拉蓋管理區(qū)牧場，共1 222頭； 荷斯坦牛來自天津市金三農農業(yè)科技開發(fā)有限公司和天津市東旭奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社兩個牧場，共43頭。

1.1.2 實際雜交群體 2017—2019年，利用30頭德系西門塔爾牛凍精(German Simmental，GS)與天津市東旭奶牛養(yǎng)殖專業(yè)合作社、天津市宏樂奶牛養(yǎng)殖有限公司、天津市金三農農業(yè)科技開發(fā)有限公司荷斯坦母牛(Holstein, H)進行人工授精，獲得261頭F1代，并收集其初生重數據(圖1)。

圖1 30個德系西門塔爾牛不同家系的后代數Fig.1 The number of offspring of different families in German Simmental

1.2 血樣采集與基因分型

除30頭德系西門塔爾牛使用凍精提取DNA外，所有試驗牛均使用靜脈采血，每頭牛采集血液5 mL， 與EDTA抗凝劑充分混勻后，放入低溫采樣箱運至實驗室，于-20 ℃冰箱冷凍保存。采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取DNA，并利用紫外分光光度計檢測其濃度與純度，檢測合格的DNA分別送由北京康普森農業(yè)科技有限公司和紐勤生物科技(上海)有限公司進行基因分型。464頭和牛與1 222頭西門塔爾牛使用Illumina BovineHD770K芯片分型；30頭德系西門塔爾牛、43頭荷斯坦牛和261頭F1代使用GGP Bovine100K芯片進行分型。

1.3 基因型數據質量控制

利用PLINK v1.90軟件對基因型數據進行質量控制，先質控SNPs，然后再質控個體。質控標準如下：1)SNP位點位于常染色體；2)SNP位點的檢出率(call rate)大于95%；3)SNP的最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)大于5%；4)位點哈代-溫伯格平衡(hardy-weinberg equilibrium, HWE)檢驗概率大于10(>10)；5)個體SNP基因型檢出率(call rate)大于90%。命令如下：plink --file filename -- geno 0.05 --hwe 0.000001-- mad 0.05 --mind 0.1 -- make-bed --out filename --cow -noweb。

對于缺失基因型的位點，利用Beagle軟件進行填充。命令：java -Xmx1000 m -jar beagle.jar unphased=filename.bgl missing=? out=outfilename。

質量控制后，和牛506 996個SNPs，西門塔爾牛675 029個SNPs，荷斯坦牛83 952個SNPs，德系西門塔爾牛81 411個SNPs，F1代83 723個SNPs用于后續(xù)分析。

1.4 雜種優(yōu)勢預測分析

1.4.1 確定目的性狀特異性SNPs位點 本研究以初生重(birth weight,BW)、周歲重(yearling weight,YW)、胴體重(carcass weight,CW)作為目的性狀，將牛QTLs數據庫(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/BT/index)中關于生長性狀的QTLs篩選出來，并利用Perl軟件將目的性狀QTLs與牛參考基因組進行比對，分別獲得與初生重、周歲重、胴體重相關的3類基因集合。最后，通過R軟件將檢測到的基因芯片SNPs映射到這些基因上，從而篩選出3個性狀特異性SNPs。

1.4.2 分析群體遺傳結構 為避免連鎖SNPs對群體結構分析的影響，利用PLINK軟件剔除連鎖不平衡系數(r)大0.8的SNPs。然后分別對基因組SNPs及性狀特異性SNPs進行主成分分析(principal component analysis，PCA)(參數：indep-pairwise 50 5 0.2)，分析群體間的遺傳結構；輸出結果用R軟件畫圖展現。

1.4.3 構建群體間性狀IBS 依據質控后基因組SNP位點和目的性狀特異性SNPs位點，按照性狀類別，計算雜交組合2親本群體間的同態(tài)相同概率(identity by state, IBS)，即可能的子代純合子概率。以群體間遺傳距離=1-作為評定雜種優(yōu)勢高低的指標。親本與之間的IBS為：

式中，為SNP的總個數；表示第n個SNP位點的等位基因個數，一般為2；表示第個等位基因在第個群體內第個位點上的等位基因頻率，表示第個等位基因在第個群體內第個位點上的等位基因頻率。

1.5 實際雜交群體配合力分析

利用混合線性模型，計算德系西門塔爾(父本)與荷斯坦母牛(母本)雜交一代初生重性狀的一般配合力(general combining ability, GCA)和特殊配合力(special combining ability, SCA)。

模型：=++++

2 結 果

2.1 品種間雜種優(yōu)勢預測分析

2.1.1 目的性狀特異性多態(tài)位點確定 將和牛、西門塔爾牛和荷斯坦牛的基因組SNPs位點與牛QTLs數據庫進行比對，篩選出與牛生長發(fā)育及胴體性狀相關的QTLs，并與?；蚪M序列進行比對，篩選到與牛BW、YW和CW性狀相關的特異性SNPs位點集合。和牛、西門塔爾牛和荷斯坦牛與目的性狀相關的SNPs位點數見表1。

表1 3個群體中與目的性狀相關的SNPS位點數

2.1.2 群體遺傳結構分析 利用性狀特異性和全基因組SNPs標記對和牛、西門塔爾牛及荷斯坦牛3個群體進行主成分分析，結果如圖2所示。由圖2可以看出，基于兩種標記密度的主成分分析結果大致相同，和牛、西門塔爾牛、荷斯坦牛各自較為集中地聚在一起。同時，根據PC1發(fā)現荷斯坦牛與西門塔爾牛、和牛均存在一定程度的交互現象，但整體來看，和牛與荷斯坦牛的距離較近。這表明相對西門塔爾牛，和牛與荷斯坦牛的親緣關系更近，遺傳背景差異更小，這也與和牛的育種歷史相符合。

A.初生重相關SNPs的PCA；B. 周歲重相關SNPs的PCA；C. 胴體重相關SNPs的PCA；D.全基因組SNPs的PCAA. PCA of SNPs for birth weight; B. PCA of SNPs for yearling weight; C. PCA of SNPs for carcass weight; D. PCA of genome-wide SNPs圖2 基于性狀特異性和全基因組SNPs對和牛、西門塔爾牛及荷斯坦牛群體的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of Wagyu, Simmental and Holstein based on trait-associated and genome-wide SNPs

2.1.3 品種間雜交組合遺傳距離比較 利用BW、YW和CW性狀相關的特異性SNPs與全基因組SNPs分別計算西門塔爾?！帷梁伤固古！?S×H)與和?！帷梁伤固古！?W×H)親本間遺傳距離，結果見圖3。由圖3可以看出，在BW、YW和CW 3個性狀上，S×H遺傳距離分別為0.343 1、0.348 7和0.336 7，W×H親本間遺傳距離分別為0.337 6、0.340 7和0.329 2。在全基因組水平上，S×H 和W×H親本間雜交組合遺傳距離為0.346 1和0.338 9，與相關SNPs估算的遺傳距離差異不顯著。由圖3可以發(fā)現，基于BW、YW和CW性狀特異性SNPs與全基因組水平SNPs分析兩個雜交組合遺傳距離排序均相同，即為S×H > W×H。因此，西門塔爾牛與荷斯坦牛雜交獲得的雜種優(yōu)勢可能性更大，這一結果與PCA分析結果相同。

圖3 西門塔爾牛、和牛與荷斯坦牛雜交組合的遺傳距離比較Fig.3 Genetic distance comparison of Simmental×Holstein and Wagyu×Holstein

2.2 實際雜交群體的配合力分析

為了進一步驗證較優(yōu)組合S×H的實際雜種優(yōu)勢效果，2017—2019年期間，利用30頭德系西門塔爾牛父本與荷斯坦母牛交配構建了實際雜交群體，獲得261頭F1代。本研究利用261頭F1代初生重性狀計算了德系西門塔爾牛與荷斯坦牛GCA和SCA，結果見圖4和表2。由圖4可以看出，在初生重性狀上，有10個父本的GCA效應值為正，父系6號(29617)的效應值最高，達到了3.760 9，其次為父系19號(12FFM13)的GCA達到了2.673 2，具體見表2。對于不同父系雜交組合的SCA來看，SCA效應值的正負情況與GCA大致相符，父系13號(426989)、19號(12FFM13)、21號(FW13213107)雜交組合的SCA效應值較高，尤其父系19號(12FFM13)的SCA達到8.931 2。因此，在指導實際的選種選配中，為了獲得較大的初生重，可優(yōu)先選擇德系西門塔爾牛父系6號(29617)、13號(426989)、19號(12FFM13)、21號(FW13213107)與荷斯坦牛配種。

圖4 不同父系初生重性狀一般配合力和特殊配合力Fig.4 General and specific combining abilities of different paternal families for birth weight

表2 30個父本初生重性狀的一般配合力和特殊配合力

3 討 論

3.1 雜種優(yōu)勢預測分析

雜種優(yōu)勢因雜交后代具有生產性能、生活力和抗逆性等均高于雙親的特點，被廣泛地運用在畜禽雜交育種中，例如我國利用西門塔爾牛培育了中國西門塔爾牛和蜀宣花牛等乳肉兼用新品種；利用夏洛萊牛培育了夏南牛和遼育白牛專門化肉牛品種。雜種優(yōu)勢利用成為提高我國地方黃牛生產性能的重要途徑之一，雜種優(yōu)勢利用率越高，種畜的價值就越高，其后代的養(yǎng)殖利潤就越大，而雜種優(yōu)勢利用率的評估則依賴于對種畜雜種優(yōu)勢大小的預測。傳統(tǒng)經典遺傳學認為，親本間的遺傳差異是雜種優(yōu)勢產生的基礎，親本間遺傳距離越遠、品系純度越高，后代表現出來的雜種優(yōu)勢就會越明顯。曹陽等等利用微衛(wèi)星標記分析了德國黃牛、利木贊牛、紅安格斯牛、夏洛萊牛與當地西雜牛的遺傳距離，發(fā)現4個引進品種與西雜牛的遺傳距離為：德國黃牛>利木贊牛>紅安格斯牛>夏洛萊牛，預測西雜牛與德國黃牛的雜種優(yōu)勢最高，利木贊次之，夏洛萊牛最低。范婷婷等等利用牛770K SNPs高密度芯片分析了西門塔爾牛與我國8個地方牛品種間的遺傳距離，預測西門塔爾牛與南丹牛在各性狀上可獲較高的雜種優(yōu)勢。Martinez-Boggio等研究表明，安格斯♂×海福特♀的F1代母牛受胎率(artificial insemination probability，AIP)和產犢成功(calving success，CS)較高，而內洛爾?！帷梁８Ｌ亍獾?～7歲雜交母牛的平均妊娠天數(days to calving，DC)和CS較高。其他畜禽，如豬、鴨、雞、羊等同樣依據遺傳距離得到了各組合雜種優(yōu)勢優(yōu)劣結果。本研究利用全基因組水平SNPs和性狀特異性的SNPs對3個群體遺傳結構及不同親本間的遺傳距離進行了分析，預測了其雜種優(yōu)勢。結果表明,無論是利用全基因組水平SNPs還是目的性狀特異性SNPs位點分析3個群體PCA，均發(fā)現西門塔爾牛與荷斯坦牛的遺傳距離較遠，且預測雜種優(yōu)勢高。雖然利用性狀特異性SNPs標記估算的初生重、胴體重性狀遺傳距離低于全基因組SNPs，但差異不顯著。與全基因組水平相比，性狀特異性SNPs標記減少了標記數量，但預測結果與全基因組SNPs預測結果相同，說明使用性狀特異性SNPs標記可提高估計準確性。另外，本研究中利用Illumina Bovine HD 770K和GGP Bovine 100K兩款芯片分別對和牛、西門塔爾牛和荷斯坦牛群體進行基因分型，篩選得到和牛506 996個有效多態(tài)性SNPs位點，西門塔爾牛675 029個，荷斯坦牛83 952個，德系西門塔爾牛81 411個。從群體PCA和雜種優(yōu)勢預測結果看出，GGP Bovine 100K芯片標記數量能準確評估群體遺傳結構和雜種優(yōu)勢預測，但檢測成本卻大幅降低75%左右。因此，在畜禽雜交優(yōu)勢預測中，可采用中低密度芯片來鑒定被預測親本的基因型，從而減少雜交預測的試驗成本。

3.2 基于配合力的雜交效果分析

配合力(combing ability)是指一個親本(純系、自交系或被測材料)與另一系列具有遺傳差異的親本雜交所產生雜種一代性狀表現中所起作用相對大小的度量，可分為一般配合力(GCA)和特殊配合力(SCA)。GCA是指親本在所有雜交組合中表現出的平均配合效應，是親本基因加性效應作用的結果，可穩(wěn)定遺傳。而SCA反映了基因的非加性效應，即基因顯性、超顯性和上位效應等相互作用的結果，不能穩(wěn)定遺傳，只能通過親本雜交在F1代表現出來，是雜種優(yōu)勢的重要遺傳基礎。一般GCA高的親本，其SCA也會比較高，后代雜種優(yōu)勢的表現也會更突出。本研究為進一步驗證雜種優(yōu)勢預測結果的準確性，針對初生重、周歲重和胴體重性狀較優(yōu)的S×H，進行了實際群體的雜交試驗，根據后代初生重性狀的GCA和SCA來驗證雜種優(yōu)勢預測的準確性。結果發(fā)現，S×H雜交后代初生重性狀表現出了較好的雜種優(yōu)勢，GCA較高的父本，其SCA同樣也比較高，都表現為正向的效應值。趙宗勝等報道，GCA效應值較高的安卡紅肉雞，其雜交組合的SCA也均為正值，為高效組合。在對兔子、虹鱒、凡納濱對蝦、牡蠣、黃瓜、甘藍的研究等中同樣也得到了類似的結果。由此證明，基于基因組和性狀特異性SNPs預測雜種優(yōu)勢結果的準確性。同時，在實際群體的選配計劃中，可選擇GCA和SCA高的德系西門塔爾牛父系與荷斯坦牛雜交，以獲得較高的初生重，例如GCA和SCA均為正值的父系6號(29617)、13號(426989)、19號(12FFM13)、21號(FW13213107)。

4 結 論

本研究基于覆蓋全基因組和性狀的特異性SNPs標記估算了西門塔爾牛、和牛與荷斯坦牛親本間的遺傳距離，預測出S×H為雜種優(yōu)勢較高的雜交組合；實際雜交群體的配合力測定發(fā)現，S×H的雜交后代在初生重性狀上表現出較高的雜種優(yōu)勢。因此，西門塔爾牛與荷斯坦牛雜交可在初生重、周歲重和胴體重性狀獲得較高的雜種優(yōu)勢。