張 茂， 潘宇杰， 梁笑玲， 張楚玥， 陳少珍， 林曉玲， 李虹儀

(韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005)

飼料原料的短缺問題一直影響著畜牧業(yè)的發(fā)展，成為我國畜牧業(yè)面臨的一大挑戰(zhàn)，因此需要不斷開發(fā)飼料資源。纖維素是自然界年產(chǎn)量巨大的可再生資源，然而這些寶貴的纖維素資源并沒有被有效地利用。此外，豬和家禽日糧中也存在大量纖維素因含有非淀粉多糖(non starch polysaccharides，NSP)等抗?fàn)I養(yǎng)因子而降低了其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率而不能被畜禽利用。飼用酶制劑被認(rèn)為是目前能有效解決養(yǎng)殖領(lǐng)域中飼料安全、飼料原料缺乏的新型飼料添加劑。為了促進(jìn)不同類型飼糧纖維的合理開發(fā)和利用，可通過添加纖維素酶來提高動(dòng)物機(jī)體對(duì)飼糧纖維的消化利用率，改善動(dòng)物腸道健康，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，以緩解飼料資源危機(jī)。纖維素酶來源有細(xì)菌、真菌、昆蟲等，同時(shí)也有大量不同來源的基因被克隆，如芽孢桿菌、木霉、青霉、牛瘤胃微生物、天牛、白蟻、白蟻體內(nèi)細(xì)菌、福壽螺等。動(dòng)物源(如天牛、白蟻、福壽螺等)消化道分泌的纖維素酶對(duì)纖維素展現(xiàn)出較好的水解能力，其應(yīng)用亦受到廣泛關(guān)注。桑天牛消化道內(nèi)源表達(dá)的纖維素酶在分解木質(zhì)纖維素方面具有較高的活性，可進(jìn)一步將其研究應(yīng)用于飼料資源的開發(fā)。本試驗(yàn)以桑天牛為來源，克隆桑天牛腸道纖維素酶基因，構(gòu)建體外表達(dá)載體并在PK15細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，以期得到高活性的纖維素酶基因用于酶制劑生產(chǎn)或轉(zhuǎn)基因研究，拓寬畜牧業(yè)的飼料來源。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser、LA酶、pMD18-T載體、連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性內(nèi)切酶(Ⅰ、Ⅰ)、DL 2000 DNA Marker、PCR檢測試劑Ex，均購自TaKaRa公司；膠回收Gel Extraction Kit D2500、質(zhì)粒提取Plasmid Mini Kit Ⅰ，均購自O(shè)mega公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofctamine、細(xì)胞培養(yǎng)試劑胎牛血清(FBS)、達(dá)爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)，均購自Life公司；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、-葡聚糖，均購自Sigma公司。PK15細(xì)胞、表達(dá)載體pCMS-EGFP于筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)于2017年5月至2020年12月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院及韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院進(jìn)行。

1.2 引物設(shè)計(jì)

參考GenBank發(fā)布的桑天牛纖維素酶編碼基因(AY741064)、(AY451326)的序列，用DNAstar軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增其cDNA序列(長度分別為711、720 bp)，分別加入酶切位點(diǎn)Ⅰ、Ⅰ和Kozak序列，引物由深圳華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 纖維素酶基因擴(kuò)增引物序列信息

1.3 RT-PCR擴(kuò)增

將采集的桑天牛在超凈工作臺(tái)中的冰上分離出腸道組織，用TRIzol法提取腸道組織的總RNA，用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA的合成，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：0.5 μL LA(5 U/μL)，5 μL 10×LABuffer Ⅱ，8 μL dNTP Mixture，各1 μL上、下游引物，4 μL模板，加ddHO至50 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。將PCR產(chǎn)物分別與 pMD18-T 進(jìn)行連接，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，再將單克隆菌液送至測序公司測序，將測序結(jié)果與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇無移碼、缺失、終止突變的克隆進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 酶切

分別以含有、基因的載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用限制性內(nèi)切酶Ⅰ、Ⅰ分別對(duì)表達(dá)載體pCMS-EGFP及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切體系：5 μL 10×QuickCut Green Buffer，各2.5 μL QuickCutⅠ、Ⅰ，30 μL DNA，加ddHO至50 μL。37 ℃保溫1 h，酶切結(jié)束后用Gel Extraction Kit進(jìn)行目的片段的回收。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收的載體片段pCMS-EGFP與插入基因DNA片段按照連接試劑盒(DNA Ligation Kit Ver.2.1)說明書比例混合制備成體積為10 μL 的DNA 溶液，加入等體積的10 μL Solution Ⅰ，充分混勻后于 16 ℃ 連接反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后將連接液進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板，挑單克隆菌落進(jìn)行培養(yǎng)，用通用引物T3、T7進(jìn)行菌液PCR，將PCR檢測陽性的菌液送往深圳華大基因科技有限公司測序，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，分析構(gòu)建質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

1.6 轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞

將PK15細(xì)胞在含有5% FBS、1%雙抗的DMEM中于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Plasmid Mini Kit Ⅰ試劑盒抽提表達(dá)質(zhì)粒DNA，用Lipofectamine 3000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將PK15細(xì)胞傳代于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度約為60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別用125 μL Opti-MEM將質(zhì)粒DNA(2.5 μg)和P3000Reagent(5 μL)進(jìn)行稀釋，然后將稀釋的DNA加入到稀釋的轉(zhuǎn)染試劑中輕輕混勻，在室溫下孵育15 min，將孵育好的混合物加入培養(yǎng)細(xì)胞中混勻。將構(gòu)建的表達(dá)載體及空載體分別轉(zhuǎn)染3次，轉(zhuǎn)染后48 h在熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)情況。

1.7 纖維素酶活性的測定

培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液作為粗酶液，采用二硝基水楊酸法(DNS法)在溫度為40 ℃、pH值為4.5和5.5的條件下測定其水解活性。以1% CMC-Na 溶液作為底物，并參考NY/T 912—2004《飼料添加劑 纖維素酶活力的測定 分光光度法》測定纖維素酶活性；以0.8%-葡聚糖溶液作為底物，并參考NY/T 911—2004《飼料添加劑-葡聚糖酶活性的測定 分光光度法》測定-葡聚糖酶活性，計(jì)算出不同纖維素酶基因表達(dá)的粗酶液的纖維素酶活性、-葡聚糖酶活性。

1.8 纖維素酶基因的RT-PCR檢測

用細(xì)胞刮片將PK15細(xì)胞刮下，用TRIzol法提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用纖維素酶基因、擴(kuò)增引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測纖維素酶基因在PK15細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

酶活性以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，對(duì)不同纖維素酶基因(、)表達(dá)的酶活性進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Agc Ⅰ、Agc Ⅱ基因的擴(kuò)增

以桑天牛腸道組織總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果獲得大小約為730、740 bp的預(yù)期條帶(圖1)。測序結(jié)果與目的序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，克隆的基因(711 bp)有4個(gè)堿基發(fā)生突變，基因(720 bp)發(fā)生了8個(gè)堿基突變，相似度分別為99.4%(基因)和98.3%(基因)；基因編碼236個(gè)氨基酸，基因編碼239個(gè)氨基酸，氨基酸比對(duì)分析結(jié)果顯示，與目的基因氨基酸序列的相似度為100.0%，基因與目的基因氨基酸序列的相似度為99.6%，在第56位氨基酸位置上發(fā)生了S→N的突變，表明克隆的、基因沒有發(fā)生移碼、缺失、終止突變，可用于后續(xù)基因的表達(dá)試驗(yàn)。

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

通過酶切、連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR檢測，構(gòu)建出包含纖維素酶基因的表達(dá)載體pCMS-、pCMS-(圖2)，測序結(jié)果正確，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)

利用脂質(zhì)體將表達(dá)載體pCMS-EGFP、pCMS-和pCMS-分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞，48 h后于熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果(圖3)顯示，轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞中均觀察到EGFP的表達(dá)，視野中綠色熒光細(xì)胞數(shù)量較多，表明轉(zhuǎn)染效果良好。

2.4 纖維素酶活性的測定

利用DNS法在40 ℃測定纖維素酶基因表達(dá)粗酶液的活性。結(jié)果(圖4)顯示，以CMC-Na為底物，在pH值為5.5的環(huán)境下，、基因表達(dá)的纖維素酶活性分別為(0.09±0.01)、(0.24±0.02) U/mL；在pH值為4.5的環(huán)境下，纖維素酶活性分別為(0.07±0.00)、(0.20±0.01) U/mL。以-葡聚糖為底物時(shí)，在pH值為5.5的環(huán)境下，、基因表達(dá)的-葡聚糖酶活性分別為(0.27±0.02)、(0.43±0.05) U/mL；在pH值為4.5的環(huán)境下，-葡聚糖酶活性分別為(0.05±0.00)、(0.16±0.01) U/mL?？蛰d體轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞培養(yǎng)液中未檢測到纖維素酶、-葡聚糖酶。此外， 在以-葡聚糖、CMC-Na為底物及不同pH值條件下，基因表達(dá)的纖維素酶、-葡聚糖酶的活性都顯著高于基因(<0.05)。

2.5 纖維素酶基因的表達(dá)

通過提取轉(zhuǎn)染后PK15細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，結(jié)果(圖5)顯示，在pCMS-、pCMS-轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞cDNA中擴(kuò)增出、基因目的條帶，而在轉(zhuǎn)染空載體pCMS-EGFP的陰性對(duì)照PK15細(xì)胞中未檢測到有纖維素酶基因表達(dá)，表明纖維素酶基因在PK15細(xì)胞中表達(dá)成功。

3 討論

木質(zhì)纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，是地球上最豐富的可再生生物質(zhì)，占據(jù)了地球90%以上光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)資源，同時(shí)也是一種飼料資源。在單胃動(dòng)物日糧中添加纖維素酶可以有效消除飼料中纖維素的抗?fàn)I養(yǎng)作用、提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，同時(shí)還能開發(fā)飼料資源。為了緩解畜牧業(yè)飼料資源短缺的局面，近幾年來，大量木本飼料如桑葉、辣木、構(gòu)樹等被開發(fā)用于豬和家禽飼料中，這些飼料中纖維素含量過高不易消化，更需要添加高活力的纖維素酶來降解含量較高的木質(zhì)纖維素，以更好地將這些非常規(guī)飼料用于畜禽養(yǎng)殖中。桑天牛主要以樹木纖維素為食源，它主要依靠腸道和唾液中的各種纖維素酶、半纖維素酶的協(xié)同作用分解食物中的纖維素、半纖維素，桑天牛自身能夠分泌纖維素酶并能有效分解木質(zhì)纖維素，因此本研究選擇從桑天牛腸道組織中克隆纖維素酶基因。本試驗(yàn)成功從桑天牛腸道組織中克隆到了纖維素酶編碼基因、的cDNA序列，長度分別為711、720 bp，與目的基因序列相比，沒有發(fā)生移碼、缺失、終止突變，2個(gè)基因翻譯的氨基酸序列與目的基因序列相比相似度都在99%以上。此外，本研究克隆的纖維素酶基因的cDNA序列與基因的相似度為76%，同屬于GHF45家族，再次證明桑天牛自身消化道能夠分泌纖維素酶體系。

通過構(gòu)建表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，在細(xì)胞培養(yǎng)液中檢測到了纖維素酶活力和-葡聚糖酶活性，表明克隆的纖維素酶基因兼具-葡聚糖酶活性。酶活性測定結(jié)果顯示，在40 ℃、pH值為4.5及pH值為5.5的條件下，纖維素酶基因表達(dá)的酶活性都優(yōu)于基因表達(dá)的酶活性，在pH值為5.5的條件下的酶活性優(yōu)于pH值為4.5的酶活性，所以基因可作為候選基因進(jìn)行下一步研究。此外，對(duì)PK15細(xì)胞進(jìn)行的RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)了纖維素酶基因、的表達(dá)，表明纖維素酶基因在PK15細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。

本研究克隆了桑天牛纖維素酶基因并構(gòu)建出真核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞進(jìn)行了分泌表達(dá)，在基因表達(dá)的粗酶液中測定到了較高的纖維素酶及-葡聚糖酶活性，可以為桑天牛纖維素酶基因在轉(zhuǎn)基因及酶制劑制的生產(chǎn)方面提供參考。