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(海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 海口 570102)

帕金森病(PD)主要癥狀為持續(xù)進展的運動遲緩、肌強直、靜止性震顫等運動癥狀及腸道功能障礙、精神癥狀等非運動癥狀〔1～3〕?，F(xiàn)有的治療手段僅可以減輕疾病癥狀，不能阻止PD持續(xù)進展〔4〕，針對性治療一直是研究熱點。神經(jīng)炎癥在PD的神經(jīng)退行性過程中起主導作用〔5，6〕。小膠質(zhì)細胞是參與神經(jīng)炎癥反應中主要的神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型，PD 進展中伴隨明顯的小膠質(zhì)細胞活化〔7〕。腸道微生物對PD等退行性神經(jīng)疾病有直接影響，有研究觀察到無菌小鼠出現(xiàn)明顯的小膠質(zhì)細胞缺陷〔8〕。探索腸道菌群與PD發(fā)病機制的聯(lián)系，可能成為PD一種新的診斷和治療靶點。本文通過1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)構建慢性PD小鼠模型，探究MPTP誘導的慢性PD模型小鼠腸道菌群、腦內(nèi)炎癥情況。

1 資料與方法

1.1實驗材料 實驗動物：C57BL/6雄性小鼠，體重均約20 g，8周齡。飼養(yǎng)環(huán)境：控制室內(nèi)溫度約24℃、相對濕度50%～60%。飼養(yǎng)管理：每日通風2 h，光照12 h、黑暗12 h，飲用純凈水、食用標準飼料。

實驗試劑：MPTP、丙舒磺(美國Sigma)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測量試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)抗小鼠抗體、HRP抗兔抗體、HRP抗山羊抗體(碧云天)；Triton X-100、BSA、TEMED、蛋白marker(Solarbio)；PVDF膜(Millipore)；ECL發(fā)光液(Tanon)；Arginase抗體、Iba-1抗體、p-PTEN、PTEN(abcam)；SYBR green溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso Plus(Takara)。

實驗設備：轉(zhuǎn)棒測試儀(上海欣軟)；組織脫水機、組織包埋機、組織攤片機(睿普思星)；顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳儀、濕法轉(zhuǎn)膜儀(BioRad)；化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(Tanon)；激光掃描共聚焦顯微鏡(蔡司)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.2實驗分組與造模 小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為正常對照、PD模型組，每組6只。腹腔注射MPTP〔25 mg/(kg·3.5 d)〕+丙磺舒〔250 mg/(kg·3.5 d)〕造模，造模時間為35 d；正常對照組：每日予等體積的生理鹽水腹腔注射；期間自由飲用純凈水。

1.3行為學檢測 轉(zhuǎn)棒實驗：設置旋轉(zhuǎn)腳架系統(tǒng)的參數(shù)為啟動速度1 r/min、加速12 r/(min·2 s)、最高速度50 r/min。旋轉(zhuǎn)腳架性能測試后(Rotamex裝置)，連續(xù)3次，取后2次掉落時間平均值。爬桿實驗：爬桿高50 cm，直徑1 cm，頂端有直徑35 mm的圓球。測試過程中，將老鼠放置在圓球上，為老鼠頭朝下的時間，如果老鼠在圓球上停留超過30 s，則引導其爬下桿，并將T-turn記為30 s；T-LA為爬到桿底時間。每只老鼠在測試前一天進行3次訓練。測試當天，每只老鼠重復爬桿2次，記錄平均值。

1.4腸道菌群檢測 采集新鮮糞便樣本，行16SrDNA 基因測序技術檢測小鼠腸道菌群，對腸道菌群進行結構分析。

1.5HE染色檢測小鼠盲腸黏膜組織形態(tài)學變化 取盲腸頂部1.5 cm(包括盲腸扁桃體)，進行脫水、包埋、切片后，予蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質(zhì)，顯微鏡鏡檢。

1.6免疫熒光染色檢測黑質(zhì)TH、Iba-1、iNOS、Arginase表達 腹腔注射100 mg/kg劑量戊巴比妥鈉處死小鼠，小鼠腦標本-80℃速凍5 min，分離挖取黑質(zhì)。4%多聚甲醛固定小鼠腦標本24 h以上，在4℃冰箱予15%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液進行2次脫水，隨后OCT包埋、切片，切片厚度為6 μm。固定切片，5% BSA溶液滴在切片上并溫育30 min，一抗體滴在切片上4℃孵育過夜，二抗體滴在切片室溫避光孵育30 min，DAPI核染10 min，最后熒光照片。

1.7Western印跡檢測黑質(zhì)TH、Iba-1、iNOS、Arginase表達 液氮速凍小鼠中腦黑質(zhì)，加入PMSF裂解液(50 mg/ml)，裂解后得到總蛋白。采用BCA試劑盒測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后采用Tanon ECL進行化學法發(fā)光，凝膠成像儀顯影拍照，用Image J進行灰度值分析。

1.8實時定量PCR檢測小鼠黑質(zhì)白細胞介素(IL)-1β、IL-10 分離小鼠中腦黑質(zhì)，液氮速凍后磨成粉末，取出組織，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄后，隨后進行熒光定量PCR。

1.9統(tǒng)計處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1腹腔注射MPTP致慢性PD小鼠模型評價 轉(zhuǎn)棒實驗，PD模型組轉(zhuǎn)棒掉落時間〔(55.13±9.38)s〕較正常對照組〔(118.88±8.68)s〕明顯縮短(P<0.01)。爬桿實驗，與正常對照組〔(1.63±0.30)s、(4.38±0.61)s〕比較，PD模型組T-turn〔(6.5±1.56)s〕、T-LA〔(47.88±1.16)s〕均顯著增加(P<0.01)。PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)TH表達下調(diào)，見圖1。

圖1 各組黑質(zhì)中TH表達(×10)

2.2各組腸道菌群特點 采集新鮮糞便樣本，16SrDNA 基因測序技術檢測小鼠腸道菌群。相比正常對照組，PD模型組腸道菌群多樣性指數(shù)chao1(607±18.01 vs 471±8.44)、分類OTUs數(shù)目(561±17.78 vs 436±14.77)均明顯升高(P<0.05)。對照組與PD模型組糞便菌群OTUs比較，共79個OUTs存在顯著差異。PD模型組有44個OUTs豐富度增高，主歸于雙歧桿菌、厭氧菌、桿菌、球菌、丁酸單胞、支原體；35個OUTs豐富度下降：關節(jié)假絲酵母菌、布勞特菌。PD模型組較正常對照組軟壁菌門(0.24%±0.03% vs 0.11%±0.02%)、變形菌門(2.67%±0.32% vs 1.03%±0.10%)和放線菌門(1.52%±0.03% vs 0.11%±0.02%)的相對豐度顯著上升(P<0.05)。與正常對照組比較，PD模型組厭氧菌屬(1.078%±0.096% vs 0.065%±0.014%)、雙歧桿菌屬(0.421%±0.103% vs 0.000%±0.000%)、桿菌屬(0.094%±0.017% vs 0.001%±0.000 7%)、ASF356(0.259%±0.065% vs 0.000%±0.000%)和瘤胃球菌屬(0.035%±0.009% vs 0.002%±0.001%)的相對豐度顯著上升(P<0.05)；布勞特菌屬(0.067%±0.002% vs 0.230%±0.045%)的相對豐度顯著下降(P<0.05)。

2.3各組黑質(zhì)中小膠質(zhì)細胞表達 PD模型組較對照組黑質(zhì)中Iba-1表達(1.05±0.04 vs 0.59±0.07)、iNOS表達(0.67±0.06 vs 0.41±0.08)、Arginase表達(0.70±0.09 vs 0.33±0.08)均明顯升高(P<0.01)，見圖2。PD模型組黑質(zhì)M1型小膠質(zhì)細胞數(shù)目(iba1+iNOS+數(shù)目)(28±2)高于對照組(5±0)，差異顯著(P<0.01)。PD模型組黑質(zhì)M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)目(Iba1+Arginase+數(shù)目)(12±1)高于對照組(5±1)，差異顯著(P<0.01)。綜合分析，PD模型組中M1型與M2型小膠質(zhì)細胞比值(2.34±0.33)遠大于1，且與正常對照組M1/M2比值(1.06±0.15)相比，差異顯著(P<0.01)。見圖3。

圖2 各組黑質(zhì)Iba-1、iNOS、Arginase的表達

2.4各組腸道黏膜HE染色 小鼠盲腸HE染色，PD模型組黏膜有炎癥細胞浸潤，正常對照組黏膜正常。見圖4。

圖4 各組小鼠盲腸HE染色(×40)

2.5各組黑質(zhì)炎癥因子表達 PD模型組較對照組黑質(zhì)IL-1β表達(2.69±0.25 vs 1.00±0.25)相比顯著升高(P<0.01)；IL-10表達(0.57±0.29 vs 1.00±0.35)明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

MPTP是一種神經(jīng)中樞神經(jīng)干細胞多巴胺能神經(jīng)元的選擇性毒素。慢性PD動物模型構建中，常用的是MPTP〔25 mg/(kg·3.5 d)〕+丙磺舒〔250 mg/(kg·3.5 d)〕腹腔注射35 d的方案〔9〕。本研究中，造模后小鼠出現(xiàn)進行性加重的運動障礙、爬桿和轉(zhuǎn)棒實驗陽性、腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)TH表達下調(diào)，與PD的病理生理變化相一致，是有效的慢性PD模型。同時，小鼠腸道菌群結構改變，盲腸及腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)均發(fā)生了炎癥反應，與目前對PD患者的研究結果一致〔10～12〕。MPTP致慢性PD模型模擬了人類PD的特征。

有研究顯示PD患者腸道雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬、疣微菌屬豐度水平顯著提高〔13〕。Yang等〔14〕發(fā)現(xiàn)布勞特菌屬和優(yōu)桿菌屬豐度在抑郁癥患者腸道菌群中顯著減少，且細菌與糞便代謝產(chǎn)物顯著關聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，PD模型組腸道菌群多樣性增加，雙歧桿菌、厭氧菌、球菌、桿菌豐度增加。腸道菌群屬水平的比較，PD模型組雙歧桿菌屬、厭氧菌屬、ASF356、瘤胃球菌屬和桿菌屬的構成比顯著上升；布勞特菌屬的構成比在PD模型組顯著下降。腸道菌群參與PD的病理生理過程，其機制是否與糞便代謝產(chǎn)物相關，菌群結構改變是否與抑郁等非運動癥狀相關，尚需進一步研究探討。

研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂導致腸道屏障破壞，微生物及其代謝產(chǎn)物脂多糖(LPS)等移位誘發(fā)腸道炎癥及氧化應激反應，導致胃腸黏膜通透性增加〔15〕和腸神經(jīng)系統(tǒng)中α-Syn的異常聚集〔16〕。Toll樣受體(TLR)4是LPS的唯一受體。革蘭陰性細菌釋放其細胞外壁表面LPS，與免疫細胞TLR4膜外基團結合，分泌細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、干擾素(INF)-γ、IL-1β等導致炎癥反應〔17〕。研究證實INF-γ、LPS觸發(fā)IFN-γ信號通路和TLR信號通路會誘導小膠質(zhì)細胞M1型活化〔18〕。動物實驗中，將LPS注射至小鼠腸道中，小鼠出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞M1型激活，并出現(xiàn)神經(jīng)炎癥〔19〕。腸道菌群可能通過調(diào)節(jié)腸道炎癥、黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞極化及腦內(nèi)炎癥因子分泌影響PD、LPS等細菌代謝產(chǎn)物可能是腸道菌群影響PD的橋梁。本研究發(fā)現(xiàn)，PD模型組盲腸黏膜下有炎細胞浸潤，炎癥因子IL-1β的表達明顯升高，抗炎因子IL-10表達明顯下降。其腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞激活且以M1型活化為主，黑質(zhì)區(qū)炎癥因子IL-1β、TNF-α表達上升，抗炎因子IL-10、TGF-β表達下降。腸道菌群改變、腸道炎癥、黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細胞M1型極化、炎癥因子表達增加、抗炎因子表達下降是一個完整過程。綜上，PD始于腸道，通過探索腸道菌群影響PD的機制，進而發(fā)現(xiàn)PD的屬性及特征，尋找PD的診斷及治療策略，有望為PD的診療提供新的方向及思路。