查青青 聶姍姍 于 文

西安開米股份有限公司，陜西西安，710075

膠原蛋白是一類生物高分子蛋白的總稱，它是動(dòng)物結(jié)締組織的主要成分之一，也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占總蛋白質(zhì)含量的25%～30%[1-3]。膠原蛋白廣泛存在于皮膚、骨骼、關(guān)節(jié)、頭發(fā)中，能夠起到支撐、修復(fù)、抗衰老的作用。由于膠原蛋白獨(dú)特的理化性質(zhì)和功能，使其在保健食品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛。

1 重組膠原蛋白的合成研究進(jìn)展

膠原蛋白由特殊的三重螺旋結(jié)構(gòu)鏈組合而成，如圖1所示[4]。原膠原為膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)單元，每條原膠原鏈大約含有1 000個(gè)氨基酸單體。原膠原肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有(Gly-X-Y)n重復(fù)單位，其中X和Y可以為任意一種氨基酸，通常為脯氨酸和羥脯氨酸，少數(shù)為賴氨酸和羥賴氨酸。

圖1 膠原蛋白三維螺旋結(jié)構(gòu)示意圖

目前已發(fā)現(xiàn)了至少49種膠原蛋白編碼，可形成的膠原蛋白類型達(dá)28種[5]。根據(jù)膠原蛋白在體內(nèi)的分布以及功能特點(diǎn)，可分為間質(zhì)膠原、基底膜膠原和細(xì)胞外周膠原。根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同，又可分為微纖維膠原、類纖維膠原、成纖維膠原、成網(wǎng)狀膠原、跨膜膠原、錨定膠原等。其中纖維膠原在組織中分布最廣，根據(jù)類型可以分為：Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原等。其中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白主要存在于皮膚、肌腱、韌帶、關(guān)節(jié)等結(jié)締組織，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是真皮層中最主要的膠原蛋白類型，因此Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白在美容護(hù)膚、護(hù)發(fā)產(chǎn)品中應(yīng)用最廣。

傳統(tǒng)膠原蛋白從動(dòng)物結(jié)締組織中提取獲得，提取方法主要包括高壓輔助的物理方法、溶劑抽提的化學(xué)方法、酶的生物化學(xué)法三種。由于從動(dòng)物組織中提取的膠原蛋白存在動(dòng)物源疾病等風(fēng)險(xiǎn)，限制了傳統(tǒng)膠原蛋白的應(yīng)用和開發(fā)。目前，已有許多重組表達(dá)系統(tǒng)被應(yīng)用于膠原蛋白的重組表達(dá)，如大腸桿菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因植物等，如表1所示[5]。重組類人膠原蛋白是利用DNA重組技術(shù)，通過重組表達(dá)得到類似人源特性的膠原蛋白。

表1 重組膠原蛋白在各表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況

2000年，Myllyharju等使用甲基酵母Pichiapastoris表達(dá)人膠原蛋白Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。2014年，Rutschmann等在大腸桿菌中將人Ⅲ型膠原蛋白和病毒來源的脯氨酸羥化酶一起共表達(dá)，獲得了羥化的膠原蛋白，產(chǎn)量達(dá)到90 mg/L[5]。

西北大學(xué)范代娣[6]課題組利用含有簡(jiǎn)單側(cè)鏈的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸的三肽鏈，通過基因工程菌E.coli BL 21發(fā)酵生產(chǎn)并分離純化得到類人膠原蛋白，蛋白表達(dá)量達(dá)29.4%，同時(shí)該課題組還對(duì)重組類人膠原蛋白的發(fā)酵條件與純化工藝進(jìn)行了深入的研究。

南京理工大學(xué)高力虎、楊樹林等[7]研究了類人膠原蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)。在人膠原蛋白原域的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，以改善膠原蛋白水溶性和提高表達(dá)量為目的，設(shè)計(jì)并人工合成一段編碼具有高親水性約9 ku的Gly-X-Y三肽重復(fù)序列人類膠原蛋白的基因單體，同向串聯(lián)6個(gè)類人膠原蛋白基因單體轉(zhuǎn)化酵母，表達(dá)類人膠原蛋白。該課題組獲得的膠原蛋白在保持天然膠原蛋白膠原域Gly-X-Y序列的高度重復(fù)前提下，可以更加靈活地改變?nèi)四z原蛋白氨基酸序列，改善親水性能。同時(shí)通過改變酸性氨基酸和堿性氨基酸的比例，調(diào)節(jié)人膠原蛋白的等電點(diǎn)。

國(guó)外對(duì)膠原蛋白在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中的重組表達(dá)也進(jìn)行了大量的研究。Stein等[8]在番茄中將Ⅰ型人膠原蛋白、人源脯氨酸羥化酶和賴氨酸羥化酶基因進(jìn)行共表達(dá)，產(chǎn)量為20 g/L，其中羥脯氨酸和羥賴氨酸的含量分別為7.55%和0.74%，表達(dá)產(chǎn)物和天然Ⅰ型人膠原蛋白非常接近。

2 重組膠原蛋白的應(yīng)用

膠原蛋白及其改性產(chǎn)物因其具有促進(jìn)表皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、促進(jìn)傷口的愈合、縮短愈合時(shí)間的功效被大量應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，如將膠原蛋白覆蓋在燒傷、燙傷病患的傷口上，能夠大幅縮短愈合所需時(shí)間，提高燙傷、燒傷患者的存活能力。此外膠原蛋白具有很強(qiáng)的伸張能力，能保持皮膚彈性、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，應(yīng)用于護(hù)膚品中可起到保濕、修護(hù)、抗衰等功效，并且具有良好的生物降解性和生物兼容性，因此膠原蛋白也開始被越來越多的應(yīng)用在護(hù)膚品、洗發(fā)護(hù)發(fā)產(chǎn)品中。

2.1 重組膠原蛋白在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用

張斌杰和周麗娜等[9]將Ⅱ型、Ⅲ型重組人源膠原蛋白用于深度燒傷患者創(chuàng)面的愈合中，結(jié)果表明Ⅱ型、Ⅲ型重組人源膠原蛋白能夠?qū)⒒颊咭驘齻聰嗔训哪z原纖維重新連接起來，合成新的Ⅲ型人源膠原蛋白，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，減少瘢痕增生。

羊劍秋、高以紅等[10]研究了Ⅲ型重組膠原蛋白對(duì)皮膚創(chuàng)口愈合的療效，結(jié)果顯示重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠可有效加速創(chuàng)口愈合，抑制瘢痕產(chǎn)生。

2.2 重組膠原蛋白在護(hù)膚品中的應(yīng)用

人的皮膚分為：角質(zhì)層、透明層、顆粒層、棘細(xì)胞層、基底層，膠原蛋白存在于真皮層中，占皮膚組織組成的70%左右。膠原蛋白素又稱為“皮膚軟黃金”，小分子膠原蛋白可以起到滋潤(rùn)肌膚的作用，同時(shí)補(bǔ)充皮膚所需氨基酸，修護(hù)受損肌膚。將膠原蛋白添加到化妝品中，能為皮膚提供必需的營(yíng)養(yǎng)成分，其所含大量的親水基團(tuán)使之具有良好的保濕功效。另外膠原蛋白還能起到穩(wěn)定泡沫、調(diào)節(jié)和穩(wěn)定pH、乳化膠體的作用，減輕表面活性劑及酸、堿等物質(zhì)對(duì)皮膚和毛發(fā)的刺激作用[11]。膠原蛋白在不同性質(zhì)的化妝品中要求也不同。油性化妝品中添加的膠原多肽要求水解程度較低、分子量較大，這樣相對(duì)疏水作用較強(qiáng)，具有較好的吸油性和乳化性；保濕型化妝品則需要酶解程度較高、分子量較小的膠原多肽，因其極性基團(tuán)能形成離子鍵、氫鍵等作用力，有較好的吸水性和保水性。

含重組膠原蛋白的化妝品品類主要包括眼膜、面膜、噴霧劑、原液、凍干粉等，將重組膠原蛋白應(yīng)用于化妝品配方中，可添加0.5%的烷基糖苷作為膠原蛋白保護(hù)劑，保護(hù)劑的加入有助于重組類人膠原蛋白在化妝品配方中的結(jié)構(gòu)保持完整[12]。

西安巨子生物基因技術(shù)股份有限公司旗下品牌可麗金，主打重組膠原蛋白與肽類成分結(jié)合，起到抗衰、保濕等護(hù)膚功效。山西錦波公司采用重組Ⅲ型膠原蛋白、聚二甲基硅氧烷、蠟基等成分發(fā)明唇部護(hù)理品，與人體生物相容性良好，安全無刺激性，對(duì)唇部皮膚有保濕及柔軟作用[13]。

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）禁止化妝品使用“人的細(xì)胞、組織或人源產(chǎn)品”，因此在化妝品中添加重組膠原蛋白作為原料時(shí)，企業(yè)需嚴(yán)格把控重組膠原蛋白的來源、工藝，同時(shí)避免在產(chǎn)品宣傳、文案中使用禁用詞匯，防止因產(chǎn)品宣傳不當(dāng)導(dǎo)致違規(guī)情況的發(fā)生。

2.3 重組膠原蛋白在洗護(hù)發(fā)產(chǎn)品中的應(yīng)用

人的頭發(fā)結(jié)構(gòu)分為表皮層、皮質(zhì)層和毛髓質(zhì)，如圖2所示[14]。表皮層呈現(xiàn)毛鱗片狀，健康頭發(fā)表面毛鱗片排列緊密，且完整服帖，對(duì)頭發(fā)起保護(hù)作用。頭發(fā)主要由角蛋白組成，約占頭發(fā)的80%，其中含有大量的自然色素粒子，能夠反映出頭發(fā)的自然色彩。

圖2 頭發(fā)橫截面示意圖

膠原蛋白對(duì)頭發(fā)表面的蛋白質(zhì)分子有較大的親和力，可以通過物理吸附作用與頭發(fā)的表面結(jié)合。膠原蛋白耐漂洗，其親和作用隨其分子量的增大而增強(qiáng)，小分子量的膠原蛋白可以透過頭發(fā)的皮質(zhì)層，達(dá)到營(yíng)養(yǎng)頭發(fā)的作用[15]，為頭發(fā)補(bǔ)充膠原蛋白可以促進(jìn)頭發(fā)的柔順與光澤。江蘇江山聚源生物科技有限公司通過對(duì)照測(cè)試發(fā)現(xiàn)，發(fā)束經(jīng)過0.001%重組膠原蛋白水溶液的處理后光澤度增加，發(fā)束經(jīng)過0.001%重組膠原蛋白水溶液處理后，可顯著增加頭發(fā)的拉伸力，增加抵抗外力拉斷的能力。

健康洗發(fā)護(hù)發(fā)市場(chǎng)正在我國(guó)快速發(fā)展，洗發(fā)產(chǎn)品已從簡(jiǎn)單的清潔作用發(fā)展到護(hù)理修復(fù)、去屑止癢和防脫發(fā)、減少斷發(fā)等功能，護(hù)發(fā)產(chǎn)品除要求改善頭發(fā)梳理性能外，還需賦予修護(hù)秀發(fā)、防曬、護(hù)色、防斷發(fā)等功效。研究表明，毛囊干細(xì)胞（HFSC）的逐步老化可導(dǎo)致毛囊逐步小型化，最終導(dǎo)致脫發(fā)[16]。HFSCs 中的DNA損傷反應(yīng)可導(dǎo)致膠原蛋白COL17A1/BP180水解，最終引發(fā)HFSC衰老[17]。因此阻止膠原蛋白COL17A1/BP180水解可緩解脫發(fā)。

上海海盈通感光材料有限公司采用重組膠原蛋白、多肽、植物提取物等成分，使該護(hù)發(fā)組合物能夠修復(fù)受損發(fā)質(zhì)，同時(shí)可以有效刺激毛囊，增加毛囊乳頭活性，促進(jìn)毛發(fā)的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)的補(bǔ)充，增加毛發(fā)的數(shù)量、光澤度和粗壯度，達(dá)到養(yǎng)發(fā)和護(hù)發(fā)的目的[18]。

3 結(jié)語與展望

目前，利用重組表達(dá)生產(chǎn)膠原蛋白的方式主要包括大腸桿菌表達(dá)和酵母表達(dá)兩種。通過大腸桿菌和酵母表達(dá)均可獲得羥化的重組膠原蛋白，大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)率低、價(jià)格高。酵母表達(dá)的產(chǎn)率隨著表達(dá)技術(shù)的發(fā)展有所提升，逐漸成為重組膠原蛋白工業(yè)化的趨勢(shì)。

分離純化工藝復(fù)雜是限制重組膠原蛋白工業(yè)化發(fā)展的主要原因之一。目前重組膠原蛋白的分離純化方式有親和層析法、鹽析沉淀法、離子交換層析法、凝膠層析法等，純化產(chǎn)率在68.6%～80.5%[5]，純化費(fèi)用占總生產(chǎn)成本的20%～30%。

重組膠原蛋白具有安全性高、生物相容性好，對(duì)皮膚保濕修護(hù)功效明顯的特點(diǎn)。隨著重組膠原蛋白表達(dá)技術(shù)水平及分離純化產(chǎn)率的提升，其在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用也將得到進(jìn)一步的發(fā)展。