蘇靜 趙雋 梁瓊

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腫瘤科，上海 200021

膠質(zhì)瘤是源于中樞神經(jīng)上皮的惡性腫瘤，占顱腦腫瘤的40%以上[1]。膠質(zhì)瘤的治療包括手術(shù)及放化療等，但易復(fù)發(fā)和產(chǎn)生耐藥性[2]。微RNA（microRNA，miRNA）-142-5p 編碼基因位于17q22，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控下游靶基因的表達(dá)[3]。研究表明，在多種腫瘤中miRNA-142-5p 異常表達(dá)，能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等行為，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-5]。核糖蛋白2（ribophorin 2，RPN2）屬于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ⅰ型整合膜蛋白，參與分泌蛋白的轉(zhuǎn)運，在肝癌、胃癌等腫瘤中能促進(jìn)N-糖基化P-糖蛋白的糖基化并破壞其膜定位，促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[6-9]。本文通過研究miRNA-142-5p、RPN2 在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，探討兩者的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017 年1 月至12 月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院收治的85 例膠質(zhì)瘤患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次手術(shù)，術(shù)前無任何形式的腫瘤治療；②經(jīng)病理學(xué)檢查確認(rèn)為膠質(zhì)瘤；③能夠配合隨訪，資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官腫瘤；②罹患心肌梗死、腦卒中等急危重癥疾?。虎郯槟X積水或腦部手術(shù)史。本研究經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過（20181211）。

1.2 研究方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 的表達(dá) 選取膠質(zhì)瘤患者手術(shù)切除的癌組織及癌旁正常組織（距離癌組織>0.5 cm），應(yīng)用Trizol 提取RNA，微量分光光度計檢測RNA 的濃度和純度。將RNA 反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。qPCR 檢測：miRNA-142-5p 正向引物序列：5’-GGCCCATAAAGTAGAAAGC-3’，反向引物序列：5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’；U6 正向引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列：3’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5’；RPN2 正 向引物序列：5’-CAAAGTCACCGGACAAGGTC-3’，反向引物序列：5’-TGGTGTTCCGAAGTTGGTCA-3’；GAPDH 正向引物序列：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，反向引物序列：5’-TCAGCTCAGGGATGACCTTG-3’。qPCR 總體系20 μl：cDNA 模板1 μl，正反向引物各1 μl、SYBR Green 10 μl 及雙蒸水7 μl。qPCR 條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性15 s，62℃退火30 s，65℃延伸10 s，共35 個循環(huán)。2-ΔΔCt法表示miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 的相對表達(dá)量。分別根據(jù)癌組織中miRNA-142-5p、RPN2 相對表達(dá)量的均值為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.2.2 免疫印跡檢測 組織研缽研磨，RIPA 裂解后BCA 法蛋白定量，進(jìn)行免疫印跡檢測。電泳后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶封閉2 h，一抗4℃孵育過夜（RPN2兔多克隆抗體購自Abcam，ab244399），山羊抗兔二抗室溫孵育1 h。ECL 暗室顯影照相，應(yīng)用Image J 軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.2.3 熒光素酶實驗驗證miRNA-142-5p 與RPN2的相互作用 pmiRNAGLO-RPN2-WT、pmiRNAGLORPN2-MUT 及miRNA-142-5p mimic 由華大公司設(shè)計合成。雙熒光素酶測定系統(tǒng)（E1910，Promega，美國）和微板發(fā)光計（11300010，Berthold，德國）測定熒光素酶活性。將HEK293T 細(xì)胞以6×104細(xì)胞/孔密度接種到24 孔板，將pmiRNAGLO-RPN2-野生型（wild type，WT）或pmiRNAGLO-RPN2-突變型（mutant，MUT）報告基因分別與miRNA-142-5p mimic 共轉(zhuǎn)染，分別作為RPN2 WT+miRNA-142-5p mimic 組和RPN2 MUT+miRNA-142-5p mimic 組。以單純傳染pmiRNAGLORPN2-WT 或pmiRNAGLO-RPN2-MUT 為RPN2 WT組和RPN2 MUT 組。轉(zhuǎn)染48 h 后測定熒光素酶活性，并以海腎熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4 隨訪 患者自病理確診起進(jìn)行隨訪，每個月電話隨訪1 次，隨訪的內(nèi)容為患者生存及疾病進(jìn)展情況，隨訪截止至隨訪結(jié)束（2020 年12 月）或患者死亡。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)表示。采用Kaplan-Meier 生存曲線法（logrank 檢驗）分析不同表達(dá)水平患者的3 年生在率。。相關(guān)檢驗為Pearson 相關(guān)分析。在線生物信息學(xué)軟件Targetscan 預(yù)測miRNA-142-5p 與RPN2 的相互作用（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-142-5p 及RPN2 的表達(dá)

miRNA-142-5p 在膠質(zhì)瘤組織中的相對表達(dá)量低于癌旁正常組織[（0.612±0.137）和（1.679±0.286），t=31.021，P <0.001]，而RPN2 mRNA 在膠質(zhì)瘤組織中的相對表達(dá)量高于癌旁正常組織[（1.833±0.314）和（0.412±0.047），t=41.263，P <0.001]。膠質(zhì)瘤組織中RPN2 蛋白表達(dá)明顯高于癌旁正常組織[（1.112±0.247）和（0.423±0.044），t=5.752，P <0.001]。

2.2 miRNA-142-5p 與RPN2 mRNA 的相關(guān)性及相互作用預(yù)測

相關(guān)性分析顯示，miRNA-142-5p 與RPN2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.604，P ＜0.001）。RPN2 mRNA第596～621 堿基含有與miRNA-142-5p 互補(bǔ)結(jié)合位點。見圖1A。與RPN2 WT 組及RPN2 MUT+miRNA-142-5p mimic 組 比 較，RPN2 WT+miRNA-142-5p mimic 組的熒光素酶活性降低（P ＜0.05）。見圖1B。

圖1 miRNA-142-5p 靶向抑制RPN2 基因表達(dá)

2.3 臨床參數(shù)與miRNA-142-5p 和RPN2 mRNA 表達(dá)的關(guān)系

以癌組織中miRNA-142-5p 相對表達(dá)量的均值0.612 為界，分為高表達(dá)組42 例，低表達(dá)組43 例；以RPN2 的均值1.833 為界，分為高表達(dá)組41 例，低表達(dá)組44 例。不同卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分及世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分級膠質(zhì)瘤患者的miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05），不同年齡、性別、腫瘤直徑、侵犯腦葉數(shù)的膠質(zhì)瘤患者miRNA-142-5p、RPN2 mRNA 表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 臨床參數(shù)與miRNA-142-5p 和RPN2 mRNA 表達(dá)的關(guān)系（例）

2.4 miRNA-142-5p 與RPN2 mRNA 表達(dá)對預(yù)后的影響

隨訪1～36 個月，無失訪患者，死亡30 例。3 年總體生存率為64.7%（55/85），中位生存期為23.25（15.21，26.63）個月。miRNA-142-5p 低表達(dá)組中位生存期為18.21（14.21，25.63）個月，低于高表達(dá)組[26.10（19.34，33.15）個月]（log-rank χ2=9.247，P=0.038）。RPN2 高表達(dá)組患者中位生存期為19.30（15.07，26.21）個月，低于低表達(dá)組[25.60（17.19，32.54）個月]（log-rank χ2=8.226，P=0.010）。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的顱腦原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及復(fù)雜的分子機(jī)制。miRNA 是內(nèi)源基因編碼的長度為19～25 個核苷酸的單鏈RNA 分子，不僅在個體生長發(fā)育及凋亡等生理過程中發(fā)揮重要的作用，還參與心血管疾病、腫瘤等的病理學(xué)過程[10-13]。miRNA-142 基因位于17q22，能夠編碼產(chǎn)生具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的miRNA-142-5p，在癌癥、炎癥、免疫失調(diào)等方面起著關(guān)鍵作用[14-17]。本研究發(fā)現(xiàn)癌組織中miRNA-142-5p的表達(dá)明顯下調(diào)，且不同WHO 分級及KPS 評分患者miRNA-142-5p 表達(dá)不同，提示miRNA-142-5p 的低表達(dá)參與促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。Li 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-142-5p 的表達(dá)受到長鏈非編碼RNA LOXL1-AS1 的表達(dá)調(diào)控，LOXL1-AS1 能夠結(jié)合并抑制miRNA-142-5p 的表達(dá)及功能，腫瘤發(fā)生時LOXL1-AS1的過度表達(dá)導(dǎo)致miRNA-142-5p 水平降低，下游癌基因PIK3CA 過度活化，導(dǎo)致腫瘤惡性增殖及轉(zhuǎn)移。此外，miRNA-142-5p 低表達(dá)與患者不良生存預(yù)后有關(guān)?？赡苁且驗槟z質(zhì)瘤中miRNA-142-5p 表達(dá)降低導(dǎo)致下游腫瘤干性基因Sema3C 的異?；罨?，并且導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者的不良生存預(yù)后[19]。

RPN2 是高度保守的糖蛋白，位于粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，參與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運和結(jié)構(gòu)維持[20]。RPN2 蛋白是寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的一部分，能將新生甘露糖寡糖與新生多肽鏈的NXST 共有基序中的天冬酰胺殘基結(jié)合[21]。此外，研究顯示，RPN2 基因敲低可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡并抑制遷移和侵襲[22]。本研究結(jié)果顯示，癌組織中RPN2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平升高，并且與WHO 分級及KPS 評分有關(guān)，提示RPN2 可能作為一種致癌基因，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的疾病進(jìn)展。研究顯示，RPN2 通過介導(dǎo)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的糖基化，激活EGFR/ERK 信號通路的信號傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖，而RPN2 沉默通過EGFR 去糖基化降低了EGFR 向細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)運，抑制下游ERK 信號的傳導(dǎo)[23]。此外，癌組織中RPN2 的高表達(dá)提示患者不良生存預(yù)后?？赡苁且驗镽PN2 能夠促進(jìn)多藥耐藥基因編碼蛋白P-糖蛋白的糖基化，促進(jìn)P-糖蛋白的膜定位，促進(jìn)癌細(xì)胞對多西紫杉醇等化療藥物耐藥性形成，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[24-25]。本研究顯示miRNA-142-5p 與RPN2 在癌組織中呈負(fù)相關(guān)，同時，生信預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者存在相互結(jié)合的位點，提示兩者可能存在相互作用關(guān)系，熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)一步顯示膠質(zhì)瘤中RPN2受到miRNA-142-5p 的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。Ou 等[26]報道m(xù)iRNA-142-5p 與RPN2 在腫瘤中能夠共同調(diào)控EGFR 信號通路，兩者的表達(dá)具有協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。

綜上所述，膠質(zhì)瘤中miRNA-142-5p 表達(dá)下調(diào)，而RPN2 表達(dá)上調(diào)，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)，共同參與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展。