王 超， 孫維彤， 付 琳， 張向宇

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

0 引 言

高脂血癥是間接加速動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的原因之一，而內(nèi)皮細(xì)胞本身合成的膽固醇增加和血漿中的膽固醇堆積，會(huì)引發(fā)一種慢性炎癥[1]，這種慢性炎癥以及血管內(nèi)脂質(zhì)堆積引發(fā)的血流異常，均會(huì)引發(fā)人體局部的溫度略高于正常體溫。煙酸(nicotinic acid，NA)可以抑制脂甘油酯酶的活性，促進(jìn)血漿TG的水解，并減少VLDL向LDL的轉(zhuǎn)化[2]；辛伐他汀(simvastatin，SV)是還原酶抑制劑，抑制競(jìng)爭(zhēng)型膽固醇合成速度極限酶[3]。臨床上為避免單一藥物長(zhǎng)期或大量用藥后對(duì)患者身體的損傷，對(duì)煙酸類降脂藥物煙酸與他汀類的辛伐他汀的聯(lián)合研究逐漸深入。

溫度敏感性水凝膠[4-6]是可以在液態(tài)與固態(tài)兩相間轉(zhuǎn)變特性的藥物載體，低溫或常溫時(shí)呈現(xiàn)出流動(dòng)的液體，而注射入體內(nèi)后可以迅速凝膠化，且轉(zhuǎn)變過程具有可逆性[7-8]。本研究將常用的血脂調(diào)節(jié)藥物NA和SV作為模型藥物，用溫敏性藥物載體PLGA-PEG-PLGA構(gòu)建可以使藥物傳遞并滯留在炎癥發(fā)熱部、可注射型溫敏性載藥遞釋系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋效果，為降脂藥物新劑型的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

UV-2550紫外可見分光光度儀(島津儀器(蘇州)公司)；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器(上海力辰邦西儀器科技有限公司)；Hitachi7700型透射電鏡(日本日立公司)；Zetasizer Nano ZSE納米粒度電位儀(英國馬爾文公司)；TGL-16G-C高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Tecan Austria GmbH 5802自動(dòng)酶標(biāo)儀(Austria)；煙酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；辛伐他汀(湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)；聚丙交酯乙交酯-聚乙二醇-聚丙交酯乙交酯(濟(jì)南岱罡生物工程有限公司)；總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純

雄性SPF級(jí)SD大鼠72只，180～220 g，購買于長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，合格證編號(hào)：201900030428，許可證號(hào)碼：SCXK(吉)-2018-0007

1.2 NA-SV-PEP-HDs的制備

采用溶劑揮發(fā)法制備NA-SV-PEP-HDs，將一定量SV、PLGA-PEG-PLGA 200mg，與5 mL二氯甲烷充分溶解，形成有機(jī)相；另取水1 mL，加入煙酸(NA與SV的質(zhì)量比為25：1)，充分溶解形成水相。將水相以0.1mL/min勻速滴入高速旋轉(zhuǎn)的有機(jī)相中，室溫環(huán)境下繼續(xù)攪拌，除去有機(jī)溶劑。離心除去游離藥物后，過0.22 μm微孔濾膜，即得NA-SV-PEP-HDs溶液。同法制備SV-PEP-HDs。

1.3 分析方法的建立

1.3.1 NA分析方法的建立

線性曲線的繪制 取NA 0.0101 g，以水配成濃度為202 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成11.31,14.54,17.77,21.00,24.24,27.47,30.70 μg/mL的NA水溶液，依次檢測(cè)262 nm處吸光度，繪制NA的線性曲線。

精密度及回收率測(cè)定 配制低、中、高濃度NA溶液，檢測(cè)262 nm處吸光度，一日內(nèi)平行測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；同一時(shí)間連續(xù)測(cè)定5日，計(jì)算日間精密度。取NA標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加入0.5 mL空白PEP-HDs溶液，以水稀釋成低、中、高濃度的溶液，靜置。檢測(cè)262 nm處的吸光度A，計(jì)算回收率。

1.3.2 SV分析方法的建立

線性曲線的繪制 取SV 0.0105 g，用甲醇溶解，配成濃度為210 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別稀釋成7.56,9.42,10.92,12.60,14.28,15.96,17.64 μg/mL的SV甲醇溶液，依次檢測(cè)247 nm處吸光度，繪制SV的線性曲線。

精密度及回收率測(cè)定 配制低、中、高濃度SV溶液，檢測(cè)247 nm處吸光度，一日內(nèi)平行測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；同一時(shí)間連續(xù)測(cè)定5日，計(jì)算日間精密度。取SV標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加入0.5 mL空白PEP-HDs溶液，以甲醇稀釋成低、中、高濃度溶液，靜置。檢測(cè)247 nm處吸光度A，計(jì)算回收率。

1.4 包封率與載藥量的測(cè)定

采用離心濾膜過濾法測(cè)定包封率。取NA-SV-PEP-HDs溶液適量，10000 rpm離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜后，加適量乙腈超聲；取一份以甲醇稀釋，測(cè)定SV含量；再取一份以水稀釋，測(cè)定NA含量，按公式(1)(2)計(jì)算SV,NA包封率與載藥量。

(1)

(2)

其中，CSV-實(shí)測(cè)為實(shí)際測(cè)得NA-SV-PEP-HDs溶液中包封的SV的濃度，CSV-總為投入的SV的濃度；WSV為SV的總投藥量，WPEP為載體PEP的總質(zhì)量。CNA-實(shí)測(cè),CNA-總,WNA同理。

2 NA-SV-PEP-HDs的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1 NA-SV-PEP-HD透射電鏡觀察及粒徑分布、Zeta電位測(cè)定

根據(jù)最優(yōu)處方和工藝制得NA-SV-PEP-HDs，采用透射電子顯微鏡觀察其形貌；使用激光粒度分析儀測(cè)定NA-SV-PEP-HDs粒徑大小,PDI及Zeta電位。

2.2 體外溫敏性考察

采用試管傾斜法[9]進(jìn)行體外溫敏性考察。取儲(chǔ)存于4 ℃條件下的PEP-HDs,NA-SV-PEP-HDs各3 mL于試管中，將溫度計(jì)放入凝膠液面下三分之一處后，置于水浴鍋內(nèi)，緩慢升溫。每隔1 min將試管從水浴鍋中取出，將試管傾斜90°觀察凝膠溶液的狀態(tài)，當(dāng)溶液轉(zhuǎn)化為凝膠狀態(tài)時(shí)，此時(shí)的溫度為凝膠化溫度。

2.3 體外釋藥考察

采用無膜溶出法進(jìn)行體外釋放考察[10]。取“1.2”項(xiàng)下制備的NA-SV-PEP-HDs溶液6份各2 mL，置于西林瓶中，將其放入38±0.5 ℃,50 r/min的恒溫水浴振蕩器中，預(yù)熱10 min使凝膠溶液充分地凝膠化。沿西林瓶壁緩慢加入3.0 mL含0.5%Tween-80pH7.4 PBS的釋放介質(zhì)。分別于0,2,4,8,12,24,36,48 h后每隔1 d時(shí)，迅速倒出全部釋放介質(zhì)，另加入3.0mL等溫釋放介質(zhì)，連續(xù)15 d。采用UV法測(cè)定SV,NA的含量，繪制NA-SV-PEP-HDs的體外釋藥曲線。

2.4 體內(nèi)藥效學(xué)研究

2.4.1 動(dòng)物造模及給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將其隨機(jī)分為9組(n=8)：正常組(NC),模型組(MC),陽性組(PC),SV-PEP-HDs低(L-SV),中(M-SV)、高劑量組(H-SV),NA-SV-PEP-HDs低(L-NA)、中(M-NA)和高劑量組(H-NA)。NC組灌胃生理鹽水6.25 mg/(kg·d)，其它組灌胃等劑量高脂乳劑，兩周后，檢測(cè)是否造模成功。造模成功后，PC組注射藻酸雙酯鈉6.25 mg/kg/d；SV及NA-SV聯(lián)用低、中、高劑量組注射藥量分別為0.5,1,2 mg/(kg·d)和1,2,4 mg/(kg·d)；NC、MC組注射生理鹽水。

2.4.2 Lee’s、肝臟指數(shù)

末次給藥后，各組大鼠禁食24 h后進(jìn)行稱重，將大鼠注射4 %的水合氯醛0.35 mg/kg麻醉后，測(cè)定大鼠的體長(zhǎng)(鼻尖到肛門)；于大鼠腹主動(dòng)脈迅速取出5 mL血液；分離出肝臟并稱重。根據(jù)公式(3)，(4)計(jì)算，其中L為大鼠的體長(zhǎng)(cm)，m為大鼠的重量(g)，m1為肝重(g)。

(3)

(4)

2.4.3 肝臟組織病理學(xué)觀察

取肝臟左葉部分組織，固定于4 %多聚甲醛溶液。一部分組織包埋后切片，進(jìn)行HE染色；另取一部分進(jìn)行油紅O染色；采用電子顯微鏡，觀察肝臟病理切片中肝細(xì)胞有無脂肪性變、炎癥浸潤(rùn)或細(xì)胞病變。

2.4.4 血清血脂水平檢測(cè)

將凍存的血清在4 ℃冰箱中解凍24 h，再經(jīng)室溫緩沖30 min，采用單試劑COD-PAP和GPO-PAP法對(duì)TC與TG含量進(jìn)行測(cè)定，雙試劑直接法測(cè)定HDL-C與LDL-C含量。根據(jù)試劑盒說明操作，采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)的建立

(1)線性曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制NA和SV線性曲線方程，分別為A=0.0268C-0.0272，r=0.999，結(jié)果表明，NA在11.31～30.70μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；A=0.0416 C-0.036，r=0.999，結(jié)果表明，SV在7.56～17.64μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，如圖1所示。

圖1(a)煙酸的線性曲線 (b)辛伐他汀的線性曲線

(2)日內(nèi)精密度和日間精密度考察

實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)濃度NA溶液的日內(nèi)精密度RSD分別為1.15 %，0.75 %，0.64 %；日間精密度RSD分別為0.88 %，0.75 %，0.47 %日內(nèi)及日間精密度的RSD值均小于2 %，符合方法學(xué)的要求。

實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)濃度SV溶液的日內(nèi)精密度RSD分別為1.84 %，1.57 %，0.78 %；日間精密度RSD分別為1.97 %，1.38 %，0.62 %日內(nèi)及日間精密度的RSD值均小于2 %，符合方法學(xué)的要求。

(3)回收率考察

實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)濃度為14.54，21.00，27.47μg/mL的NA溶液的回收率分別為99.98 %，100.59 %，100.32 %，回收率高，RSD值分別為1.3 %，0.7 %，0.95 %小于2 %，符合方法學(xué)的要求。

實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)濃度為9.24，12.60，15.96μg/mL的SV溶液的回收率分別為100.47 %，100.13 %，100.06 %，回收率高，RSD值分別為1.03 %，0.73 %，0.56%小于2 %，符合方法學(xué)的要求。

3.2 NA-SV-PEP-HD透射電鏡觀察及粒徑分布、Zeta電位測(cè)定

NA-SV-PEP-HDs表面圓整類球形，未見團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑分布相對(duì)均一，且平均大小在100 nm以內(nèi)；平均粒徑為(61.8±1.47)nm，粒度分布呈單峰，PDI為(0.203±0.098)，平均電位為(-1.01±1.83)mV，如圖2所示。

圖2 (a)NA-SV-PEP-HDs透射電鏡掃描圖(b)NA-SV-PEP-HDs粒徑(c)電位

3.3 包封率和載藥量

計(jì)算得到3批NA-SV-PEP-HD中NA和SV的包封率為(95.8±0.50)%和(83.8±0.20)%，載藥量為(12.31±0.36)%和(0.45±0.02)%。

3.4 體外溫敏性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NA-SV-PEP-HDs對(duì)體外的溫度刺激響應(yīng)性較為靈敏，且具有可視性，如圖3所示。

圖3 體外溫敏性測(cè)定結(jié)果(n=6)

3.5 體外釋放

NA-SV-PEP-HDs中SV在前12 h內(nèi)釋放緩慢；12-48 h時(shí)釋放速率增加，累計(jì)釋放量達(dá)到30%；在216 h時(shí)，累計(jì)釋放量達(dá)到80%，最終大約有92.99%的SV釋放出來。相比SV而言，NA在第36 h有30%被釋放，此后釋放速率逐漸趨于平緩；第240 h時(shí)累計(jì)釋放量達(dá)到80%；最終累計(jì)釋放量為89.12%。實(shí)驗(yàn)表明，親水性藥物NA和疏水性藥物SV藥物的釋放緩慢，均無突釋效應(yīng)，說明NA-SV-PEP-HDs達(dá)到緩釋效果，如圖4所示。

圖4 NA-SIM-PPP-HDs在pH7.4 PBS

3.6 體內(nèi)藥效學(xué)研究

3.6.1 Lee’s,肝臟指數(shù)

與MC組相比，各治療組Lee’s指數(shù)均顯著降低；治療藥物對(duì)肝臟指數(shù)的影響極為明顯(P<0.0001)，且H-NA組最為顯著；說明藥物干預(yù)后，可有效緩解大鼠肥胖程度，如圖5所示。

圖5 (a)大鼠Lee’s指數(shù)測(cè)定結(jié)果(b)大鼠肝臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果(n=6)

3.6.2 肝臟組織病理學(xué)觀察

MC組大鼠肝臟顏色變淺、有明顯的增肥增大；MC組HE染色可見小葉結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂；油紅O染色中脂肪滴的減少尤為明顯。結(jié)果表明，高脂乳劑可成功建立高脂模型，通過藥物治療后，可逆性病變可以得到緩解，如圖6-8所示。

圖6 肝臟外觀(由左至右依次為正常組、模型組、治療組)

圖7 肝臟病理切片HE染色

圖8 肝臟病理切片油紅O染色

下的體外釋放情況(n=6)

3.6.3 血清血脂水平檢測(cè)

各治療組大鼠血清TC水平與MC組相比顯著降低(**P<0.01)；SV-PEP-HDs三劑量組TG均高于NA-SV-PEP-HDs對(duì)應(yīng)劑量組，且H-NA組血清TG值低于PC組(*P<0.05，**P<0.01)；相比MC組，PC,NA-SV-PEP-HDs三劑量組血清HDL-C水平均顯著升高(*P<0.05，**P<0.01)。NA-SV-PEP-HDs三劑量組對(duì)血清LDL-C水平降低作用顯著(*P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果表明，藥物干預(yù)各組對(duì)高脂血癥均有治療作用；且NA與SV聯(lián)合比SV單藥組的治療效果更好，如圖9所示。

圖9 (a)TC測(cè)定結(jié)果(b)TG測(cè)定結(jié)果

(由左至右依次為正常組、模型組、治療組)

(由左至右依次為正常組、模型組、治療組)

(c)HDL-C測(cè)定結(jié)果(d)LDL-C測(cè)定結(jié)果(n=6)

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑揮發(fā)法制備NA-SV-PEP-HDs，并對(duì)其進(jìn)行基本理化性質(zhì)的考察，證明體外溫度刺激響應(yīng)較為靈敏。體外釋放結(jié)果顯示NA-SV-PEP-HDs具有緩釋作用；高脂血癥模型組大鼠Lee’s指數(shù)均顯著升高，肝臟指數(shù)明顯減小，血脂水平出現(xiàn)異常，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，說明高脂乳劑可以成功建立大鼠高脂模型。與MC組相比，各藥物干預(yù)組大鼠的血清及肝勻漿液中TC,TG,LDL-C含量均有降低，HDL-C含量均有升高，表明SV-PEP-HDs和NA-SV-PEP-HDs對(duì)高脂血癥均有治療作用；且NA-SV-PEP-HDs對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)的改善作用更顯著于SV-PEP-HDs，說明雙載藥溫敏系統(tǒng)更有效的治療高脂血癥。