馬麗莎，尹 怡，田 斐，謝文平，單 奇，鄭光明，李麗春，劉書貴，戴曉欣，趙 城，魏琳婷，林嘉薇

1. 中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外來入侵水生生物防控重點實驗室/廣東省水產(chǎn)動物免疫技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510380

2. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州 510300

撲草凈 (Prometryn) 屬三嗪類除草劑，曾廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動[1]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于清除水草和有害藻類[2]。但撲草凈會引起生物機體的內(nèi)分泌紊亂、腫瘤產(chǎn)生等不良危害[3-4]。因此，歐盟自2004年1月1日起，禁止撲草凈作為農(nóng)藥在歐盟銷售及使用[5]，美國僅將撲草凈作為除草劑使用，并制定了胡蘿卜等19種植物中撲草凈的最大殘留限量[6]，中國也于2010年在中華人民共和國公告1 435中將其列入《獸藥試行標準廢止目錄》，但當前仍有撲草凈違規(guī)使用等問題，近年來中國養(yǎng)殖水產(chǎn)品中多次檢出撲草凈殘留[7-9]；2020年的“山東省海參事件”更將撲草凈污染問題推向食品安全的風口浪尖，對此中國迅速開展“海參養(yǎng)殖中違法使用撲草凈和甲氰菊酯兩種農(nóng)藥專項整治行動”；2021年，撲草凈被正式納入“國家產(chǎn)地水產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控計劃”，由原無公害漁業(yè)產(chǎn)品認證分中心牽頭的水產(chǎn)品中撲草凈殘留隱患排查的專項行動也已開展[7]，可見水產(chǎn)品中撲草凈殘留問題已引起社會的高度關注。

當前有關水產(chǎn)品中撲草凈的檢測方法較少，更無相關的檢測標準?，F(xiàn)行標準SN/T 1968—2007《進出口食品中撲草凈殘留量檢測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》適用于食品中撲草凈的檢測，但該標準適用范圍并不包括水產(chǎn)品，且方法采用串聯(lián)固相萃取柱凈化樣品，完成一次前處理需10 h，存在有機溶劑消耗量大、操作繁瑣、耗時、工作效率低等缺點，不利于樣品批量化檢測。朱曉華等[10]建立的水產(chǎn)品中撲草凈殘留固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法雖可用于魚、蝦及紫菜中撲草凈的檢測，但并不涉及海參及雙殼貝類等重點品種，且同樣存在前處理操作繁瑣的問題；報道的其他檢測方法，更只涉及一種或兩種水產(chǎn)品[11-13]。由于水產(chǎn)品種類繁多，基質(zhì)差異大，若直接采用文獻報道的方法可能得不到理想的萃取效率。鑒于目前中國水產(chǎn)品已出現(xiàn)因撲草凈超標而被廢棄或退貨的現(xiàn)象[14]，故為保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全，維護大國形象，避免貿(mào)易壁壘，丞需建立適用于多種水產(chǎn)品中的撲草凈快速篩查方法。

撲草凈的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法 (GC-MS) 和液相色譜-質(zhì)譜法 (HPLC-MS-MS)等[10-13,15-17]，其中液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀價格昂貴，而氣相色譜-質(zhì)譜儀價格相對適中，因此GC-MS更易于普及。當前，創(chuàng)新開發(fā)快速、精準的篩查方法是食品檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢。QuEChERS法利用基質(zhì)分散萃取機理來吸附樣品中的雜質(zhì)，達到保留目標物和凈化樣品的目的，其與傳統(tǒng)固相萃取法相比，具有快速、簡單、廉價及適用范圍廣等優(yōu)點[18]，因此被廣泛用于蔬菜[19-20]、畜禽[21-22]及水產(chǎn)品[23-25]等食品中藥物殘留檢測的前處理。本文結(jié)合QuEChERS法及GC-MS技術(shù)的優(yōu)點，針對多種水產(chǎn)品 [草魚 (Ctenopharyngodon idellus)、鱖(Siniperca chuatsi)、中國對蝦 (Penaeus chinensis)、海參(Holothuriasp.) 和文蛤 (Meretrix meretrix)]的檢測需求，建立了撲草凈殘留的快速檢測方法。該方法與行業(yè)標準SN/T 1968—2007相比，完成一次前處理僅需2 h，極大提高了檢測效率，具有普及性強、適用范圍廣、有機溶劑損耗少、操作簡單、高效、價格低廉等優(yōu)點。方法的建立對撲草凈在養(yǎng)殖水產(chǎn)品中違禁使用的監(jiān)管監(jiān)測、水產(chǎn)品中撲草凈殘留檢測標準的制定及開展撲草凈在水生生物體內(nèi)的降解代謝、安全性評價等研究工作提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支撐，有助于促進我國水產(chǎn)品質(zhì)量提升和擴大出口需求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀[配電子轟擊源 (EI)，美國安捷倫]；AIKA MS3 basic 渦旋振蕩儀 (德國IKA)；TDL-5-A飛鴿牌離心機 (上海安亭)；氮吹儀 (美國organomation)。

撲草凈 (純度 99%)、D6-撲草凈 (質(zhì)量濃度 100 mg·L?1，德國Dr. Ehrenstorfor公司)；乙腈、二氯甲烷 (色譜純，美國霍尼韋爾)；乙二胺-N-丙基硅烷PSA、石墨化炭黑GCB、中性氧化鋁Alumina-N (美國Agela)；納米二氧化鋯(上海麥克林)；無水硫酸鈉 (Na2SO4)、氯化鈉 (NaCl，分析純，廣州化學試劑廠)。

1.2 標準溶液的配制

1.2.1 標準儲備溶液

稱取適量的撲草凈標準物質(zhì)用乙腈溶解，配制成1 000 mg·L?1的標準儲備液，使用時用乙腈稀釋成 1 mg·L?1的標準使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 內(nèi)標儲備溶液

移取適量的D6-撲草凈標準溶液，用乙腈溶解配制成10 mg·L?1的內(nèi)標儲備液，使用時用乙腈稀釋成 1 mg·L?1的標準使用液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 標準曲線的配制

用乙腈稀釋標準使用液配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、20、80、100 和 200 μg·L?1的系列標準曲線工作液，內(nèi)標工作液質(zhì)量濃度為 80 μg·L?1，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品處理方法

1.3.1 樣品制備

魚、海參取肌肉可食部分，文蛤、對蝦去殼取可食部分，均質(zhì)后 ?20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取

魚、蝦、文蛤：稱取 (5±0.01) g 樣品于 50 mL 離心管中，加入內(nèi)標儲備液 40 μL，8 mL 去離子水，渦旋 30 s，加入 12 mL 乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2)，渦旋 2 min，加入 1 g NaCl和 6 g 無水 Na2SO4，渦旋 1 min，5 000 r·min?1離心 5 min，取上清液于 25 mL 比色管中，重復提取 1 次，合并上清液并用乙腈定容至刻度線，混勻。

海參：稱取 (5±0.01) g 樣品于 50 mL 離心管中，加入內(nèi)標儲備液 40 μL，加入 12 mL 乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2)，渦旋 2 min，加入 5 g 無水 Na2SO4，渦旋 1 min，5 000 r·min?1離心 5 min，取上清液于 25 mL 比色管中，重復提取 1 次，合并上清液并定容至刻度線，混勻。

1.3.3 凈化

分取上清液5 mL，于50 ℃水浴氮吹至干，1 mL乙腈定容，將定容液于2 mL離心管中，加入200 mg中性氧化鋁、200 mg 二氧化鋯、50 mg PSA 及 20 mg GCB，漩渦震蕩 1 min，以 10 000 r·min?1離心 5 min，取上清液，供 GCMS檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜柱

HP-5MS 柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始柱溫 70 ℃，保持 1 min，以 25 ℃·min?1升至 180 ℃，以5 ℃·min?1升至 220 ℃，以 15 ℃·min?1升至 280 ℃，保持3 min。高純氦氣載氣，流速 1.0 ℃·min?1；進樣口溫度260 ℃；不分流進樣；進樣體積1 μL。

1.4.2 質(zhì)譜

電離方式為EI源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；輔助加熱溫度280 ℃；檢測方式選擇離子監(jiān)測模式 (SIM)，溶劑延遲3 min，監(jiān)測離子(m/z)：撲草凈為 m/z 184、m/z 199、m/z 226、m/z 241，其中 m/z 241 為定量離子，D6-撲草凈為 m/z 190、m/z 205、m/z 232、m/z 247，其中 m/z 247 為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為獲得較佳的峰型、靈敏度及分離效果，實驗以標準工作液0.2 mg·L?1，從進樣口溫度、流速等方面優(yōu)化色譜條件。進樣口是樣品完成氣化的地方，其溫度顯著影響目標物靈敏度、重現(xiàn)性及峰型。溫度過低，目標物氣化速度慢，靈敏度低、重現(xiàn)性差，樣品峰擴展；溫度過高可導致目標物分解，靈敏度下降。通過實驗，發(fā)現(xiàn)進樣口溫度為260 ℃時，目標物靈敏度、重現(xiàn)性均最佳，峰型尖銳；進樣口溫度為250和270 ℃時，目標物靈敏度均低于260 ℃時的靈敏度 (圖1)。因此，本文確定最佳進樣口溫度為 260 ℃。

圖1 進樣口不同溫度對撲草凈靈敏度的影響Fig. 1 Effect of different temperatures of injection port on sensitivity of prometryn

此外，流速過低會使樣品峰擴展，流速過高，目標物與雜質(zhì)得不到較好分離，通過實驗，本文確定最佳流速為1.0 mL·min?1。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

在m/z介于50～550內(nèi)進行全掃描，確定各組分的保留時間和特征離子。為降低干擾、提高靈敏度，采用選擇離子監(jiān)測模式，每個化合物選擇1個定量離子、3個定性離子。撲草凈及D6-撲草凈的定性與定量離子見1.4儀器條件，撲草凈保留時間為11.057 min，D6-撲草凈保留時間為11.009 min。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

乙腈具有穿透力強可沉淀蛋白并對脂類干擾物溶解度小的優(yōu)點，是多數(shù)農(nóng)藥萃取首選的提取液[23,26]，撲草凈屬中等極性化合物[27]與乙酸乙酯極性相近，故實驗選用草魚樣品比較上述兩種溶劑對撲草凈的萃取效果。結(jié)果顯示，采用乙酸乙酯提取目標物時基線噪音大、雜峰多，這是由于乙酸乙酯具有較強的脂溶性，其溶解了樣品中大量脂肪，表現(xiàn)為乙酸乙酯提取液氮吹后玻璃管壁附有一層淡黃色油脂 (圖2)，導致樣品的后續(xù)凈化不徹底，彭捷等[28]也指出乙酸乙酯能溶解水產(chǎn)品中大量脂肪，給后續(xù)凈化增加了困難。而草魚中直接加入乙腈后其表面凝結(jié)成團，阻礙了乙腈與樣品接觸，回收率僅為45.8%。水緩沖劑可提高樣品分散性[29]，故實驗先用去離子水分散樣品再用乙腈提取撲草凈，回收率提升至80%左右，但仍偏低，分析回收率偏低的原因可能與乙腈極性較強有關。鑒于此，實驗采用二氯甲烷混合乙腈的方式降低提取液極性，結(jié)果表明，乙腈-二氯甲烷 (V∶V=6∶4)、乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液的提取效率均優(yōu)于乙腈，回收率在90%左右(圖3)，但乙腈-二氯甲烷 (V∶V=6∶4) 對樣品脂肪的提取效率大，提取液顏色偏黃。

圖2 不同提取溶劑提取效果的比較Fig. 2 Comparison of extraction effects of different extraction solvents

圖3 不同提取溶劑對撲草凈回收率的影響Fig. 3 Effects of differents extraction solvent on recoveries of prometryn

然而當實驗采用乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液萃取海參樣品中撲草凈殘留時發(fā)現(xiàn)，海參樣品與去離子水渦旋后，表面形成了一層乳白色膠狀物，這層膠狀物是海參樣品中的膠原蛋白與水形成的膠凍，膠凍阻礙了提取液與樣品的接觸，導致萃取效率下降，故海參樣品前處理時不可加入去離子水。實驗又比較了乙腈、乙腈-二氯甲烷 (V∶V=6∶4)、乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液對海參中撲草凈的提取效率，結(jié)果顯示 (圖3)，乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液是提取海參中撲草凈的最佳提取劑。

因此實驗選擇乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2) 溶液作為水產(chǎn)品中撲草凈殘留的提取溶劑。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化

實驗涉及的水產(chǎn)品種類豐富，包括魚、蝦、海參及貝類，基質(zhì)差異大，包含脂肪、蛋白、磷脂、碳水化合物、有機酸、色素等雜質(zhì)，僅使用一種吸附劑很難兼顧全部水產(chǎn)品基質(zhì)的凈化。QuEChERS方法能快速高效地去除水產(chǎn)品中各類雜質(zhì)，常用的吸附劑有PSA、石墨化炭黑 (GCB)、二氧化鋯、C18粉、中性氧化鋁及佛羅里硅土等[22-23,25,30-31]，其中PSA能吸附提取液中的極性物質(zhì)、有機酸及金屬離子等雜質(zhì)，GCB去除色素、甾醇等，二氧化鋯去除磷脂，由于C18粉、中性氧化鋁及佛羅里硅土均可去除脂肪等干擾物，因此實驗先比較了C18粉、中性氧化鋁及佛羅里硅土的凈化效果，以篩選出三者中凈化效果最佳的吸附劑。提取離子色譜圖 (圖4) 顯示，中性氧化鋁粉對5種水產(chǎn)品基質(zhì)的凈化能力均最佳，表現(xiàn)為雜質(zhì)干擾峰少、基線平整，佛羅里硅土的凈化能力一般，C18粉最差。

圖4 3種吸附劑凈化效果的比較Fig. 4 Comparison of purification effects of three adsorbents

之后實驗采用中性氧化鋁、PSA、二氧化鋯及GCB共同凈化樣品，并比較了PSA (50、100和150 mg)、中性氧化鋁 (100、150 和 200 mg)、二氧化鋯 (100、150 和 200 mg)、GCB (10、15、20、25 和 30 mg) 不同用量、不同組合對回收率的影響，發(fā)現(xiàn)上述吸附劑對撲草凈均無吸附，但分散劑的不同配比可影響提取液的凈化效果及方法精密度。當PSA為50 mg、GCB為20 mg時，色譜圖基線干擾及方法精密度隨中性氧化鋁及二氧化鋯加入量增加而減小，加入量為200 mg時達最佳；當中性氧化鋁為200 mg、二氧化鋯為 200 mg、GCB 為 20 mg 時，50 mg PSA 的加入量已能獲得較好的凈化效果；當中性氧化鋁為200 mg、二氧化鋯為200 mg、PSA為50 mg時，提取液的顏色隨GCB含量的增加變淺，加入量為20 mg時，提取液中色素被完全吸附。實驗最終確定復合吸附劑組合為中性氧化鋁200 mg+二氧化鋯 200 mg+PSA 50 mg+GCB 20 mg，并將其用于水產(chǎn)品中撲草凈殘留的加標回收實驗，獲得了滿意的回收率 (85.8%～111.8%)及較好的凈化效果，如蝦提取液經(jīng)復合吸附劑凈化后，溶液變得清澈透亮，色譜圖干擾峰顯著減少，基線噪音變小、較平整 (圖5)。

圖5 蝦已凈化與未凈化基質(zhì)的提取離子色譜圖比較Fig. 5 Comparison of extracted ion diagrams of purified and unpurified shrimp

2.4 方法驗證

2.4.1 基質(zhì)效應

質(zhì)譜在電離和掃描過程中存在基質(zhì)效應，為考察撲草凈在蝦、草魚、鱖、海參、文蛤5種水產(chǎn)品中的基質(zhì)效應，實驗配制濃度為100 μg·L?1的基質(zhì)標樣，與同等濃度的溶劑標準溶液進行對比測定，依照公式ME=(Aι)基質(zhì)標樣/(Aι)溶液標樣(Aι為撲草凈的峰面積) 計算基質(zhì)效應[30]。若ME>1，表示基質(zhì)對分析物的響應產(chǎn)生增強效應；若ME<1，表示基質(zhì)對分析物的響應產(chǎn)生抑制效應；若ME=1，表示不存在基質(zhì)效應。當ME介于0.8～1.2時，基質(zhì)干擾程度較低；當0.51.5，表示干擾強烈[32]。結(jié)果表明，5種水產(chǎn)品基質(zhì)的基質(zhì)效應介于0.91～0.96，表明水產(chǎn)品基質(zhì)對撲草凈響應干擾程度較低，說明該方法對水產(chǎn)品基質(zhì)的凈化效果良好。

2.4.2 線性范圍、檢出限與定量限

按1.2配制標準曲線，在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下測定分析，以目標物定量離子峰面積和相應內(nèi)標物定量離子峰面積之比 (y) 為縱坐標，以目標物濃度 (x) 為橫坐標，繪制標準曲線，實驗分別以3倍信噪比 (S/N≥3) 和10 倍信噪比 (S/N≥10) 確定方法的檢出限 (LOD) 和定量限 (LOQ)。結(jié)果為撲草凈質(zhì)量濃度介于 5～200 μg·L?1，線性良好，線性方程為y=0.013 1x+0.027 9，線性相關系數(shù) (R2) 為0.999 9，檢出限為 5 μg·kg?1，定量限為 10 μg·kg?1；方法檢出限低于SN/T 1968—2007 《進出口食品中撲草凈殘留量檢測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》的檢出限 (10 μg·kg?1)，低于日本規(guī)定的水產(chǎn)品中撲草凈殘留 10 μg·kg?1的基準值[7]，同時與朱曉華等[10]建立的水產(chǎn)品中撲草凈殘留固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相比，本研究建立的方法減少了有機溶劑的用量，具有操作簡單、高效、價格低廉，樣品完成一次前處理僅需2 h，適用于批量樣品的檢測。

2.5 精密度與回收率

選擇對蝦、草魚、鱖、海參、文蛤開展加標回收實驗。草魚為草食性魚類含脂量低，鱖為肉食性魚類含脂量高，對蝦含大量色素，而海參、貝類是目前撲草凈監(jiān)測重點關注的水產(chǎn)品且與魚、蝦基質(zhì)差異較大，表明實驗所選品種有較好的代表性。向?qū)嶒灅悠分蟹謩e添加10、20、40和200 μg·kg?1的撲草凈標準溶液，每個添加水平設6個平行，并做空白實驗，計算回收率和相對標準偏差，方法加標回收率為85.8%～111.8%，相對標準偏差為1.2%～8.8%，說明方法的準確度與精密度較好，能滿足國標GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》中實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 (表1)。就方法適用范圍而言，行標SN/T 1968—2007適用范圍不包括水產(chǎn)品，而目前報道的撲草凈檢測方法[11-13]存在水產(chǎn)品覆蓋面不全、應用性不強等不足，本研究建立的方法不僅涵蓋5種不同基質(zhì)類型的水產(chǎn)品，還包含國家重點檢測的水產(chǎn)品種，具有適用范圍廣的優(yōu)點，可滿足我國水產(chǎn)品質(zhì)量安全的監(jiān)測需求。

表1 水產(chǎn)品中撲草凈的加標回收率和相對標準偏差 (N=6)Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of aquatic product (N=6)

2.6 實際樣品

將建立的方法用于30份水產(chǎn)品中撲草凈檢測，其中15份養(yǎng)殖水產(chǎn)品采集于廣西、湖南、福建等地的農(nóng)貿(mào)市場，15份捕撈水產(chǎn)品采集于中國南海海域，檢測結(jié)果顯示：養(yǎng)殖水產(chǎn)品中無撲草凈檢出，捕撈水產(chǎn)品中有2份樣品檢出撲草凈，分別為脊尾白蝦 (Palaemon carinicauda,20.4 μg·kg?1) 和僧帽牡蠣 (Ostrea cucullate, 24.3 μg·kg?1，圖6)。據(jù)有關報道，撲草凈在中國長江、黃河等重點流域水體[33]及熱帶海域海南[34]亦有不同程度的檢出，表明中國部分自然水域已受到撲草凈殘留的影響，可能對水生生物健康和水產(chǎn)品質(zhì)量安全產(chǎn)生潛在威脅，因此建議進一步加強撲草凈環(huán)境殘留及捕撈水產(chǎn)品殘留的監(jiān)控。

圖6 僧帽牡蠣樣品提取離子色譜圖Fig. 6 Extracted ion chromatograms of S. cucullata

3 結(jié)論

本實驗建立了快速檢測水產(chǎn)品中撲草凈殘留的QuECh-ERS-氣相色譜-質(zhì)譜法。方法用乙腈-二氯甲烷 (V∶V=8∶2)混合溶液提取，提取液經(jīng)吸附劑中性氧化鋁、N-丙基乙二胺 (PSA)、納米二氧化鋯結(jié)合石墨化炭黑 (GCB) 凈化后上機檢測，內(nèi)標法定量，加標回收率為85.8%～111.8%，相對標準偏差為 1.2%～8.8%，檢出限為 5 μg·kg?1，定量限為 10 μg·kg?1。方法可滿足草食性魚類、肉食性魚類、蝦類、海參及貝類中撲草凈殘留的檢測需求，具有操作簡便、回收率高、重復性好等優(yōu)點，可實現(xiàn)水產(chǎn)品中撲草凈殘留的批量化檢測，有利于撲草凈殘留風險監(jiān)測、預警及評估項目的開展。