許 鋒，陳得科，陳曉剛，聶金梅，馬志浩，孫恢禮，陳 忻

1. 佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 佛山 528000

2. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301

3. 佛山市安安美容保健品有限公司，廣東 佛山 528000

臭氧層是地球的天然紫外線(xiàn)屏障，70%～90%的高強(qiáng)度紫外線(xiàn)輻射都被其吸收，使地球上的生物能夠在不受紫外線(xiàn)傷害的情況下得以生存和繁衍[1-2]。近年來(lái)由于人類(lèi)活動(dòng)的影響，大氣臭氧層不斷遭到破壞，導(dǎo)致到達(dá)地球表面的紫外線(xiàn)不斷增強(qiáng)，對(duì)地球氣候、生態(tài)環(huán)境、尤其是人類(lèi)健康的影響很大，比如白內(nèi)障、皮膚癌等的發(fā)病率大幅增加[3-5]。因此，人們一般通過(guò)涂抹含紫外線(xiàn)屏蔽劑的護(hù)膚品來(lái)降低其對(duì)人體的傷害。目前，護(hù)膚品中添加的紫外線(xiàn)吸收劑一般均為人工合成的化學(xué)物質(zhì)，如水楊酸衍生物、對(duì)氨基苯甲酸類(lèi)、肉桂酸、滑石粉、金屬氧化物等，它們雖然可以抵御紫外線(xiàn)，但很容易堵塞毛孔，損害皮膚甚至導(dǎo)致皮膚過(guò)敏[6-7]。天然抗紫外線(xiàn)物質(zhì)可吸收照射至真皮層中的紫外線(xiàn)，以保護(hù)真皮層中的膠原和彈性蛋白，具有無(wú)毒無(wú)刺激等優(yōu)點(diǎn)，還具備清除氧自由基、延緩皮膚衰老等功效，因此對(duì)天然的抗紫外線(xiàn)活性物質(zhì)的研究成為新的研究熱點(diǎn)[8-18]。

類(lèi)菌胞素氨基酸 (Mycosporine-like amino acids,MAAs) 作為天然的紫外吸收劑，最初由Leach于1965年在真菌中首次發(fā)現(xiàn)[19]。MAAs是以環(huán)己烯酮為基本骨架，與不同類(lèi)型氨基酸通過(guò)胺縮合作用形成的一大類(lèi)小分子、水溶性化合物[20]。由于共軛雙鍵和側(cè)鏈上不同活性基團(tuán)的影響，在310～360 nm的紫外光區(qū)MAAs具有很強(qiáng)的吸收能力[21]。MAAs吸收紫外光后，會(huì)以熱的形式散發(fā)，而不分解產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)，因此是安全無(wú)害的防輻射劑[22]。此外，MAAs化合物具有較高的摩爾吸收率，能減少紫外線(xiàn)對(duì)細(xì)胞的損傷[23]，因此在作為化妝品中的防輻射劑方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。目前從海洋生物中發(fā)現(xiàn)了約29種MAAs[24]。MAAs主要存在于紅藻和褐藻中，其中紅藻門(mén)的含量最多[25-26]。但目前針對(duì)MAAs的研究主要集中于提取工藝優(yōu)化、生物活性等方面[27-29]，對(duì)其在化妝品體系中的穩(wěn)定性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以中國(guó)南方資源豐富的壇紫菜 (Porphyrahaitanensis) 為原料，從中提取抗紫外輻射物質(zhì)MAAs，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定MAAs的種類(lèi)，并探究了pH、光照、溫度以及化妝品中各種添加劑對(duì)壇紫菜MAAs化合物穩(wěn)定性的影響，為該類(lèi)物質(zhì)用作護(hù)膚品的抗紫外輻射添加劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

壇紫菜購(gòu)于福建省古田松田商貿(mào)有限公司；尼泊金甲酯、維生素A、維生素E、膠原蛋白、卡松、乙內(nèi)酰脲 (DMDMH)、丁羥甲苯 (BHT)、透明質(zhì)酸、甘油均由佛山市安安美容保健品有限公司提供，化妝品級(jí)；小分子肽由中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所提供，分子量≤3 000 D；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、磷酸、磷酸氫二鈉、鹽酸均為國(guó)產(chǎn)分析純，甲醇為色譜純。

UV2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (日本島津)；N-1210BV-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (埃朗科技)；LGJ-10冷凍干燥機(jī) (上海精科)；SHZ-82A水浴恒溫振蕩器 (新瑞儀器)；GHP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒)；LCQ Deca XP MAX 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)Thermo)；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) (湖南湘儀)；BJ-800A多功能粉碎機(jī) (拜杰)；PHS-3C精密pH 計(jì) (上海雷磁)；BSA224S-CW 分析天平 (賽多利斯)；RCT基本型加熱磁力攪拌 (IKA)。

1.2 MAAs化合物的提取和鑒定

1.2.1 原料預(yù)處理

將壇紫菜用攪拌機(jī)粉碎后，經(jīng)20～60目篩過(guò)篩后備用。

1.2.2 壇紫菜中 MAAs的提取[30]

取經(jīng)預(yù)處理的壇紫菜原料，加入去離子水提取(提取溫度45 ℃，提取時(shí)間2 h，料液質(zhì)量比為1∶8，初始pH為2)，離心收集上層清液，加入無(wú)水乙醇，調(diào)節(jié)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，在?20 ℃下冷凍浸沉6 h，以除去其中的核酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后經(jīng)離心、旋蒸、冷凍干燥后得到粗產(chǎn)品。

1.2.3 MAAs 化合物種類(lèi)的確定

取少量?jī)龈僧a(chǎn)品經(jīng)去離子水溶解定容后，于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在200～780 nm的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4 MAAs化合物含量的確定

通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，確定提取液中MAAs化合物的含量及相對(duì)分子量。液相色譜的條件為：ODS-C18 色譜柱 (5 μm，250×4 mm I.D)；流動(dòng)相：A相色譜純甲醇，B相乙酸體積分?jǐn)?shù) 0.2% (體積比 A∶B=10∶90)；流速 1.0 mL·min?1；柱溫 25 ℃；進(jìn)樣量 1 μL。

1.3 MAAs化合物穩(wěn)定性的研究

1.3.1 pH 對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

配置 0.2 mol·L?1的磷酸鹽緩沖溶液， 用 0.1 mol·L?1的氫氧化鈉溶液和磷酸調(diào)節(jié)pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，加入MAAs化合物使質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%，分別測(cè)試其在334 nm處的吸光度。

1.3.2 光照對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的MAAs水溶液分別置于紫外燈箱、自然光室內(nèi)和暗室中，每隔1 h取樣測(cè)試其在334 nm處的吸光度。

1.3.3 溫度對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的MAAs水溶液 (含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.2% 卡松、防腐劑) 分別置于?20、25、48 ℃中56 d，定期取樣測(cè)試其在334 nm處的吸光度。

1.3.4 防腐劑對(duì) MAAs 化合物穩(wěn)定性的影響

將3份質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的MAAs水溶液分別加入卡松 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%)、尼泊金甲酯 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%)、DMDMH (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%)，再分成2份后，分別置于25和48 ℃下56 d，定期取樣測(cè)試其在334 nm處的吸光度。

1.3.5 抗氧化劑對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

將2份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的MAAs水溶液 (含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%卡松) 分別加入不同抗氧化劑BHT(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.3%) 和維生素 E (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%)，再分成2份后，分別置于25和48 ℃下56 d，定期取樣測(cè)試其在334 nm處的吸光度。

1.3.6 功能性添加劑對(duì)MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

將5份質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的MAAs水溶液 (含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%卡松、防腐劑) 分別加入不同功能性添加劑透明質(zhì)酸 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%)、甘油 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%)、膠原蛋白 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%)、小分子肽 (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%)、維生素A (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%)，再分成2份后，分別置于25和48 ℃下56 d，定期取樣測(cè)試其在334 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 MAAs化合物種類(lèi)和含量的確定

2.1.1 MAAs 提取液的定性分析

MAAs的定性一般是通過(guò)MAAs的特征吸收波長(zhǎng)來(lái)初步判斷。圖1為壇紫菜提取液于波長(zhǎng)200～780 nm處的掃描圖譜。可以看出，提取液的紫外最大吸收波長(zhǎng)λmax=334 nm。MAAs化合物中Porphyra-334和Shionrine兩者的最大吸收波長(zhǎng)均為λmax=334 nm[31]，由此可推測(cè)壇紫菜中含有的MAAs化合物可能為Porphyra-334和Shionrine。由于所提取的粗產(chǎn)品沒(méi)有經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的純化，可能含有色素等雜質(zhì)，因此在200 nm處出現(xiàn)1個(gè)吸收峰。

圖1 壇紫菜 MAAs提取液的紫外掃描圖譜Fig. 1 UV scanning spectrum of MAAs extracted from P. haitanensis

2.1.2 壇紫菜提取液的定量分析

壇紫菜提取液經(jīng)過(guò)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，得到總離子流圖 (圖2)，具體參數(shù)見(jiàn)表1。壇紫菜提取液中Porphyra-334和Shinorine對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間為4.326和6.095 min (圖2)，各峰對(duì)應(yīng)的峰面積占比分別為19.529%和19.911% (表1)，即壇紫菜提取液含MAAs化合物Shinorine和Porphyra-334的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為20%，因此提取液中MAAs化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為40%。

圖2 壇紫菜 MAAs提取液的總離子流圖Fig. 2 Total ion current (TIC) spectrum of MAAs extracted from P. haitanensis

表1 總離子流圖的具體峰參數(shù)Table 1 Specific peak parameters of total ion chromatogram

對(duì)圖2中的峰1含有的化合物A和峰2含有的化合物B進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到其一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖 (圖3)?；衔顰對(duì)應(yīng)的核質(zhì)比為347，化合物B對(duì)應(yīng)的核質(zhì)比為333，結(jié)合前面紫外可見(jiàn)光譜定性分析的結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)[32]，可以確定壇紫菜提取液中含有2種MAAs類(lèi)化合物，化合物A為Porphyra-334，化合物B為Shinorine。

圖3 化合物質(zhì)譜圖注：a. 化合物 A 一級(jí)質(zhì)譜圖；b. 化合物 A 二級(jí)質(zhì)譜圖；c. 化合物 B 一級(jí)質(zhì)譜圖；d. 化合物 B 二級(jí)質(zhì)譜圖。Fig. 3 Mass spectrum of compoundNote:a. Primary mass spectrum of Compound A; b. Secondary mass spectrum of Compound A; c. Primary mass spectrum of Compound B; d. Secondary mass spectrum of Compound B.

2.2 MAAs化合物穩(wěn)定性研究結(jié)果

2.2.1 pH 對(duì) MAAs 化合物穩(wěn)定性的影響

圖4-a為pH對(duì)壇紫菜MAAs化合物吸光度的影響。壇紫菜MAAs化合物在微酸性 (pH=6) 下具有最大的吸光度，說(shuō)明此條件下壇紫菜MAAs化合物的濃度最高、穩(wěn)定性最好。在酸性和堿性條件下穩(wěn)定下較差，隨著酸度或堿度的增大，吸光度逐漸下降，說(shuō)明穩(wěn)定性也不斷下降。因此，在儲(chǔ)存和制備MAAs化合物時(shí)應(yīng)盡量避免過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境，以保證MAAs化合物的穩(wěn)定存在。

圖4 pH (a)、光照 (b) 和溫度 (c) 對(duì)MAAs化合物穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effects of pH (a), light (b) and temperature (c) on stability of MAAs

2.2.2 光照對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

圖4-b為不同光源紫外、室內(nèi)自然光和避光下壇紫菜MAAs化合物吸光度隨時(shí)間變化的結(jié)果。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在不同光源的照射下，MAAs化合物的吸光度均呈下降趨勢(shì)。尤其是紫外燈照射10 h后溶液吸光度由0.991減至0.055，降低了94.4%，而自然光照射10 h吸光度降至0.883，下降10.9%，暗室保存10 h后吸光度仍能保持在0.905，僅下降8.7%，這說(shuō)明紫外燈直射對(duì)MAAs化合物有明顯的破壞作用，自然光存在的條件下，也能稍微加速M(fèi)AAs化合物的分解，但影響不大。因此MAAs化合物在儲(chǔ)存的過(guò)程中應(yīng)該盡量放置在暗室避光處。

2.2.3 溫度對(duì) MAAs 化合物穩(wěn)定性的影響

圖4-c為不同溫度下壇紫菜MAAs化合物吸光度在56 d內(nèi)變化的結(jié)果。?20 ℃下MAAs化合物的吸光度基本上保持不變，可以穩(wěn)定存在，在常溫下保存56 d吸光度下降了9.4%，而在48 ℃下保存56 d吸光度下降了28.3%，說(shuō)明壇紫菜中MAAs化合物的吸光度隨著溫度的升高下降越明顯，穩(wěn)定性隨著溫度的升高而降低。因此，低溫更有利于MAAs化合物的存放。

2.2.4 防腐劑對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

圖5為壇紫菜MAAs化合物在加入化妝品中3種常用的防腐劑卡松、尼泊金甲酯和DMDMH放置56 d吸光度的變化趨勢(shì)。隨著存放時(shí)間的增加，加入不同防腐劑的MAAs化合物的吸光度均有下降趨勢(shì)，在25 ℃保存時(shí)，所有加入防腐劑樣品的吸光度下降幅度與未添加防腐劑的基本相同，說(shuō)明這3種防腐劑在室溫下對(duì)MAAs化合物的穩(wěn)定性均不會(huì)產(chǎn)生明顯的影響，但在48 ℃時(shí)，壇紫菜MAAs化合物在防腐劑尼泊金甲酯體系中的吸光度較未添加防腐劑的溶液低且下降更為明顯，即含防腐劑尼泊金甲酯不利于MAAs化合物的穩(wěn)定性，而卡松和DMDMH體系中的吸光度高于未添加防腐劑的溶液，因此更有利于MAAs化合物的穩(wěn)定。

圖5 防腐劑對(duì)MAAs化合物穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of preservative on stability of MAAs

2.2.5 抗氧化劑對(duì) MAAs 化合物穩(wěn)定性的影響

圖6為壇紫菜MAAs化合物在加入2種抗氧化劑BHT和維生素E放置56 d吸光度的變化趨勢(shì)。在常溫下含抗氧化劑BHT的壇紫菜MAAs化合物溶液的吸光度與未添加抗氧化劑的相當(dāng)，說(shuō)明常溫下MAAs化合物能穩(wěn)定存在于2種抗氧化劑體系中，但在48 ℃下，MAAs化合物在BHT體系中的吸光度明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明高溫下BHT的存在能加速M(fèi)AAs化合物的分解。同時(shí)也可以看出維生素E的加入可以提高M(jìn)AAs化合物的吸光度，表明這種抗氧化劑對(duì)MAAs化合物有一定的保護(hù)作用，有利于維持其穩(wěn)定。

圖6 抗氧化劑對(duì)MAAs化合物穩(wěn)定性的影響Fig. 6 Effect of antioxidant on stability of MAAs

2.2.6 功能添加劑對(duì) MAAs化合物穩(wěn)定性的影響

圖7為壇紫菜MAAs化合物在加入多種化妝品添加劑 (透明質(zhì)酸、甘油、膠原蛋白、小分子肽、維生素 A) 放置 56 d吸光度的變化趨勢(shì)。25 ℃時(shí)含維生素A樣品的吸光度與未添加功能性添加劑的相當(dāng)，但在48 ℃保存15 d后，其吸光度的下降幅度最大且低于未添加功能性添加劑的，說(shuō)明高溫下維生素A的存在可促進(jìn)MAAs 化合物的分解；含甘油和膠原蛋白樣品的吸光度的下降速度與未添加功能性添加劑的溶液持平，它們對(duì)MAAs化合物的穩(wěn)定性無(wú)影響；而含小分子肽和透明質(zhì)酸添加劑的樣品的吸光度無(wú)論在高溫還是低溫均明顯高于對(duì)照組，能顯著增強(qiáng)MAAs化合物的穩(wěn)定性，比如48 ℃下添加小分子肽溶液的吸光度提高了82%，添加透明質(zhì)酸溶液的吸光度提高了18.6%。因此維生素A的存在能降低MAAs化合物的穩(wěn)定性，而小分子肽和透明質(zhì)酸能更有效地保持MAAs化合物的穩(wěn)定性。

圖7 功能添加劑對(duì)MAAs化合物穩(wěn)定性的影響Fig. 7 Effect of functional additives on stability of MAAs

3 結(jié)論

本研究從壇紫菜中提取了MAAs化合物，采用紫外可見(jiàn)光譜、液質(zhì)聯(lián)用確定了壇紫菜提取液中含有的MAAs化合物種類(lèi)為Shionrine和Porphyra-334，質(zhì)量分?jǐn)?shù)各為20%，總質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為40%。在化妝品體系中各個(gè)因素對(duì)MAAs化合物穩(wěn)定性的影響研究中得到以下結(jié)論：1) 微酸、弱光、低溫環(huán)境下，有利于MAAs化合物的穩(wěn)定，更有利于保存；2) 防腐劑卡松最有利于MAAs化合物的長(zhǎng)時(shí)間保存；3) 抗氧化劑維生素E可以提高M(jìn)AAs化合物的穩(wěn)定性；4) 48 ℃下功能性添加劑小分子肽使樣品的吸光度增加了82%，透明質(zhì)酸樣品則增加了18.6%，它們的添加能有效保護(hù)MAAs化合物的穩(wěn)定性。綜上，化妝品配方中的不同添加劑對(duì)MAAs化合物的穩(wěn)定性有不同程度的影響，在使用MAAs作為化妝品中的防曬成分時(shí)，應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)钠渌黝?lèi)添加劑來(lái)保護(hù)MAAs化合物的穩(wěn)定性，研究成果可為MAAs化合物在化妝品中的應(yīng)用提供參考和指導(dǎo)。