鄒 慶， 楊 帆， 王智惠， 楊 曦， 陳 昕， 王成秀， 余春梅

兒童喘息性疾病是兒童最常見的呼吸道疾病，其中哮喘的患病率呈顯著上升趨勢[1]，并不易根治[2]。研究哮喘發(fā)病機(jī)制的分子途徑，對于開發(fā)新的哮喘治療手段具有重要意義。哮喘本質(zhì)為氣道的慢性炎癥、氣流受限和氣道高反應(yīng)性；以肥大細(xì)胞的激活、嗜酸粒細(xì)胞與活化T淋巴細(xì)胞浸潤，許多炎性介質(zhì)產(chǎn)生為特點(diǎn)[3-4]。有研究顯示，遺傳基因在哮喘的病理生理過程中起關(guān)鍵作用，人類白細(xì)胞抗原-G（HLA-G）可能是其中一員[5]。HLA-G是HLA-Ib類分子，與T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等淋巴細(xì)胞上的受體相互作用，影響免疫應(yīng)答[6]。與經(jīng)典的HLA分子不同，HLA-G的表達(dá)并不存在于所有的體細(xì)胞，而是局限于部分組織如人支氣管上皮細(xì)胞[7]。研究顯示，HLA-G組織特異性表達(dá)與許多涉及免疫系統(tǒng)監(jiān)測和炎癥性疾病（如哮喘）有關(guān)[8]。然而，HLA-G在哮喘患兒中的表達(dá)及潛在機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探究HLA-G對呼吸道合胞病毒（RSV）感染人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE的細(xì)胞炎癥損傷的影響，以期為哮喘的治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE（中國科學(xué)院上海細(xì)胞資源中心），RSV（上海邦奕生物科技有限公司），HLA-G 小干擾RNA（siRNA）（廣州銳博生物），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司），RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京天根生化科技），AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa公司），白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-10和γ干擾素（IFN-γ）ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），蛋白提取試劑盒（南京凱基生物公司），HLA-G、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cleaved caspase）-3和cleaved caspase-9單抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），實(shí)時熒光定量PCR （qRT-PCR）檢測試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑（賽默飛世爾科技），引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理

人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE復(fù)蘇后加入RPMI 1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）重懸細(xì)胞，接入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放置在5% CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞融合度至80%左右時，除去舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

對數(shù)生長期的16HBE細(xì)胞以胰酶消化，收集并計(jì)數(shù)，以1×105個/孔接種到96孔板中，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞生長匯合度達(dá)50%左右時，按照Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑制造商使用說明將HLA-G siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞。16HBE細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組、感染組、轉(zhuǎn)染組和感染+轉(zhuǎn)染組，每次實(shí)驗(yàn)做3個孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3遍，其中感染組、轉(zhuǎn)染組和感染+轉(zhuǎn)染組16HBE細(xì)胞采用RSV進(jìn)行感染，轉(zhuǎn)染組和感染+轉(zhuǎn)染組16HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染HLA-G siRNA。RSV感染方法按參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行操作。

1.3qRT-PCR檢測細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)

各組16HBE細(xì)胞相應(yīng)處理24 h后，收集各組16HBE細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，并測定純度和濃度，選取合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以合成的cDNA作為模板，以GAPDH為內(nèi)參，使用qRT-PCR檢測HLA-G mRNA相對表達(dá)量，具體操作參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

所用引物：HLA-G 上游引物5’-GGAAGAGGAGACACGGAACA-3’；下游引物 5’-TGAGACAGAGACGGAGACAT-3’。GAPDH 上 游 引 物5’-CCTGCCTCTACTG-GCGCTGC-3’；下游引物5’-GCAGTGGGGACACGGAAG-GC-3’。

1.4Western blot檢測細(xì)胞中HLA-G、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)

各組16HBE細(xì)胞相應(yīng)處理24 h后，收集各組16HBE細(xì)胞，加入裂解液200 μL，于冰上裂解，離心收集上清液蛋白樣品，采用BCA法檢測蛋白濃度。將上樣緩沖液（loading buffer）與蛋白樣品充分混勻，沸水浴5 min致蛋白變性，取30 μg變性蛋白樣品行SDS-PAG凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，洗膜后封閉1.5 h。分別加入1∶800稀釋的HLA-G、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9一抗，4℃過夜孵育，隨后加入1∶2000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，顯影、定影，采用成像系統(tǒng)采集圖像，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算三者的表達(dá)水平。

1.5 噻唑藍(lán)（MTT）檢測細(xì)胞活力

各組16HBE細(xì)胞相應(yīng)處理后，以1×104個/孔接種到96孔板中，分別于12、24、48 h測定各組細(xì)胞活力，即在各個時間點(diǎn)棄上清液，向每孔細(xì)胞中加入10 μL MTT溶液，避光孵育4 h，棄上清液，再添加100 μL DMSO，搖床振蕩至結(jié)晶物溶解，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處細(xì)胞的吸光度（D）值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

各組16HBE細(xì)胞相應(yīng)處理24 h后，采用胰酶消化，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞至1×106個/mL，取細(xì)胞懸液1 mL，采用1 000 r/min離心10 min，除去上清液，以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，隨后加入結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入PI和AnnexinⅤ-FITC染色液各5 μL，混勻后避光孵育20 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測各組16HBE細(xì)胞凋亡情況。

1.7ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-4、IL-10和IFN-γ的含量

各組16HBE細(xì)胞相應(yīng)處理24 h后，分別收集上清液，使用IL-4、IL-10和IFN-γ ELISA檢測試劑盒分別測定細(xì)胞上清液中三者的含量，具體操作嚴(yán)格按照ELISA試劑盒使用說明，使用酶聯(lián)免疫檢測儀測定450 nm波長處每孔D值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0版軟件對以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩組間差異比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組16HBE細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)

qRT-PCR和Western blot檢測4組16HBE細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，感染組和轉(zhuǎn)染組16HBE細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與感染組和轉(zhuǎn)染組相比，感染+轉(zhuǎn)染組16HBE細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見圖 1。

2.2 各組16HBE細(xì)胞的增殖活力

MTT檢測各組16HBE細(xì)胞增殖活力，結(jié)果顯示：與對照組相比，感染組和轉(zhuǎn)染組16HBE細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.05），與感染組和轉(zhuǎn)染組相比，感染+轉(zhuǎn)染組16HBE細(xì)胞活力均明顯升高（P＜0.05），見圖 2。

2.3 各組16HBE細(xì)胞的凋亡情況

流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測各組16HBE細(xì)胞凋亡率及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對照組相比，感染組和轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞凋亡率、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），與感染組和轉(zhuǎn)染組相比，感染+轉(zhuǎn)染組三者的表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），見圖3。

2.4 各組16HBE細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子的分泌

ELISA檢測各組16HBE細(xì)胞上清液中炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的含量，結(jié)果顯示：與對照組相比，感染組和轉(zhuǎn)染中3種因子的含量明顯升高（P＜0.05），與感染組和轉(zhuǎn)染組相比，感染+轉(zhuǎn)染組中3種因子的含量明顯降低 （P＜0.05），見圖4。

3 討論

HLA-G是一類免疫耐受分子，具有選擇性組織分布的特點(diǎn)，除了高表達(dá)于母胎界面絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞，在一些腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞、器官移植后的移植物細(xì)胞上的表達(dá)也明顯增高[10]。HLA-G分子參與免疫調(diào)節(jié)作用是一個復(fù)雜的過程，在很多方面都有作用，如器官移植、腫瘤、病毒感染、慢性炎癥性疾病和妊娠等[11]。HLA-G在調(diào)節(jié)免疫中同時刺激Th2細(xì)胞反應(yīng)和Treg細(xì)胞活化。許多臨床研究集中于HLA-G單核苷酸多態(tài)性、HLA-G單倍型作為預(yù)測哮喘的生物標(biāo)志物，表明HLA-G可能在哮喘發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮一定的作用，繼而在哮喘診治中具有潛在價值[12-13]。哮喘最主要的特征是上皮異常和炎性細(xì)胞激活[14]。IFN-γ和IL等因子在其發(fā)病過程中起著重要作用[15-16]。小兒哮喘的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，一項(xiàng)研究表明，炎性系統(tǒng)的過度反應(yīng)在哮喘發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[17]。本研究采用RSV感染16HBE細(xì)胞體外模擬哮喘環(huán)境，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染敲低HLA-G的表達(dá)，結(jié)果顯示，RSV感染的16HBE細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌增加，而敲低HLA-G可減少RSV感染的16HBE細(xì)胞IL-4、IL-10和IFN-γ的分泌，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示敲低HLA-G能夠降低RSV感染的16HBE細(xì)胞炎性損傷。此外，RSV感染的16HBE細(xì)胞活力明顯降低，而敲低HLA-G的表達(dá)能夠拮抗RSV對16HBE細(xì)胞活力抑制作用。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)源性途徑。線粒體通透性導(dǎo)致凋亡小體的形成，凋亡小體促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶的激活，并隨后觸發(fā)凋亡細(xì)胞死亡的其他蛋白質(zhì)[18]。Bax的激活導(dǎo)致許多線粒體蛋白質(zhì)的釋放，如細(xì)胞色素c （Cyt-c），通過Bax從胞漿到線粒體的易位，克服Bcl-2對線粒體膜蛋白通透性的調(diào)節(jié)，然后通過Cyt-c的結(jié)合形成凋亡復(fù)合體。然后凋亡體復(fù)合物二聚體激活caspase-9并進(jìn)一步激活caspase-3，后者降解以誘導(dǎo)凋亡[19]。以往研究顯示，G蛋白-偶聯(lián)雌激素受體（GPER）/miR-148a/HLA-G信號通路抑制細(xì)胞凋亡與降低Bax/Bcl-2比率和caspase3/9活性有關(guān)，進(jìn)而介導(dǎo)卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究結(jié)果顯示，敲低HLA-G能夠降低RSV感染的16HBE細(xì)胞凋亡，以及cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表達(dá)水平。表明敲低HLA-G能夠通過線粒體凋亡途徑減少RSV誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡。

綜上，敲除HLA-G能夠減少RSV感染的人支氣管上皮細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。本研究為哮喘的發(fā)病機(jī)制及HLA-G用于哮喘的診治提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。