李瑤璐，陳小芳，李國坤，丁靜華，蘇立杰，陳驍熠

（廣州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣州 511436）

槲皮素（Quercetin）是一種天然黃酮類化合物，作為功能性食品的主要成分之一，槲皮素生理功能廣泛，具有抗氧化［1］、抗炎［2］、降糖［3］、降壓［4，5］等作用［6，7］。槲皮素對(duì)腸道菌群有調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)宿主恢復(fù)微生物平衡，還具有保護(hù)腸屏障的作用［8］，通過抑制腸道細(xì)菌的產(chǎn)生降低炎癥反應(yīng)。已有研究［9］證實(shí)槲皮素治療能降低高脂飲食誘導(dǎo)肥胖的C57BL/6J 小鼠的血糖，具有較好的抗氧化作用，對(duì)于調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平具有重要意義。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明［10-12］槲皮素能增加腸道菌群的種類，上調(diào)腸道中有益菌群的豐度，抑制致病菌的生長，因此槲皮素具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。

代糖是一種甜味高、能量低甚至不含能量的蔗糖替代糖，本研究選用復(fù)配代糖，由赤蘚糖醇［13］、菊粉［14］、甜菊糖苷［15］、羅漢果苷組成，均為天然甜味劑且是無糖產(chǎn)品的絕佳選擇［16］，具有潤腸通便和改善腸道菌群紊亂［17-20］、促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌生長的作用［21］。實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，此復(fù)配代糖GI 值為 0，且能調(diào)節(jié)特定人群的腸道菌群［22，23］。

綜上所述，槲皮素和代糖均能降低血糖負(fù)荷且能調(diào)節(jié)腸道菌群，對(duì)糖尿病的預(yù)防控制具有重要意義。而酸奶營養(yǎng)價(jià)值高、更易于人體消化吸收，因此本研究將槲皮素與代糖結(jié)合，研發(fā)一款可供特殊人群食用的槲皮素代糖酸奶，并探究槲皮素和代糖對(duì)酸奶菌群的影響及其對(duì)腸道菌群體外增殖的影響，豐富酸奶的種類，也為乳制品和低血糖負(fù)荷的功能食品生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲皮素，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；代糖，廣州萊品健康科技有限公司復(fù)配糖（產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào) ：GB 26687—2011，生 產(chǎn) 許 可 證 編 號(hào) ：SC1244419014023）；脫脂乳粉，澳大利亞施普特乳制品私有公司；酸奶發(fā)酵劑，安琪酸奶發(fā)酵劑（12 菌型）；KF 鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌選擇培養(yǎng)基、MRS 瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；小鼠糞便，SPF 級(jí)健康Balb/c 小鼠由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物室。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B 型微機(jī)生化培養(yǎng)箱，上海瑞豐儀器儀表有限公司；LS-35HD 型高壓蒸汽滅菌機(jī)，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；G6 型迅數(shù)自動(dòng)菌落分析儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；Multiskan GO 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 加工工藝流程 槲皮素代糖酸奶加工工藝流程如圖1 所示，具體如下。

圖1 槲皮素代糖酸奶加工工藝流程

1）器皿消毒。將酸奶瓶、奶盆、稱量匙、分裝勺等器皿放入高壓滅菌鍋里滅菌備用，溫度、時(shí)間設(shè)定為 121 ℃、20 min。

2）復(fù)原乳的制備。稱取事先計(jì)算好的脫脂奶粉重量，用70～80 ℃溫開水按相應(yīng)比例溶解，制成復(fù)原乳備用。

3）配料。按配方的相應(yīng)比例，添加復(fù)合代糖、明膠溶液（需先分出一小部分水將明膠溶解完），充分混勻。

4）滅菌。將上述混合液于高壓滅菌鍋內(nèi)，95 ℃下持續(xù)滅菌5～10 min。

5）冷卻、接種。滅菌完迅速降溫至40 ℃左右，然后接種提前活化的菌種。

6）發(fā)酵。接種完的乳液需置于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，溫度設(shè)定為40 ℃，直到凝乳塊形成。

7）加入槲皮素、破乳。在發(fā)酵好的酸乳中按比例加入槲皮素，攪拌至顏色和組織均勻。

8）后熟。當(dāng)酸乳溫度冷卻至10 ℃時(shí)，置于冰箱中后熟24 h，溫度為4～6 ℃。

1.3.2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 由20 人組成感官品評(píng)小組，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)酸奶進(jìn)行評(píng)分，取平均值作為總分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］見表1。

表1 槲皮素代糖酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.3 工藝配方優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別考察發(fā)酵時(shí)間、乳粉添加量、代糖添加量和發(fā)酵劑接種量對(duì)槲皮素代糖酸奶感官評(píng)分和酸度的影響。

1）工藝配方單因素試驗(yàn)。以100 mL 乳液為基準(zhǔn)，探究當(dāng)槲皮素添加量0.1%、明膠0.2%，發(fā)酵溫度42 ℃時(shí)，乳粉添加量、代糖添加量、發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵時(shí)間4 種單因素對(duì)酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響，確定最佳工藝配方。發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)定為6、7、8、9、10 h；乳粉添加量分別設(shè)定為10%、12%、14%、16%、18%；代糖添加量分別設(shè)定為5%、6%、7%、8%、9%；發(fā)酵劑接種量分別設(shè)定為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%。

2）工藝配方優(yōu)化正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以槲皮素代糖酸奶的感官評(píng)價(jià)和酸度為考察指標(biāo)，選取發(fā)酵時(shí)間、復(fù)合代糖添加量、發(fā)酵劑接種量3 個(gè)因素設(shè)計(jì) 3 因素 3 水平正交試驗(yàn)（表 2），優(yōu)化發(fā)酵工藝。

表2 槲皮素代糖酸奶優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 槲皮素及代糖對(duì)酸奶乳酸菌及理化性質(zhì)的影響 原味酸奶與槲皮素代糖酸奶的檢測指標(biāo)均參考GB 19302—2010 進(jìn)行檢測，乳酸菌總數(shù)按照GB 4789.35—2016、脂肪按照 GB 5009.6—2016、蛋白質(zhì)按照 GB 5009.5—2016、酸度按照 GB 5009.239—2016 要求進(jìn)行檢測，微生物限量按照GB 19302—2010 進(jìn)行檢測。

1.3.5 槲皮素代糖酸奶對(duì)小鼠腸道菌群的影響 基于《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范（2003 年版）》，探討最佳配方酸奶對(duì)小鼠部分腸道菌群的影響。選取腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌作為研究對(duì)象。取無菌動(dòng)物房小鼠糞便，稀釋至10-4濃度后，分別接種于4 種選擇培養(yǎng)基上，腸球菌、腸桿菌（36±1）℃培養(yǎng)24 h、雙歧桿菌和乳酸桿菌（36±1）℃厭氧培養(yǎng)48 h 后，選擇性培養(yǎng)并鑒定，剔除不符合條件的菌落，其余菌落以無菌水沖洗后收集，得到目標(biāo)菌種。將0.5 麥?zhǔn)蠞岫鹊哪繕?biāo)菌種以10%的接種量接種于含有適量槲皮素代糖酸奶和普通酸奶的營養(yǎng)肉湯中，取 200 μL 置于 96 孔板中，腸球菌、腸桿菌37 ℃培養(yǎng)24 h，雙歧桿菌、乳酸桿菌37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。以空白營養(yǎng)肉湯為對(duì)照，分別做3 個(gè)平行樣，于600 nm 波長下測定其吸光度（OD）。每2 h 測定1次，共檢測24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響 由表3 和圖2 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，不同發(fā)酵時(shí)間的酸奶之間感官評(píng)價(jià)分值有顯著差異（P＜0.05）。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，分?jǐn)?shù)先升高再稍微降低，酸度均在合格范圍內(nèi)（GB 19302—2010），且酸度均大于70°T，因此最適發(fā)酵時(shí)間在9 h 左右。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分的影響

表3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸度的影響

2.1.2 乳粉添加量對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響由表4 和圖3 可知，乳粉添加量為10%時(shí)，酸奶酸度不符合國標(biāo)規(guī)定。隨著乳粉添加量的增加，酸奶感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)隨著乳粉添加量的增加而增加，且酸度均在 70°T 以上。因感官評(píng)分總體在85～95 分，差距并不明顯，綜合考慮酸奶品質(zhì)和口感及試驗(yàn)?zāi)康?，初步確定乳粉添加量為最高值18%。

表4 乳粉添加量對(duì)酸度的影響

圖3 乳粉添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

2.1.3 代糖添加量對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響由表5 和圖4 可知，代糖添加量為5%時(shí)，酸度小于70°T 不符合國標(biāo)規(guī)定。隨著代糖添加量的增加，酸奶的感官評(píng)分先升高后降低，且酸度均大于70 °T，因此最適的代糖添加量在7%左右。

圖4 代糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響

表5 代糖添加量對(duì)酸度的影響

2.1.4 發(fā)酵劑接種量對(duì)槲皮素代糖酸奶質(zhì)量的影響 由表6 和圖5 可知，隨著發(fā)酵劑接種量的增加，酸奶的感官評(píng)分先增加后降低，且酸度均在合格范圍之內(nèi)，因此最適宜的發(fā)酵劑接種量在0.15%左右。

圖5 發(fā)酵劑接種量對(duì)感官評(píng)分的影響

表6 發(fā)酵劑接種量對(duì)酸度的影響

2.2 正交試驗(yàn)

由表7 可知，根據(jù)正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果可看出，各因素對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響存在差異，各因素對(duì)酸奶的影響大小依次為代糖添加量＞發(fā)酵劑添加量＞發(fā)酵時(shí)間，極差分析結(jié)果表明最優(yōu)方案為A3B2C1，即代糖添加量7% ，發(fā)酵時(shí)間10 h，發(fā)酵劑添加量0.10%，感官評(píng)分及酸度分別為86.45 分和75.83°T，酸度符合國標(biāo)規(guī)定。

表7 槲皮素代糖酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 理化指標(biāo)

經(jīng)檢測，優(yōu)化后的槲皮素代糖酸奶蛋白質(zhì)含量為 2.14 g/100 g，脂肪含量為0.1 g/100 g，酸度為80.56 °T，葡萄糖含量為 0.072 mg/mL，蔗糖含量為0.781 mg/mL，乳糖含量為1.098 mg/mL。大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌均未檢出。

2.4 槲皮素代糖酸奶的乳酸菌總數(shù)

由表8 可知，槲皮素代糖酸奶中乳酸菌總數(shù)為（2.612±0.005）×108CFU/mL，原味酸奶中乳酸菌總數(shù)為（1.356±0.006）×108CFU/mL，P＜0.05，說明槲皮素代糖酸奶的乳酸菌總數(shù)顯著高于原味酸奶的乳酸菌總數(shù)。

表8 槲皮素代糖酸奶乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果

2.5 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸道菌群體外增殖的影響

2.5.1 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸球菌體外增殖的影響由圖6 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組的OD均高于空白組，整個(gè)生長曲線的趨勢(shì)與空白組基本一致。在8 h 后槲皮素代糖酸奶相比原味酸奶抑制了腸球菌的增殖生長，14 h 后隨時(shí)間的延長只有小幅度的增長。槲皮素代糖酸奶組腸球菌生長曲線明顯低于原味酸奶組腸球菌，表明槲皮素代糖酸奶對(duì)腸球菌的增殖表現(xiàn)出抑制作用。

圖6 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸球菌增殖的影響

2.5.2 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸桿菌體外增殖的影響由圖7 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組腸桿菌的生長曲線發(fā)展趨勢(shì)與空白組基本一致，隨時(shí)間的延長，槲皮素代糖酸奶組呈小幅度的增長，在18 h 后呈下降趨勢(shì)，且槲皮素代糖酸奶組腸桿菌的生長曲線多數(shù)在原味酸奶組之下，表明槲皮素代糖酸奶對(duì)腸桿菌有一定的增殖抑制作用。

圖7 槲皮素代糖酸奶對(duì)腸桿菌增殖的影響

2.5.3 槲皮素代糖酸奶對(duì)雙歧桿菌體外增殖的影響 由圖8 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組雙歧桿菌的生長曲線趨勢(shì)與空白組基本一致，細(xì)菌懸液OD隨時(shí)間的增加而增長，原味酸奶組和槲皮素代糖酸奶組雙歧桿菌的生長曲線都在空白組之上，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組的雙歧桿菌OD均高于原味酸奶組。槲皮素代糖酸奶組不僅在8 h 后加速雙歧桿菌的增殖，并且在20 h 后仍有促進(jìn)作用，明顯提高雙歧桿菌的最終濃度，表現(xiàn)出較強(qiáng)的扶植作用。

圖8 槲皮素代糖酸奶對(duì)雙歧桿菌增殖的影響

2.5.4 槲皮素代糖酸奶對(duì)乳酸桿菌體外增殖的影響 由圖9 可知，24 h 內(nèi)槲皮素代糖酸奶組和原味酸奶組乳酸桿菌的生長曲線趨勢(shì)比空白組增長迅速，槲皮素代糖組乳酸桿菌的生長曲線高于原味組乳酸桿菌的生長曲線，且2 h 時(shí)就表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，可以明顯提高乳酸桿菌的OD，說明槲皮素代糖酸奶能夠更好促進(jìn)乳酸桿菌的增殖。

圖9 槲皮素代糖酸奶對(duì)乳酸桿菌體外增殖的影響

3 小結(jié)

本研究通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定槲皮素代糖酸奶的最佳工藝配方為乳粉添加量18%，代糖添加量7%，發(fā)酵時(shí)間10 h，發(fā)酵劑添加量0.10%；與原味酸奶相比，槲皮素代糖酸奶的乳酸菌總數(shù)較高；24 h 生長曲線動(dòng)態(tài)觀察槲皮素代糖酸奶對(duì)小鼠腸道菌群在體外增殖的影響發(fā)現(xiàn)其能明顯促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖、抑制腸桿菌和腸球菌的增殖。槲皮素代糖酸奶不僅滿足特殊人群的需求，且具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用，為乳制品和低血糖負(fù)荷的功能食品生產(chǎn)提供了參考依據(jù)。