秦蘇楊，任秋安,王耀光*

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學研究中心，天津 300193）

IgA 腎?。↖gA nephropathy, IgAN）是世界范圍內最常見的原發(fā)性腎小球疾病， 其特征是循環(huán)免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）和腎系膜IgA 沉積異常[1-2]。 臨床中，其主要表現為無癥狀血尿（如肉眼血尿、鏡下血尿有或無伴隨蛋白尿）、進行性腎?。ǖ鞍啄驘o伴隨血尿、腎病綜合征），嚴重者甚至伴隨進行性腎衰竭。 不良預后相關因素包括高血壓、蛋白尿、表皮生長因子受體降低，發(fā)病人群以成年人為主[3]。目前，IgAN 的西醫(yī)治療藥物以激素以及免疫抑制劑等為主，同時還可通過改善患者生活方式、控制血壓、行扁桃體切除術等進行支持治療。 但激素與免疫抑制劑的價格及不良反應均在一定程度上加重患者的負擔[4]，因此，利用中醫(yī)藥優(yōu)勢尋找替代療法顯得尤為必要。

IgAN 在中醫(yī)學屬于“水腫”“腎風”“血尿”“腎著”等范疇，以伏邪、瘀血等理論進行辨證論治，臨床常用雷公藤、黃葵及類屬中成藥[5-7]。火把花根片(HBHGT)是由昆明山海棠根加工而成，目前已證實HBHGT具有良好的免疫調節(jié)和抗炎作用[8]。 有臨床證據表明，HBHGT 可緩解炎癥、減少尿蛋白、延緩IgAN 進展，且其具有無生物毒性的優(yōu)點[9-11]。 但其治療IgAN的作用機制尚未十分明確，本文通過生物信息學、網絡藥理學和分子對接技術手段， 預測潛在作用靶點和信號通路，以期明確作用機制，為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 IgAN 的基因芯片及差異分析

在NCBI 的GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）以“IgA Nephropathy”為關鍵詞檢索IgA腎病樣本。 選取含IgAN 樣本與正常樣本的數據集5 組（GSE37460、GSE93798、GSE35489、GSE104948、GSE99340）為研究對象。通過R 4.1.2 進行系統分析并利用normalize 函數進行歸一化處理。 用Limma包篩選出差異基因，篩選條件為：logFC 絕對值>1，P<0.05 且校正P<0.05。

1.2 HBHGT 成分和靶點篩選

在TCMSP（https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）、本草組鑒（http://herb.ac.cn）、BATMAN-TCM（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）查找HBHGT 的化學成分，并利用CNKI、PubMed 等數據庫檢索近十年（2011-2021 年）有關HBHGT 成分研究的文獻進行補充[12-14]，通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫檢索其分子結構，導入SwissADME（http://www.swissadme.ch/index.php），通過Linpinski 五規(guī)則[15]進行篩選，最后運用SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)進行靶點預測，通過UniProt(https://www.uniprot.org/）數據庫將獲取的靶點名稱進行規(guī)范。

1.3 疾病靶點數據庫建立

在GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、Drugback（https://go.drugbank.com/）數據庫以“IgA Nephropathy”為關鍵詞，檢索IgAN 的靶點，整合后與“1.1”項中從GEO 數據庫獲得的差異基因取交集，建立疾病靶點數據庫。

1.4 HBHGT 藥物-成分-靶點網絡圖構建

將藥物與疾病二者靶點取交集，得到HBHGT治療IgAN 的潛在靶點。 運用Cytoscape 3.8.0 構建HBHGT 治療IgAN 的藥物-成分-靶點網絡圖，利用工具NetworkAnalyzer 分析成分的網絡拓撲參數，包括連接度、介度及緊密度等[16]，從而得出發(fā)揮藥效的主要成分。

1.5 核心靶點篩選及PPI 網絡構建

將潛在靶點輸入STRING 11.0 數據庫(https://string-db.org)進行PPI 分析，其中最小互相作用閾值設為“highest confidence”（>0.9），生物種類設為“Homo sapiens”。 利用Cytoscape 3.8.0 軟件的CytoNCA 插件對網絡節(jié)點的連接度中心性（degree centrality, DC）、介度中心性（betweenness centrality,BC）、緊密度中心性（closeness centrality, CC）進行計算，并可視化呈現。

1.6 GO 與KEGG 富集分析

將潛在靶點錄入注釋可視化和集成發(fā)現數據庫（database for annotation visualization and integrated discovery, DAVID），設定閾值P＜0.05，進行GO 注釋和KEGG 富集分析，并用R 4.1.2 可視化呈現。

1.7 成分-靶點分子對接

將核心成分與核心靶點進行對接。 通過ZINC（http://zinc.docking.org）數據庫、PDB（https://www.rcsb.org/）數據庫分別查找核心成分和核心靶點的3D 結構，運用Auto Dock 4.2.6 逐一進行對接，根據Docking Score 值評價靶點與活性化合物的結合強度與活性[17]，再利用Pymol 2.5.0 軟件對對接結果進行分析及繪圖。

2 結果

2.1 IgAN 差異基因分析

GEO 數據集GSE37460、GSE93798、GSE35489、GSE104948、GSE99340 篩選后分別確定了170 個、347 個、80 個、182 個、295 個與IgAN 相關的差異基因，合并后為723 個。

2.2 HBHGT 成分和靶點篩選結果

通過數據庫及相關文獻共獲得114 個化學成分，篩選后得到HBHGT 的活性成分共15 個（見表1），通過SwissTargetPrediction 數據庫共獲得1010個潛在靶點，去重后得到511 個潛在靶點。

表1 火把花根片主要成分

續(xù)表1

2.3 疾病靶點數據庫建立

獲得與IgAN 相關的靶點基因1326 個，與從GEO數據庫獲得的723 個差異基因取交集進行驗證，獲得402 個疾病靶點。

2.4 HBHGT 藥物-成分-靶點網絡圖構建

取交集后得到HBHGT 治療IgAN 的潛在靶點108 個（見圖1）。 運用Cytoscape 3.8.0 構建HBHGT治療IgAN 的藥物-成分-靶點網絡圖（見圖2）。通過NetworkAnalyzer 分析成分網絡節(jié)點特征參數，預測HBHGT 治療IgAN 的主要成分（見表2）。

表2 火把花根片成分部分網絡節(jié)點特征參數

圖1 HBHGRT-IgAN 靶點韋恩圖

圖2 HBHGT 治療IgAN 的藥物-成分-靶點網絡圖

2.5 核心靶點篩選及PPI 網絡構建

將二者交集靶點在STRING 11.0 數據庫進行PPI 網絡分析，結果為靶點108 個，靶點之間相互關系973 條。 利用CytoNCA 插件對網絡參數進行計算，以DC≥17（中位數）、BC≥0.001 032 69（中位數）、CC≥0.135 732 4（中位數）為條件進行篩選，篩選后得靶點54 個，靶點間相互關系331 條，并用Cytoscape 3.8.0 可視化呈現（見圖3）。其中，DC 值排名靠前的靶點白細胞介素-6（interleukin-6, IL-6）、纖維連接蛋白1(fibronectin1, FN1)、白蛋白（albumin,ALB）細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53,TP53）、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、Toll 樣受體(toll-like receptor, TLR)、血管內皮細胞生長因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen activated protein kinase 3, MAPK3）等，即為HBHGT 治療IgAN的可能潛在作用靶點。

圖3 HBHGT 治療IgAN 的核心靶點

2.6 數據分析

將HBHGT 治療IgAN 的54 個靶點錄入DAVID數據庫進行富集分析，包括GO 的生物學過程（biological process, BP）、細胞組成（cellular component,CC）和分子功能(molecular function, MF）分析和KEGG 通路富集分析（見圖4）。 在細胞組成上富集到了42 個項目，涉及細胞器、質膜、細胞質、線粒體外膜等方面；在分子功能上富集到55 個項目，主要與酶結合、蛋白結合、細胞因子活性等有關；參與了128 種生物過程，主要涉及代謝調控、蛋白質磷酸化、上皮細胞增殖和凋亡等方面；主要通路有核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路、TNF 信號通路、 血管內皮細胞生長因子(vascular endothe lial growth factor, VEGF) 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號通路、TLR信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號通路等。

圖4 HBHGT 治療IgAN 核心靶點的富集分析

2.7 分子對接驗證

利用AutoDock 軟件將排名前6 的化合物（雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷公藤內酯酮、沒食子酸、雷酚內脂、雷公藤乙素），與8 種排名靠前的核心靶點(IL6、FN1、ALB、TP53、TNF、TLR、VEGFA、MAPK3)逐一對接，對接結果只取最高絕對值。 用R 4.1.2 繪制熱圖（見圖5），結合能絕對值越大表明靶點與活性成分之間的對接結果越好。 同時，借助Pymol 2.5.0 軟件分別對分值較高的組合進行結合模式分析，詳見圖6。

圖5 HBHGT 中的關鍵化合物與PPI 核心靶蛋白分子對接Docking Score 值熱圖

圖6 HBHGT 關鍵化合物與核心靶點對接模型及位點圖

3 討論

火把花根即中藥昆明山海棠根，有祛風除濕、活血止血、舒筋接骨、解毒殺蟲等功效。 現代臨床研究表明，其成分具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等作用[18]。李夏玉等[11]對HBHGT 治療的60 例IgAN 病例進行觀察，結果顯示其有效率為75%，與雷公藤多苷片相比，具有“低毒”的優(yōu)勢；于梅等[19]發(fā)現益腎湯加HBHGT 療效與IgAN 病理類型有關, 病理損害越重療效越差， 且療效較單用其中一種治療IgAN 療效明顯，并且見效快，可減少復發(fā)。王坤明等[10]研究表明，采用HBHGT 結合西醫(yī)治療在減少24 h 尿蛋白定量和尿紅細胞計數方面優(yōu)于單純西醫(yī)療法，HBHGT 治療IgAN 有效，并具有免疫抑制作用。

在本研究中，通過TCMSP、本草組鑒、BATMANTCM3 個中藥數據庫及相關文獻， 利用Linpinski五規(guī)則篩選后得出15 種成分。其中，4 種成分（雷公藤紅素、雷公藤甲素、雷酚內酯，雷公藤內脂酮）在實驗中進行了測試。為了探究HBHGT 治療IgAN 的內在機制，應用DAVID 平臺進行GO 注釋。 GO 分析表明，HBHGT 治療IgAN 在分子功能方面，主要涉及酶結合、蛋白結合、細胞因子活性等方面的調節(jié)，如細胞因子活性、蛋白磷酸酶結合、蛋白激酶結合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等；在細胞組成方面，涉及細胞器、質膜、細胞質、線粒體外膜等方面；在生物學過程方面，主要涉及代謝調控和蛋白質磷酸化、上皮細胞增殖和凋亡等方面，如細胞增殖、凋亡過程、蛋白質磷酸化、活性氧代謝等。

FN1 是一種黏附的高分子量二聚糖蛋白，是細胞外基質的一部分。 不同的FN1 變體在二聚體分泌、血液凝固、黏附淋巴細胞、皮膚傷口愈合、動脈粥樣硬化和肝纖維化中起特定作用[20]。有研究表明，纖維連接蛋白腎?。╣lomerulopathy with fibronectin deposits, GFND）伴有大量FN1 腎小球沉積，導致終末期腎衰竭[21]。 此外，尿FN1 排泄可能是IgAN 中疾病活動度的標志物[22]。原發(fā)性IgAN 患者的血清中存在IgA-FN1 復合物，IgA 抗體與膠原Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ結合需要通過FN1 結合位點來介導[23]。 ALB 是血管內主要的抗氧化劑，實驗表明，ALB 預處理的小鼠系膜細胞和人腎細胞中過氧化氫誘導的細胞內活性氧和線粒體損傷明顯減輕，ALB 的抗氧化能力可以減少氧化應激的發(fā)生，從而延緩IgAN 的進程[24]。

TLR 是哺乳動物固有免疫系統的關鍵組成部分，通過結合病原相關分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP）和/或損傷相關分子模式（damage associated molecular pattern, DAMP）介導免疫和炎癥反應[25]，SMITH[26]印證了TLR 與IgA的發(fā)病有關。 干擾素、TNF 和特異性白細胞介素由TLR 誘導。 例如，TNF-α、IL-6、IL-23 和IL-10 的表達是由TLR4 激活誘導的[27]。 IL-6、信號轉導子和轉錄激活子3（activator of transcription 3, STAT3）以及NF-κB 通路與TLR2 刺激的IL-17 和IL-23 有關[28]。NF-κB 信號通路控制一系列基因的表達（如TNFα、IL-6 的產生），在控制炎癥和免疫反應的過程中扮演關鍵角色[29-30]。

Tp53 在調節(jié)細胞代謝的不同方面（包括自噬）中起著關鍵作用。 在正常生理條件下，Tp53 可以抑制自噬體的形成，但應激條件也可以導致Tp53 介導的自噬促進，在營養(yǎng)耗盡或缺氧等壓力條件下，Tp53 通過抑制mTOR 信號傳導促進自噬激活[31]。VEGFA 對血管內皮細胞的增殖和分化影響最大，是最主要的VEGF。 VEGF 可以增加血管通透性，參與腎臟血管生成。 研究發(fā)現，VEGF 在活動性IgAN 組織的上皮細胞和炎性細胞中表達明顯增加，推測VEGF 在活動性炎性組織中表達增強，影響微循環(huán)，加重黏膜缺氧損傷[32-33]。有研究表明，IgAN 患者血清中TNF-α 和IL-6 水平明顯升高[34]。TNF-α 是細胞凋亡、免疫和炎癥的主要介質，通過與TNF 受體（TNFR-Ⅰ和TNFR-Ⅱ）結合來傳遞其信號[27]。

IgA 的異常糖基化是IgAN 發(fā)病機制的核心。IgAN患者的腎小球IgA 僅限于IgA1 亞類，例如：半乳糖缺乏性IgA1（galactose-deficient IgA1, Gd-IgA1）[35-36]。IgA1在IgAN 的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用，通過TLR9 的先天性免疫激活參與Gd-IgA1 的產生。增殖誘導配體（a proliferation inducing ligand, APRIL）和IL-6 也可增強IgAN 中Gd-IgA1 的合成[37]。此外，IgAN 患者血清中Gd-IgA1 和含有Gd-IgA1 特異性自身抗體的免疫復合物水平升高[38-39]。 IL-6 和IL-4增加IgA1 的產生，并加重了半乳糖缺乏的程度，增加IgAN 患者分泌IgA1 的細胞系合成Gd-IgA1[40]。 這些也再次說明，IL-6 可能是這一過程的關鍵介體。

有動物實驗表明，雷公藤紅素能夠抑制腎臟氧化應激和炎癥，降低尿白蛋白排泄和改善糖尿病小鼠的腎臟功能，降低IL-6 和TNF-α 的表達[41]。 通過抑制NF-κB 信號激活，抑制腎小管細胞凋亡，從而改善腎臟的炎癥損傷，改善細胞凋亡[42-43]。 雷公藤紅素可以通過抑制p38 MAPK 表達和NF-κB p65 降低血肌酐和尿素氮含量，降低糖尿病大鼠尿蛋白的排泄，改善腎臟的病理損傷，調節(jié)信號通路MAPK/NF-κB，抑制炎癥和延緩腎功能損傷，保護糖尿病大鼠的腎臟[44]。 作為一個潛在的治療藥物，也可以通過PI3K/AKT 途徑減弱腎損傷，抑制腎小球基底膜增厚和足細胞凋亡[45]。這些結果都證實，雷公藤紅素的抗炎效果。

雷公藤甲素具有抗炎、抗增殖、免疫抑制和抗腫瘤等多種生物學活性[46-48]。 HE 等[49]從IgAN 大鼠的實驗中觀察到，雷公藤甲素可顯著降低血清IL-1β和IL-18 水平，并可能通過下調NLRP3 和TLR4 的表達，改善炎癥小體介導的促炎細胞因子的產生來發(fā)揮抗炎作用，阻止IgAN 的進展，顯著減弱大鼠腎系膜增生和系膜擴張以及腎小球IgA 沉積。 雷公藤甲素可通過減少TNF-α 的表達來發(fā)揮抗炎作用[50]。TAO 等[51]實驗研究發(fā)現，通過雷酚內酯治療的小鼠與溶媒組的小鼠相比，蛋白尿和尿素氮水平顯著降低，在44 周齡時，溶媒組小鼠的存活率明顯低于用雷公藤甲素或雷酚內酯治療的小鼠。

雷公藤內酯酮具有抗炎及免疫抑制作用。張建偉等[52]證實大劑量的雷公藤內酯酮對T 細胞增殖反應有一定的免疫抑制作用，對B 細胞的免疫功能有促進作用。同時有基礎研究表明，其可顯著降低CIA大鼠脾細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6 水平，有效抑制小鼠腹腔巨噬細胞分泌的NO 和TNF-α[53-54]。

本研究借助基因分析、網絡藥理學以及分子對接平臺，對藥物與疾病進行關聯分析，初步預測了HBHGT 在IgAN 治療中起關鍵作用的藥物成分、靶點、通路及其潛在作用機制，為IgAN 的臨床治療以及用藥提供了參考。 但仍有部分成分-靶點-通路信息缺乏，因此，還需要更高質量的生物信息學及網絡藥理信息平臺來提供支撐，需要更多的細胞或動物實驗來給予驗證和支持。