申林強，章淑薇，鄧鑫杰，靳陳麗蕓，劉欣汝，劉碧源*

（湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410208）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis, AR）又稱變應性鼻炎，全世界約有6 億人患病且呈流行增加的趨勢，歐美國家AR 的患病率為10%～40%[1]。我國近20 年成人和兒童AR 的流行都呈上升趨勢，有研究報道，成人AR 的患病率為17.6%[2]。 AR 主要由IgE 介導的一種速發(fā)型超敏反應性疾病，臨床表現(xiàn)為鼻塞、鼻癢、打噴嚏和流鼻涕等，其病因尚不完全清楚[3]。 目前，AR 的治療方式以抗過敏藥緩解癥狀為主，不能徹底治愈，復發(fā)率較高[4]。

中醫(yī)藥具有安全、毒副作用小和復發(fā)率低等優(yōu)點，從而被廣泛用于AR 的治療[5]。 AR 在中醫(yī)學歸為“鼻鼽”范疇，臨床以肺氣虛寒證多見。 張仲景對本病有“清出”和“善嚏”的描述，認為寒邪收引、肺氣不宣、津液不布則清出，陰陽互引、正邪相爭則善嚏[6]。 桔梗元參湯出自清朝名醫(yī)黃元御的《四圣心源》，全方由桔梗、元參、法半夏、茯苓、苦杏仁、陳皮、生姜和甘草8 味藥組成，通過調(diào)理脾胃氣機升降，使胃氣降濁，脾氣升清，補足正氣，從而祛除外邪達到治療AR 的目的[7]。其中，桔?？砷_肺氣、解毒排膿，元參潤燥解毒，苦杏仁、橘皮清理肺氣、化痰降逆，半夏和胃降逆，茯苓助升脾氣去除水濕，甘草補脾胃，生姜散寒。臨床應用桔梗元參湯治療AR 可獲得良好的治療效果[8-10]，高健美等[11]對其作用機制進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)桔梗元參湯能降低AR 小鼠鼻黏膜中p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和黏膜黏蛋白5AC（mucin 5AC, MUC5AC）的表達，通過調(diào)控p38MAPK/COX-2 信號轉(zhuǎn)導途徑而發(fā)揮作用。 但是尚未見桔梗元參湯治療AR 的作用靶點及分子機制研究。

網(wǎng)絡藥理學是通過計算機軟件和生物數(shù)據(jù)庫，分析疾病的相關(guān)基因與藥物靶點之間的生物網(wǎng)絡關(guān)系，特別適用于中藥及復方作用機制的研究[12]。由于桔梗元參湯組成成分復雜，治療AR 的機制還未完全了解清楚。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學探究桔梗元參湯的活性成分以及疾病的相關(guān)靶點，構(gòu)建桔梗元參湯活性成分-靶點-AR 網(wǎng)絡，探究桔梗元參湯治療AR 的作用機制，為桔梗元參湯的臨床應用及機制研究提供一定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 桔梗元參湯活性成分的檢索

通過TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫分別以桔梗、元參、苦杏仁、陳皮、法半夏、茯苓、甘草和生姜為關(guān)鍵詞檢索桔梗元參湯的活性成分。參考藥代動力學ADME 參數(shù)，以口服生物利用度口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、化合物類藥性(drug likeness, DL)≥0.18 為條件進行藥物活性成分的篩選[13]。

1.2 桔梗元參湯活性成分靶點和AR 靶點的預測

通過PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫檢索到的活性成分2D 和3D 結(jié)構(gòu)，導入pharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）數(shù)據(jù)庫預測活性成分的相關(guān)靶點。 通過OMIM（https://omim.org/）、NCBI Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫獲取AR 相關(guān)靶點。將桔梗元參湯活性成分靶點與AR 疾病靶點相互映射，獲得桔梗元參湯活性成分靶點-AR 疾病靶點。

1.3 桔梗元參湯靶點相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建

將桔梗元參湯活性成分靶點-AR 疾病靶點導入STRING（https://STRING-db.org），得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡（protein-protein interaction network, PPI）。 將該蛋白質(zhì)網(wǎng)絡導入Cytoscape 3.8.1軟件，采用Network analyzer 計算Degree 值，獲得桔梗元參湯治療AR 的關(guān)鍵靶點，構(gòu)建桔梗元參湯-成分-靶點-AR 網(wǎng)絡模型。通過Network Analyzer 軟件對構(gòu)建的網(wǎng)絡模型進行深度分析。

1.4 桔梗元參湯治療AR 功能和通路富集分析

將PPI 中的靶點導入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/），對桔梗元參湯治療AR 的相關(guān)靶點進行GO 富集和KEGG 通路富集分析，明確桔梗元參湯治療AR的相關(guān)活性成分與靶點在細胞內(nèi)發(fā)生反應的位置、涉及的分子功能和生物學過程。

1.5 分子對接

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載化合物3D 結(jié)構(gòu)SDF格式，并利用PDB（https://www.rcsb.org/）篩選并下載分辨率小于2.5A 的靶點的結(jié)晶復合式，采用Autodock Vina 軟件進行分子對接，刪除靶點內(nèi)水分子，添加氫原子，抽取蛋白原配體，生成對接空腔。 運用PyMol 2.4.0對分子對接的結(jié)果進行可視化處理，通過觀察對接親和力得分來反映分子間結(jié)合的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 桔梗元參湯活性成分篩選及靶點預測

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索桔梗元參湯中的所有成分。獲取桔梗元參湯含活性成分155 個，其中桔梗7 個、元參9 個、苦杏仁19 個、橘皮5 個、半夏13個、茯苓15 個、甘草92 個、生姜5 個，有11 個為共有活性成分。 根據(jù)桔梗元參湯活性成分進行作用靶點預測，刪除冗雜和無靶點活性成分，篩選出98 個活性成分，對應靶點239 個。桔梗元參湯的主要活性成分見表1。

表1 桔梗元參湯治療AR 的主要活性成分

2.2 AR 相關(guān)靶點的篩選

通過NCBI Gene、GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫獲取AR 相關(guān)的靶點。 刪除重復，得到AR 相關(guān)基因2206 個，再經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)化。

續(xù)表1

2.3 桔梗元參湯活性成分-AR 疾病靶點的預測

將桔梗元參湯活性成分對應的239 個靶點與AR2206 個靶點相互映射，繪制韋恩圖，得到共有靶點120 個。 詳見圖1。

圖1 桔梗元參湯活性成分對應靶點-AR 相關(guān)靶點韋恩圖

2.4 桔梗元參湯活性成分靶點-AR 靶點的PPI 網(wǎng)絡

將桔梗元參湯活性成分所對應的239 個靶點基因與AR 相關(guān)的2206 個靶基因相互映射，得到120個共有靶點基因。將靶點基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡，刪除網(wǎng)絡中斷開連接的節(jié)點，并通過Cytoscape 3.8.1 將PPI 網(wǎng)絡可視化，顏色深淺和形狀大小與該基因在網(wǎng)絡中的作用強弱呈正比，結(jié)果表明STAT3、JUN、MAPK1 和IL-6 等為桔梗元參湯治療AR 的核心靶點。 詳見圖2。

圖2 桔梗元參湯成分-AR 靶點的相互作用網(wǎng)絡可視化

2.5 桔梗元參湯-成分-靶點-AR 網(wǎng)絡構(gòu)建

采用Cytoscape 3.8.1 軟件進行網(wǎng)絡分析，結(jié)果如圖3 所示。 該網(wǎng)絡中共有218 個節(jié)點（98 個成分節(jié)點和120 個靶點節(jié)點）和1398 條邊。

圖3 桔梗元參湯-活性成分-靶點-AR 網(wǎng)絡

2.6 桔梗元參湯成分-AR 靶點的GO 功能富集分析

通過對桔梗元參湯活性成分-AR 靶點進行GO功能富集分析。 確定了2232 個GO 條目（P＜0.05）。其中，生物過程（Biological process, BP）主要涉及對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應和對抗生素的反應等2052 個；細胞組成（cellular component,CC）主要包括膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)等52 個；分子功能（molecular function, MF）主要涉及細胞因子活性、細胞因子受體結(jié)合和核受體活性等128 個。 根據(jù)P 值大小篩選出排名前10 位的功能分析，詳見圖4。

2.7 桔梗元參湯活性成分-疾病靶點的KEGG 通路富集分析

通過對桔梗元參湯活性成分-AR 靶點進行KEGG 通路富集分析。限定P＜0.05，獲得165 條富集結(jié)果。 根據(jù)P 值的大小得到排名前20 的代謝通路，包括AGE-RAGE、IL-17、TNF、HIF-1、PI3K-Akt 等通路。 詳見圖5-6。

圖5 桔梗元參湯活性成分-AR 靶點KEGG 通路分析

2.8 分子對接分析

將桔梗元參湯中幾味重要中藥的主要成分β谷甾醇、茯苓酸、橙皮苷和姜醇與核心靶點的對接結(jié)果通過PyMol 進行可視化處理，匹配度良好，化合物與靶點結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象以氫鍵的方式呈現(xiàn)，結(jié)合活性良好。 詳見表2、圖7。

圖7 桔梗元參湯中活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接的可視化圖

表2 桔梗元參湯中活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接結(jié)合能（kcal·mol-1）

3 討論

近年來，隨著環(huán)境條件和生活方式的改變，AR發(fā)病率不斷升高[14]。 中醫(yī)學將該病歸屬于“鼻鼽”范疇，認為與脾、肺和腎相關(guān)，肺氣虛弱，衛(wèi)表不固，風寒襲肺，鼻竅堵塞，則出現(xiàn)鼻鼽。一般采用祛風解表、溫肺益氣和宣通鼻竅等治療為主[15]。 《嚴氏濟生方》中描述：“鼻者，肺之所主，職司清化，調(diào)適得宜?！狈瓮ǜ[于鼻，調(diào)節(jié)氣的升降出入。 而鼻為肺之門戶，氣機借鼻腔出入。 外感邪氣，由鼻入肺，出現(xiàn)鼻竅不利，肺金不清，宣降失常，導致氣機出入不暢。 桔梗元參湯治療流清鼻涕的AR，通過升降氣機，去除寒邪，調(diào)理脾胃氣機升降，調(diào)暢肺氣，使得正氣得以伸張[7]。

圖6 桔梗元參湯活性成分-AR 靶點KEGG 部分通路圖

本研究應用網(wǎng)絡藥理學對桔梗元參湯進行分析，發(fā)現(xiàn)有98 個活性成分。其中，槲皮素屬于黃酮類化合物，具有抗過敏、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學功能[16]。研究發(fā)現(xiàn)，AR 患者鼻黏膜受感覺神經(jīng)、交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)的支配，受到外界變應原刺激后，感覺神經(jīng)能產(chǎn)生P 物質(zhì)（substance P, SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）等神經(jīng)肽，刺激鼻黏膜的血管擴張、水腫并激活炎癥細胞，促進AR 的發(fā)生發(fā)展[17]。 KASHIWABARA 等[18]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可減輕致敏大鼠鼻神經(jīng)源性炎癥和過敏樣癥狀，可能是通過抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases1/2, ERK1/2）和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）信號通路，降低SP 和CGRP 等神經(jīng)肽的水平。 另有研究發(fā)現(xiàn)SP 和CGRP 降低可抑制巨噬細胞的活化，減少IL-1β、IL-3 和TNF-α 等促炎性細胞因子的產(chǎn)生，抑制鼻過敏樣癥狀的發(fā)展[19]。 TANAKA 等[20]報道槲皮素在體外可抑制IL-4 誘導的CD4+T 細胞產(chǎn)生IL-5和IL-13，調(diào)節(jié)Th1/Th2 細胞因子平衡，達到治療過敏性疾病包括AR 的目的。 高健美等[21]用桔梗元參湯治療AR 小鼠，發(fā)現(xiàn)血清中Th1 型細胞因子（IFN-γ 和IL-2）含量明顯升高，Th2 型細胞因子（IL-4 和IL-10）降低。 因此，桔梗元參湯中的槲皮素可調(diào)節(jié)機體的免疫功能，保持Th1/Th2 平衡，在AR 的治療過程中可能發(fā)揮重要的作用。 木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有良好的抗過敏作用。 通過塵螨致敏建立AR 小鼠模型，發(fā)現(xiàn)木犀草素可抑制該模型小鼠中pSTAT6 和GATA3 表達，減少分泌IL-4 的脾細胞數(shù)量，降低血清特異性IgE 水平，減少嗜酸性粒細胞浸潤和小鼠鼻上皮粘液分泌，有效減輕AR的癥狀[22]。 黃芩素也是一種有效抗過敏的黃酮類化合物，有研究發(fā)現(xiàn)其能減輕AR 小鼠的組織學改變、異常組織修復和炎癥反應，抑制血液和鼻腔灌洗液中TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥細胞因子的產(chǎn)生，同時減少嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的浸潤，其機制是減少STAT3 磷酸化和調(diào)節(jié)核的轉(zhuǎn)位[23]。 鄭永艷等[24]發(fā)現(xiàn)兒茶素可明顯抑制組胺所致腸管收縮，提示兒茶素是抗過敏作用的重要活性物質(zhì)。另有研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素可有效減輕AR 的癥狀，其機制是通過NF-κB/TSLP 途徑抑制胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin, TSLP）的表達，降低血清中IL-5、IL-13 和IgE 的水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡[25]。

桔梗元參湯與AR 相互作用的靶點基因功能富集分析顯示，絕大部分功能富集在信號傳導中，主要涉及AGE-RAGE、IL-17、T 細胞受體信號通路、MAPK 信號通路、TNF、C 型凝集素受體和HIF-1α等信號通路，其中IL-17 信號通路在AR 的發(fā)病中可能起著比較重要的作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，AR 患者的血清IL-17 水平明顯高于正常人[26]。 從AR 患者的外周血單個核細胞中去除Th17 細胞后，IgE 水平降低，而加入重組IL-17 后可恢復IgE 水平。 同時，與正常對照組相比，IL-17 可促進AR 患者B 細胞產(chǎn)生IgE[27]。 有研究發(fā)現(xiàn)，AR 患者鼻黏膜中的抗原提呈細胞能向初始T 淋巴細胞遞呈過敏原，導致效應性T 淋巴細胞的分化、產(chǎn)生Th2 型細胞因子和抗原特異性IgE。 其中， 調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells,Tregs）可抑制細胞因子的分泌，維持免疫耐受[28]。PALOMARES 等[29]發(fā)現(xiàn)Tregs 能夠抑制IgE 的產(chǎn)生，對于健康免疫應答和免疫耐受的產(chǎn)生必不可少。AKDI 等[30]研究報道過敏人群中過敏原特異性Tregs數(shù)量顯著減少。上述均提示，桔梗元參湯中的有效活性成分可能通過調(diào)節(jié)T 受體細胞通路，誘導T 淋巴細胞向Tregs 分化，從而抑制IgE 的分泌，防治AR的發(fā)生發(fā)展。

高健美等[11]研究發(fā)現(xiàn)桔梗元參湯能夠顯著改善AR 模型小鼠的癥狀，降低血清IgE 水平。同時，顯著降低了模型小鼠鼻黏膜中p38MAPK、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和MUC5AC 的蛋白表達，表明桔梗元參湯可通過p38MAPK/COX-2 信號通路調(diào)節(jié)MUC5AC 的表達而發(fā)揮治療AR 作用。 本研究也發(fā)現(xiàn)，MAPK 信號通路是桔梗元參湯治療AR的關(guān)鍵信號通路。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學對桔梗元參湯治療AR 的作用機制進行了初步分析，發(fā)現(xiàn)桔梗元參湯活性成分-疾病靶點分析顯示活性成分通過多條信號通路發(fā)揮作用。 這些結(jié)果表明桔梗元參湯是通過多成分-多靶點-多途徑發(fā)揮治療AR 的作用，活性成分與信號通路的相互作用為下一步研究提供了方向。