劉靜 李龍 馬喜迎

重癥肺結核是呼吸內科常見疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均較高[1]。普通肺結核防治不當極易進展為重癥肺結核，患者常會由于多器官衰竭而死亡，因此，對重癥肺結核患者進行早期診斷和防治，能有效改善患者預后，減輕患者和社會負擔。目前，臨床診斷中，結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）培養(yǎng)通常被認為是診斷結核病的金標準，且是檢驗MTB耐藥性的關鍵步驟[2]。然而，MTB培養(yǎng)是一個相對緩慢的過程。目前用于診斷MTB感染的方法有酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）和γ-干擾素釋放試驗（interferon-gamma release assay，IGRA）等，這些方法的敏感性和特異性無法兼顧，均存在一些檢測缺陷[3]。研究者需要面對的首要難點是篩選和優(yōu)化可用于MTB感染診斷的抗原[4]。目前，培養(yǎng)濾液蛋白10 （culture filtrate protein-10，CFP-10）和早期分泌靶抗原6（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）是常用的診斷方法的核心抗原，但不同人群的檢測結果有時不一致[5]。因此，篩選更多可用于臨床鑒別的MTB候選抗原是提高MTB診斷精確度的關鍵。fadD9是一種MTB脂質代謝相關基因，具體功能尚需確認[6]。已有研究報道[7]，F(xiàn)adD9蛋白在活動性結核病診斷中具有一定潛力。然而，未有研究探討FadD9蛋白在重癥肺結核診斷中的診斷價值以及對預后的預測價值。因此，本研究通過基因表達和蛋白純化獲得FadD9重組蛋白，并分析其在診斷重癥肺結核患者MTB感染中的潛在價值，以期為臨床研究提供理論依據。

資料與方法

1 臨床資料 選取2018年1月～2021年2月我院收治的127例重癥肺結核患者（重癥肺結核組），74例非重癥肺結核患者（非重癥肺結核組），選取同期與結核病患者有1年以上密切接觸史患者36例（密接組）及我院體檢健康者92例（對照組），對照組不曾與結核病患者密切接觸過，且無結核病史及臨床結核癥狀。

重癥肺結核組納入標準：（1）年齡≥18周歲；（2） 符合《肺結核基層診療指南（2018年）》[8]中重癥肺結核患者診斷標準。重癥肺結核組排除標準：（1） 臨床資料不全；（2）自行出院或中途轉院者；（3）合并癌癥、病毒性肝炎等可引起肝腎損害的疾?。唬?）入院24 h內死亡。本研究已經我院倫理委員會批準（倫理證書編號：[2019]-088），受試者簽署知情同意書。

2 FadD9重組蛋白制備、鑒定及評估

2.1 FadD9重組蛋白的制備和鑒定：fadD9基因序列（基因ID：888574）從美國國立生物技術信息中心網站上獲取。以MTB H37 Rv基因組為模板，用fadD9基因的上下游引物（上游引物：5'-CACCCTAGGTACA GCTAGTTGCTAGTCGCTGACTG-3'，下游引物：5'-ATATTCGAAAGTGTCGTCGGGCTCGTCAGCGTC-3'）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。PCR產物連接到pET28a載體中，對重組表達質粒進行測序，并轉入大腸埃希菌（DE3）中，涂在LB培養(yǎng)基上（含50 μg/mL卡那霉素），37 ℃過夜，隨機挑選單個菌落，進行擴大培養(yǎng)。待菌液濁度達到0.6（600 nm處吸光度）時繼續(xù)進行誘導培養(yǎng)3 h，12000×g離心1 min，收集菌體并見超聲裂解，4 ℃ 12000×g離心10 min，收集上清液，純化，獲得FadD9重組蛋白，再使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定純度。

2.2 FadD9抗原免疫原性評估：選取C57BL/6小鼠8只，每組4只。FadD9免疫組注射弗氏佐劑50 μL和FadD9蛋白50 μL（美國Sigma公司）的混合物，陽性對照組注射Ag85a蛋白50 μL和50 μL弗氏佐劑的混合物，陰性對照組注射等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）。分別于第1、3、5周對2組小鼠進行免疫注射，第1次免疫注射弗氏完全佐劑，第2、3次使用弗氏不完全佐劑。首次免疫8周后提取小鼠血清和脾臟淋巴細胞，并使用ELISA檢測脾細胞FadD9重組蛋白的特異性IgG抗體水平及脾細胞的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素-2（interleukin 2，IL-2）、γ-干擾素（interferongamma，IFN-γ）。

2.3 血清中FadD9重組蛋白與特異性抗體的反應水平：以FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白為抗原，以重癥肺結核組、密接組和對照組的血清樣本分別按1∶100進行稀釋，作為一抗。以過氧化物酶標記的山羊抗人IgG（美國CMCTAG公司）作為二抗，按1∶3000稀釋。檢測3組抗原抗體特異性反應水平。

2.4 FadD9重組蛋白聯(lián)合IGRA檢測細胞免疫水平：將FadD9重組蛋白作為抗原與重癥肺結核組和非重癥肺結核患者的血樣本37℃共孵育24 h后，進行IGRA，試劑盒（ELISA）購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，檢測FadD9重組蛋白的細胞免疫水平。

3 觀察指標 記錄陰性對照組、陽性對照組和抗原FadD9重組蛋白免疫后小鼠血清中的IgG（H+L）效價來評估C57BL/6小鼠經FadD9免疫后的血清抗體水平；記錄FadD9免疫組和陽性對照組小鼠脾細胞的IL-2、IFN-γ和TNF-α水平及FadD9重組蛋白免疫后小鼠血清中的IgG抗體水平來評估FadD9抗原免疫原性；記錄重癥肺結核組、密接組和對照組的FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白特異性抗體水平；記錄并統(tǒng)計重癥肺結核患者預后，并依據預后死亡情況分為：存活組和死亡組；記錄存活組和死亡組患者的性別、年齡、BMI、病變范圍、APACHE Ⅱ評分、初始治療規(guī)律性、居住地區(qū)、COPD、肺部感染、基礎疾病、窒息、呼吸衰竭、肺性腦病、器官損害數(shù)目、肺心病、血清白蛋白濃度、耐多藥結核菌、血紅蛋白濃度、IGRAs、FadD9重組蛋白的血清抗體水平。

4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS軟件（Version 21.0）進行統(tǒng)計學分析。畫圖采用R軟件（Version 3.6.2）。計量資料使用（±s）表示，首先采用單因素方差進行多組間分析，若差異有統(tǒng)計學意義，則采用事后LSD-t檢驗進行兩組間比較；計數(shù)資料采用頻數(shù)（百分比）表示，采用χ2檢驗進行分析。統(tǒng)計重癥肺結核患者的存活率，據此分為存活組和死亡組，比較2組患者的一般臨床資料，并采用Cox比例風險回歸篩選出影響重癥肺結核患者死亡的危險因素，納入并建立Nomogram預測模型，計算一致性指數(shù)（C-index）。分別使用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）、校準曲線、臨床決策曲線對Nomogram預測模型的區(qū)分度、校準度和臨床有效性進行評價。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1 FadD9重組蛋白的制備、鑒定及免疫原性評估 將FadD9重組蛋白進行純化后，經10% SDS-PAGE鑒定，蛋白純度大于95%?？乖て鸬捏w液免疫水平通過抗原免疫后小鼠血清中的IgG（H+L）效價進行評估。與陽性參照抗原Ag85A蛋白相比，F(xiàn)adD9重組蛋白的A值變化與其基本一致，且均高于陰性對照組。FadD9重組蛋白的血清抗體滴度達1∶12800，與參照抗原Ag85A蛋白接近。見圖1。

圖1 C57BL/6小鼠經FadD9免疫后的血清抗體水平

比較FadD9免疫組和陽性對照組小鼠脾細胞的IL-2、IFN-γ和TNF-α水平，結果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)adD9免疫組IL-2、TNF-α和IFN-γ水平分別為126.95、225.87、395.92 pg/mL，三者比例為1.00∶1.78∶3.12。陽性對照組分別為163.30、188.67、329.86 pg/mL，三者比例為1.00∶1.16∶2.02。

2 FadD9重組蛋白的特異性抗體水平評估 比較重癥肺結核組、密接組和對照組的FadD9重組蛋白和Ag85A蛋白特異性抗體水平，結果發(fā)現(xiàn)，重癥肺結核組抗FadD9抗體水平明顯高于密接組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（F=12.306，P＜0.001），密接組和對照組間差異無統(tǒng)計學意義（t=1.208，P＞0.05）。3組間的抗Ag85A抗體水平差異均無統(tǒng)計學意義（F=2.467，P＞0.05）。見圖2。

圖2 FadD9重組蛋白的特異性抗體水平評估

3 重癥肺結核患者中存活組和死亡組一般臨床資料比較 127例重癥肺結核患者經治療最終存活93例（存活組），死亡34例（死亡組），死亡率36.56%（34/127）。比較2組患者的一般臨床資料，結果發(fā)現(xiàn)，2組患者的性別、飲酒、年齡、吸煙、病變范圍差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；2組的BMI、APACHE Ⅱ評分、初始治療規(guī)律性、COPD、肺部感染、呼吸衰竭、窒息、肺心病、器官損害數(shù)目、多重耐藥結核菌、血清白蛋白濃度、IGRA、FadD9重組蛋白的血清抗體水平差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 重癥肺結核患者中存活組和死亡組一般臨床資料比較[±s，n （%）]

表1 重癥肺結核患者中存活組和死亡組一般臨床資料比較[±s，n （%）]

項目 存活組（n=93） 死亡組（n=34） t/χ2 P男/女 63/3025/90.3920.531 年齡（歲） 61.42±10.6762.75±11.090.6150.539 BMI（kg/m2） 21.73±3.2617.28±2.717.107 ＜0.001 飲酒 – – 0.0370.848 是2910––否6424––吸煙 – – 1.3900.238 是4119––否5215––病變范圍（肺野， 個） 4.16±0.594.22±0.630.4980.619 APACHE Ⅱ評分（分） 15.10±2.4521.37±3.1811.752 ＜0.001 初始治療規(guī)律性 – – 4.8430.028 否1411––是8023––居住地區(qū) – – 0.1520.696 農村 3414 – –城市 5720 – –COPD – –9.7740.002 有1612––無7722––基礎疾病 – – 2.9930.084 有2214––無7122––肺部感染 – – 14.370 ＜0.001 有5131––

續(xù)表1

4 重癥肺結核患者死亡危險因素的Cox比例風險回歸分析 以重癥肺結核患者的生存狀態(tài)（1=死亡，0=截尾）為因變量，將以上差異有統(tǒng)計學意義的變量作為自變量納入Cox比例風險回歸分析，采用逐步回歸法，結果顯示，BMI、APACHE Ⅱ、COPD、肺部感染、呼吸衰竭、肺心病、器官損害、多重耐藥結核菌、低血清白蛋白濃度、IGRA、FadD9重組蛋白抗體水平均是重癥肺結核患者死亡的危險因素（P＜0.05），見表2。

表2 重癥肺結核患者死亡危險因素的Cox比例風險回歸分析

5 Nomogram模型建立 將危險因素作為預測因子構建Nomogram模型，并進行內部數(shù)據驗證。結果顯示，內部數(shù)據驗證結果顯示，C-index為0.742（95%CI：0.684～0.845）。見圖3。

圖3 預測重癥肺結核患者死亡的Nomogram模型

6 ROC曲線評價Nomogram模型的預測效能 采用ROC曲線評價Nomogram模型預測重癥肺結核患者死亡的Nomogram模型的效能，結果如表3和圖4所示，Nomogram模型的曲線下面積為0.802（95%CI：0.764～0.840，P＜0.001），靈敏度、特異度及約登指數(shù)分別為85.42%、74.05%和0.595，具有較高的預測效能。

表3 ROC曲線評價模型的預測效能

圖4 ROC曲線分析Nomogram模型的預測效能

7 Nomogram模型的準確度及有效性評價 Nomogram模型的校準度和有效性分別采用校準曲線和臨床決策曲線進行評價，結果如圖5所示，當事件發(fā)生率為36%和84%時，模型預測和觀察值完全一致，當事件發(fā)生率＜37%時，預測高估風險；當事件發(fā)生率在37%～83%時，預測低估風險；當事件發(fā)生率在78%～100%時，預測高估風險。整體上看Nomogram模型預測重癥肺結核患者死亡的準確度較好。臨床決策曲線可以看出，Nomogram模型的凈獲益值較高，有效性較好。

圖5 Nomogram模型的準確度和有效性評價

8 IGRAs和FadD9重組蛋白診斷重癥肺結核的效能 將FadD9重組蛋白作為抗原與重癥肺結核組和非重癥肺結核組的全血樣本37 ℃孵育24 h左右，進行IGRA。ROC曲線分析顯示，F(xiàn)adD9重組蛋白診斷重癥肺結核的曲線下面積為0.748，最佳臨界值為0.352，敏感性為97.33%，特異性為72.51%。見表4、圖6。

表4 IGRAs和FadD9重組蛋白診斷重癥肺結核的效能

圖6 IGRAs標準管和FadD9重組蛋白診斷重癥肺結核的ROC曲線

討論

病原學檢查是目前結核病的診斷金標準，但由于潛伏感染、痰培養(yǎng)陰性結核病及重癥肺結核患者逐漸增多，且MTB生長緩慢等，限制了病原學檢查的即時性和準確性[9]。相比較而言，免疫學檢查更加快速，且特異性和靈敏性更高，已被廣泛應用于臨床實踐中[10]。目前，臨床上診斷MTB感染的主要免疫學方法有ELISPOT、ELISA和IGRA等。其中IGRA已被廣泛應用于臨床應用中，既往不同研究顯示[11]，IGRA對結核病的敏感性為83%～100%，本研究IGRA單獨診斷重癥肺結核患者的敏感性為94.51%，與既往研究基本一致。IGRA基于MTB感染后體內記憶T細胞增多，在特定抗原刺激下，記憶T細胞增殖，IGRA針對細胞免疫，檢測IFN-γ的分泌量。IGRA使用的核心抗原為CFP-10和ESAT-6，對活動性肺結核診斷有效性較高[12]。但無法較好地區(qū)分潛伏性肺結核和活動性肺結核，只適用于MTB感染的輔助診斷，因此，臨床迫切需要運用新型抗原檢測來預警肺結核病變階段和預后結局等。

FadD9可能與脂質降解相關。在小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)adD9抗原可誘導Th1型細胞分泌IFN-γ、TNF-α和IL-2[13]。IFN-γ作為控制MTB感染的重要細胞因子，也是IGRA的效應因子，IFN-γ的分泌量是IGRA診斷成功的基礎[14]。TNF-α可在MTB感染部位招募到更多免疫細胞，從而抑制MTB在機體內的傳播。IL-2可促進細胞毒性T淋巴細胞增殖。這些細胞因子均可提示FadD9重組蛋白在宿主-病原體作用過程中發(fā)揮關鍵細胞免疫作用。本研究制備的FadD9重組蛋白激發(fā)的小鼠特異性抗體水平與陽性參照接近，提示在MTB感染者體內，F(xiàn)adD9重組蛋白可同時促發(fā)較高水平的細胞和體液免疫反應。此外，重癥肺結核組FadD9抗體水平高于密接組和對照組，而密接組和對照組受試者間差異無統(tǒng)計學意義，提示FadD9重組蛋白可用于重癥肺結核患者的血清學診斷試驗。本研究進一步通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)adD9重組蛋白診斷重癥肺結核的AUC為0.748，提示FadD9重組蛋白具有用于IGRA的潛力。

以往有研究發(fā)現(xiàn)[15]，重癥肺結核病死率為19.1%。也有研究報道[16]，重癥肺結核病死率高達30.4%，高于相關研究。本研究以我院呼吸科重癥肺結核患者統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，重癥肺結核病死率為26.77%（34/127），與以往研究結果接近。本研究進一步通過構建Cox比例風險回歸模型分析預測重癥肺結核死亡風險的影響因素，結果發(fā)現(xiàn)，APACHE Ⅱ、COPD、肺心病、呼吸衰竭、肺部感染、BMI低、低血清白蛋白濃度、器官損害、多重耐藥結核菌、IGRA、FadD9重組蛋白均是預測重癥肺結核患者死亡的可能危險因素。本研究127例重癥肺結核患者存活組中，4例IGRA結果陽性，89例結果陰性；死亡組中，29例IGRA結果陽性，5例結果陰性。此外，2組的FadD9重組蛋白的血清抗體水平差異有統(tǒng)計學意義。提示IGRA和FadD9重組蛋白的血清抗體水平可以很好區(qū)分重癥肺結核患者預后。臨床常采用APACHE Ⅱ評分評估重癥肺結核患者預后[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，死亡組患者的APACHE Ⅱ分值明顯高于存活組，APACHE Ⅱ分值較高可能預示著病死率較高。這與國內研究報告相符[18]。重癥肺結核伴COPD、肺心病并發(fā)癥，易引起嚴重的呼吸功能障礙，發(fā)生呼吸衰竭，機體缺氧和二氧化碳潴留，導致機體生理功能及代謝紊亂，病死風險增加。也有研究報道重癥肺結核伴氣胸、COPD、肺心病等并發(fā)癥或合并癥患者的致死率增加[19]，與本研究結果一致。肺結核為慢性消耗性疾病，患者免疫功能低下，易并發(fā)肺部感染等疾病，引起組織水腫，導致呼吸功能無力等癥狀，死亡風險增加[20]。器官損害數(shù)目多的重癥肺結核患者更易發(fā)生多器官功能衰竭，預后不良，與以往研究結果一致[21]。多重耐藥結核菌感染患者致病菌毒性較強，且對兩種以上一線抗結核藥物耐藥，高耐藥性導致難以控制MTB繁殖，病情極易加重，最終導致患者病死率增加[22]。

列線圖作為一種圖表工具，可直觀展示統(tǒng)計模型，并得到目標事件的數(shù)值概率，量化風險更加精確。已有研究報道，列線圖可以預測肝細胞癌患者腹腔鏡肝切除術后復發(fā)風險[23]、老年早期胃癌患者內鏡黏膜下剝離術后復發(fā)風險[24]、宮頸上皮內瘤變患者宮頸環(huán)形電切術后復發(fā)風險[25]等。本次研究將列線圖模型應用于預測臨床重癥肺結核患者死亡預后發(fā)生風險，結果發(fā)現(xiàn)，Nomogram模型C-index值為0.742（95%CI：0.684～0.845），表明其區(qū)分度高，具有較好的預測價值，在一定程度上可作為臨床重癥肺結核患者死亡預后輔助預測工具，但由于本研究樣本量容量有限，Nomogram模型的臨床實踐價值還需要更多的臨床數(shù)據進行驗證。

綜上所述，IGRA可有效診斷重癥肺結核，F(xiàn)adD9重組蛋白可作為IGRA新型抗原組合的候選成分，用于診斷重癥肺結核的敏感性較高。本研究構建的Nomogram模型在一定程度上可作為臨床重癥肺結核患者死亡輔助預測工具。本研究不足：納入病例數(shù)較少，且未對FadD9重組蛋白與CFP-10和ESAT-6進行對比分析，因此后續(xù)會增加樣本量，進一步探討相比于CFP-10和ESAT-6，F(xiàn)adD9重組蛋白作為IGRA核心抗原的優(yōu)勢。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突