吳軍營 王凌霞 吳茜茜 朱志宸 王波 楊歡

近日，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球最新癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示：女性乳腺癌發(fā)病人數(shù)首次超過肺癌，成為全球最常見的癌癥。全球有超過226萬女性患有乳腺癌，約占所有新確診癌癥人數(shù)的11.7%，占女性新確診癌癥人數(shù)的24.5%，居女性癌癥發(fā)病人數(shù)的首位[1]。早診早治是減輕乳腺癌危害的最好辦法之一，早期乳腺癌患者的5年生存率可達(dá)95%。而傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物如CA153和CEA等在乳腺癌的篩查及診斷方面缺乏特異性，因此尋找特異的分子標(biāo)志物也將為乳腺癌的篩查、早期診斷及復(fù)發(fā)監(jiān)測提供可靠的支持，對乳腺癌的診治具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

IκBζ蛋白由NFKBIZ基因編碼，是細(xì)胞核IκB蛋白家族的第三個(gè)成員，最早于2000年被KITAMURA等人在LPS刺激的巨噬細(xì)胞核內(nèi)發(fā)現(xiàn)[2]。有研究顯示，IκBζ與炎癥及腫瘤密切相關(guān)。在病原體引起的炎癥反應(yīng)中，IκBζ可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌促炎因子IL-6、IL-12和CCL2及抑炎因子IL-10[3]。在肺炎球菌肺部感染中，IκBζ通過促進(jìn)單核細(xì)胞分泌IL-6及GM-CSF發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[4]。在腫瘤中IκBζ具有抑癌和促癌的雙重作用。IκBζ在活化B細(xì)胞（ABC）彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）患者表達(dá)水平顯著升高，IκBζ表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞死亡，在ABC和DLBCL中發(fā)揮促癌作用[5]。IκBζ在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，IκBζ水平越高，IL-6、IL-8和CXCL1表達(dá)越高，患者生存時(shí)間越短，具有促癌作用[6]。但是，也有研究報(bào)道IκBζ過表達(dá)可下調(diào)STAT3轉(zhuǎn)錄活性，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7]。到目前為止，IκBζ在乳腺癌中的表達(dá)及生物學(xué)作用尚不明確。本文以乳腺癌為研究對象，探討NFKBIZ基因在乳腺癌發(fā)展過程中的作用并結(jié)合臨床資料分析其臨床診斷價(jià)值。

材料與方法

1 材料

1.1 臨床資料：選取2017年8月～2018年4月，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外科收治的19例乳腺癌患者的癌組織以及癌旁組織，并收集相應(yīng)病理資料。所有病例均滿足以下條件：①組織標(biāo)本病理切片經(jīng)過病理科的鑒定，確定為對應(yīng)的癌組織或癌旁組織；②患者未進(jìn)行其他的抗腫瘤治療；③患者未患有會(huì)影響NFKBIZ基因表達(dá)的其他疾病。該研究經(jīng)過蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：JD-LK-2021-115-01）。

1.2 細(xì)胞及試劑：人乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7、MDAMB-231細(xì)胞）（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司）；Trizol試劑（Sigma公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（Vazyme公司）；siRNA干擾序列（蘇州吉瑪基因股份有限公司）；Lipofectamine 2000 Reagents（Invitrogen公司）；Transwell 小室（Corning公司）；RIPA、PMSF、0.25%胰酶（碧云天生物技術(shù)有限公司）；GAPDH、IκBζ抗體（Abcam公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：乳腺癌細(xì)胞系（MCF-7和MDA-MB-231）用含有10%胎牛血清、加入青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用siR-NFKBIZ干擾序列（序列見表1）轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染6 h后更換培養(yǎng)液，48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qPCR檢測NFKBIZ基因表達(dá)水平，判斷敲減效率，同時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 siRNA序列

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）：參照試劑說明書，使用Trizol試劑提取組織及細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在QuantStudio 3 system進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并采用2-ΔΔCt方法分析NFKBIZ基因相對表達(dá)水平。選擇GAPDH作為內(nèi)參。引物序列見表2。

表2 引物序列

2.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）：參照試劑使用說明書，使用RIPA裂解液提取乳腺癌及良性乳腺病組織總蛋白，加入5×的loading buffer煮沸5 min，置冰上冷卻。通過10%的SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白質(zhì)，300 mA 90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，切割條帶，加入一抗4℃孵育過夜（GAPDH和IκBζ抗體稀釋比例為1∶1000）。TBST清洗3遍，每遍10 min；然后，將膜與二抗（1∶5000）在37 ℃孵育1 h，GAPDH作為內(nèi)參對照。使用Image J軟件分析目標(biāo)條帶。

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)：將siRNA轉(zhuǎn)染48 h的MCF-7細(xì)胞（1×103個(gè)/孔）接種于6孔板中。恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d后，移除培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗1次，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗3次，晾干后拍照，使用Image J軟件進(jìn)行克隆細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)?？寺⌒纬陕剩?）＝（克隆團(tuán)數(shù)／接種細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.5 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：使用Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞后對細(xì)胞遷移能力的影響。將轉(zhuǎn)染48 h后的MCF-7細(xì)胞，用DMEM無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，在Transwell小室上層加入200 μL細(xì)胞懸液（即1×105個(gè)/孔），在小室下層中加入600 μL含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，棄去小室上層中的培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，醫(yī)用棉簽輕柔擦拭小室上層內(nèi)側(cè)未遷移的細(xì)胞，PBS洗滌3遍，室溫下自然干燥后用倒置顯微鏡拍攝記錄，每孔至少選擇三個(gè)視野，并使用Image J軟件計(jì)數(shù)后取平均值，結(jié)果采用±SD形式表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0及GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)（student's T test）評(píng)估組間的差異，非正態(tài)分布非配對數(shù)據(jù)采用曼-惠特尼秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U test），非正態(tài)分布配對數(shù)據(jù)則采用威爾科克森符號(hào)秩和檢驗(yàn)（Wilcoxon test），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1NFKBIZ基因在乳腺癌細(xì)胞系及組織中顯著上調(diào) qPCR的結(jié)果顯示（圖1），NFKBIZ基因在三陰型乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的表達(dá)水平顯著高于惡性程度較低的MCF-7細(xì)胞（P=0.0004）；在19對乳腺癌及癌旁組織中，癌組織內(nèi)NFKBIZ的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織（P=0.0046），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 NFKBIZ在乳腺癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)水平

圖2 IκBζ在乳腺癌組織及良性乳腺病組織中的表達(dá)

2NFKBIZ基因編碼蛋白IκBζ在乳腺癌組織中高表達(dá) 免疫組化及WB檢測結(jié)果顯示，乳腺癌組織中IκBζ的表達(dá)水平明顯高于良性乳腺病組織。

3 siRNA敲減效率驗(yàn)證 采用siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后進(jìn)行qPCR檢測，驗(yàn)證siR-NFKBIZ的敲減效率，結(jié)果顯示敲減后NFKBIZ基因的表達(dá)量降低50%左右（P=0.0004，見圖3），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 siRNA敲低效率驗(yàn)證

4NFKBIZ基因敲減后抑制MCF-7細(xì)胞的增殖 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siR-NFKBIZ干擾序列轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7后， MCF-7細(xì)胞的增殖能力明顯減弱（圖4）。

圖4 NFKBIZ基因敲減前后MCF-7細(xì)胞增殖能力比較

5NFKBIZ基因敲減后抑制MCF-7細(xì)胞的遷移 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siR-NFKBIZ轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7后，其遷移能力明顯減弱（圖5）。

圖5 NFKBIZ基因敲減前后MCF-7細(xì)胞的遷移能力比較

6 乳腺癌組織NFKBIZ基因診斷乳腺癌的ROC曲線GraphPad Prism8統(tǒng)計(jì)制圖軟件顯示曲線下面積為0.810，cutoff值為1.418，敏感性為81.8%，特異性為90.9%（圖6）。

圖6 NFKBIZ基因診斷乳腺癌的ROC曲線

7 癌組織內(nèi)NFKBIZ基因表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 結(jié)合19對乳腺癌組織與其配對的癌旁組織NFKBIZ基因的表達(dá)差異倍數(shù)（Fold change）與病理資料進(jìn)行分析，結(jié)果如下：NFKBIZ基因在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、腫瘤大小顯著相關(guān)（P＜0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等無顯著相關(guān)性（P＞0.05）（表3）。

表3 NFKBIZ基因表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討論

在IκBζ蛋白及其編碼基因NFKBIZ被發(fā)現(xiàn)后，其與疾病發(fā)生發(fā)展的研究被相繼報(bào)道。IκBζ對NF-κB的活性有抑制作用[8]，并能通過調(diào)控CCL2、IL-10等炎癥相關(guān)因子來抑制炎癥的發(fā)生[3，9]。但I(xiàn)κBζ也能夠加重一些自身免疫性疾病的發(fā)展，例如銀屑病[10]、干燥綜合征[11]、克羅恩病[12]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]等。同樣IκBζ以及編碼基因NFKBIZ具有促癌和抑癌的雙重作用，例如IκBζ在活化B細(xì)胞彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者體內(nèi)表達(dá)水平顯著升高，在該腫瘤中發(fā)揮促癌作用[5]，而有研究表明IκBζ的過表達(dá)可使STAT3轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，抑制細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用[7]。到目前為止，IκBζ在乳腺癌中的表達(dá)及生物學(xué)作用尚不明確。因此我們通過在mRNA水平敲低NFKBIZ來研究其在乳腺癌中的生物學(xué)功能，以及通過乳腺癌組織中的表達(dá)差異結(jié)合臨床病理資料，探索其作為生物標(biāo)志物的潛在價(jià)值，為臨床的診斷提供可靠依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NFKBIZ基因在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中的表達(dá)水平明顯高于MCF-7，其低表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。在乳腺癌患者中，癌組織內(nèi)的NFKBIZ基因表達(dá)水平明顯上調(diào)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，western blot檢測結(jié)果也顯示其編碼蛋白在癌組織中顯著上調(diào)，說明NFKBIZ基因及其編碼蛋白可能發(fā)揮促癌作用。ROC曲線結(jié)果顯示，利用NFKBIZ基因的相對表達(dá)量cutoff值（1.418）來診斷乳腺癌的敏感度為81.8%，特異度為90.9%，提示其具有一定的診斷效能。因整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程時(shí)間較短，未能進(jìn)行長期連續(xù)的回訪，故未進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)后分析，無法判斷NFKBIZ基因的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性。在與病理參數(shù)相關(guān)性的分析中，發(fā)現(xiàn)NFKBIZ基因與腫瘤大小、病患年齡顯著相關(guān)，而與病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無顯著相關(guān)性。NFKBIZ基因與患者年齡顯著相關(guān)，其可能原因包括：①隨著女性年齡的增大，體內(nèi)的激素水平呈現(xiàn)遞減趨勢，而乳腺癌的患病率和患者體內(nèi)的激素水平存在相關(guān)性[14-15]，也許NFKBIZ基因的表達(dá)水平和激素也存在關(guān)聯(lián)，從而導(dǎo)致患者乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展；②該分析得出的顯著性的差異可能是樣本量不足導(dǎo)致的，需要通過擴(kuò)充樣本量進(jìn)一步確認(rèn)NFKBIZ基因與患者年齡的相關(guān)性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NFKBIZ基因在乳腺癌患者的癌組織中表達(dá)較癌旁組織顯著升高，體外功能實(shí)驗(yàn)顯示其在乳腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮了促癌作用，并且可能成為乳腺癌診斷的新指標(biāo)。但由于收集乳腺癌組織標(biāo)本例數(shù)較少，與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性有待進(jìn)一步確認(rèn)。在以后的研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行檢測以進(jìn)一步驗(yàn)證其在乳腺癌中的診斷價(jià)值，并通過與外泌體等新興領(lǐng)域結(jié)合，探索其作為乳腺癌治療新靶標(biāo)的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突