張兆林 徐 虹 陳凍伢 劉 敏 陳建永

結(jié)腸黑變?。╩elanosis coli，MC）多見于長期便秘以及服用蒽醌類藥物的患者[1-2]，如番瀉葉、大黃、蘆薈、鼠李等，它是一種黑色素或脂褐素沉積在結(jié)腸黏膜固有層的非炎癥性腸道病變。MC 可能與結(jié)腸非腺瘤性息肉和低級別腺瘤的高發(fā)病率及數(shù)量有關(guān)[3-4]。一項動物實驗研究顯示，MC 豚鼠結(jié)腸組織中原癌基因c-myc 的表達(dá)顯著升高，表明該疾病具有癌變傾向[5]。因此早期治療MC，有著非常重要的意義。有研究表明，白及水煎劑可以改善MC，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)結(jié)腸組織Bcl-2 和Bax 表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用[6]。本次研究通過制備MC 模型豚鼠，同時給予10%白及水煎劑灌腸干預(yù)，觀察腸黏膜特殊染色、超微結(jié)構(gòu)以及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，探討白及水煎劑對MC 的改善作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 動 物 健康清潔級豚鼠40 只，雌雄各半，體質(zhì)量（400±20）g，均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供。動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。采用架式籠養(yǎng)，每籠4 只，雌雄分籠，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境條件為20 ℃左右的室溫維持，相對濕度40%～60%，12 h 光照周期的屏障環(huán)境。符合動物實驗倫理要求。

1.2 藥 物 大黃、白及均采購自浙江省醫(yī)藥公司（杭州桐君堂中藥飲片廠，批號20150713，大黃提取工藝：大黃飲片機(jī)械粉碎成粗粉，經(jīng)70%乙醇回流提取液過濾，60 ℃減壓濃縮，制成大黃提取液（每1 mL相當(dāng)于3 g 大黃藥液）。10%白及水煎劑制取工藝：白及飲片干燥、粉碎成粗粉，加入蒸餾水中煎煮過濾雜質(zhì)，合并濾液水浴濃縮成10%白及水煎劑（每1 mL相當(dāng)于0.1 g 白及藥液）。以上實驗藥物制取均委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院完成。

1.3 主要試劑及儀器 甲醛（批號20150623）、無水乙醇（批號20140812）、戊二醛（批號20150422）、二甲苯（批號20150211）、高錳酸鉀（批號20150510）、草酸（批號20150322）、25%烏拉坦（批號20140614）等購自上海試劑一廠；PBS（批號20150123）、Harris 蘇木精液（批號20150313）、伊紅染色液（批號20150718）等購自福州邁新生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC 購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。Becton Dickinson Facscalibour 流式細(xì)胞儀（美國BD公司）、FEITECNAI-10 電鏡（飛利浦）等。

2 方 法

2.1 動物模型制備 40 只豚鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組8 只，模型組16 只和白及組16 只。全部豚鼠均放在鐵籠中，每4 只單籠喂養(yǎng)，造模前禁食不禁水24 h。造模開始，模型組、白及組豚鼠均予大黃提取液6 g/（kg·d）連續(xù)灌胃60 d。灌胃第15 d 起，白及組予10%白及水煎劑灌腸，每周3 次，模型組予等量生理鹽水灌腸；正常組常規(guī)飲水進(jìn)食，同步喂養(yǎng)60 d。

2.2 標(biāo)本取材 造模結(jié)束后，各組豚鼠均禁食、禁飲24 h，予25%烏拉坦按0.7 mL/100 g 的劑量腹腔注射麻醉處死。剖腹后立即剪取盲腸及全段結(jié)腸，沿縱軸剖開，留取適量結(jié)腸標(biāo)本，用4 ℃生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后，置于戊二醛、甲醛、液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 檢測指標(biāo)與方法

2.3.1 褪黑色素染色 結(jié)腸組織石蠟包埋3～5 μm切片，脫蠟；蒸餾水洗2～3 次；入0.25%高錳酸鉀水溶液內(nèi)2 h，水洗后再用1%草酸水溶液漂白水洗；鏡下控制至細(xì)胞內(nèi)外黑色素完全消失；常規(guī)HE 染色后，脫水、透明及封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.3.2 透射電子顯微鏡 將結(jié)腸組織切成1 mm3大小，置于2.5%磷酸緩沖戊二醛固定液中2 h，PBS 沖洗，1%四氧化餓固定2 h，PBS 再次沖洗；依次用乙醇、丙酮作梯度脫水處理，經(jīng)低粘度Spurr 包埋劑包埋后，切片機(jī)半薄切片，甲苯胺藍(lán)染色定位后切成厚度70 nm 的超薄切片，最后用檸檬酸鉛及醋酸鈾雙重染色，置于透射電子顯微鏡下觀察。

2.3.3 流式細(xì)胞儀 將凍于液氮中的結(jié)腸塊用眼科彎剪刀放在60 μm 孔徑的尼龍網(wǎng)上剪碎，PBS 沖洗，收集成單細(xì)胞后用95%乙醇固定，PBS 再次清洗，離心后棄上清液；加入1 mL Tritonx-100，室溫下靜置10 min；離心后棄上清液，加PBS 清洗后棄上清液；加1 mL RNASE 酶，置37 ℃水浴恒溫箱振蕩10 min；離心后棄上清液，加入10 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混勻，避光室溫放置15 min；加入300 μL Binding Buffer，1 h 內(nèi)上機(jī)檢測，應(yīng)用流式細(xì)胞儀離子激發(fā)光波長488 nm，選定每樣本計數(shù)10000 個細(xì)胞，所得資料輸入BDISCONSORT30 計算機(jī)后應(yīng)用相應(yīng)程序軟件處理，計算細(xì)胞凋亡率。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。所有檢驗結(jié)果以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組豚鼠結(jié)腸黏膜肉眼觀改變 肉眼觀察各組結(jié)腸組織樣本，正常組豚鼠結(jié)腸黏膜形態(tài)、顏色正常，MC 模型組結(jié)腸黏膜顏色明顯加深，呈彌漫性黑褐色色素沉著，且由結(jié)腸近端向結(jié)腸遠(yuǎn)端逐漸變淺，而白及組豚鼠結(jié)腸黏膜顏色較模型組淺，見圖1。

圖1 各組豚鼠的結(jié)腸黏膜

3.2 各組褪黑色素染色比較 正常組褪黑色素染色陰性，模型組及白及組特殊染色均呈陽性改變，但模型組染色范圍較白及組大。見圖2。

圖2 各組豚鼠結(jié)腸組織褪黑色素染色光鏡圖（×200）

3.3 各組豚鼠組織透射顯微鏡下比較 正常組：微絨毛排列緊密，形態(tài)規(guī)則，可見較多杯狀細(xì)胞，嵴結(jié)構(gòu)清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見異常。模型組：微絨毛結(jié)構(gòu)紊亂，可見多數(shù)上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)大小不等空泡樣改變，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，變性空泡為腫脹的線粒體，內(nèi)部結(jié)構(gòu)雜亂不清晰，胞漿中細(xì)胞器的密度增加，偶可見凋亡上皮細(xì)胞。白及組：微絨毛排列較緊密，上皮細(xì)胞凋亡不明顯，可見較多杯狀細(xì)胞，個別線粒體輕度空泡樣改變，核膜清晰，染色質(zhì)無聚集，新生黏液空泡輕度增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的整體結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則。見圖3。

圖3 結(jié)腸組織透射電鏡觀察

3.4 各組豚鼠組織細(xì)胞凋亡率比較 結(jié)果顯示，與正常組相比較，模型組豚鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；白及組的細(xì)胞凋亡率較模型組下降（P＜0.05），見表1、圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測各組豚鼠結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡率

表1 各組豚鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率（%，）

表1 各組豚鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率（%，）

注：正常組常規(guī)飲水進(jìn)食60 d；模型組為大黃提取液6 g/（kg·d）60 d；白及組為大黃提取液6 g/（kg·d）第15 d 起10%白及水煎劑灌腸，3次/周；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3 討論

隨著結(jié)腸鏡檢查的普及與提高，MC 的檢出率也呈現(xiàn)增高趨勢。西方國家MC 的檢出率約在10%，國內(nèi)資料報道其檢出率約為1.78%明顯低于西方國家[3]。MC 的發(fā)生與蒽醌類瀉藥的使用有95%的相關(guān)性，由于存在許多腸道病理狀況促使于蒽醌類瀉藥的使用，MC 正變得越來越普遍[7]。

MC 缺乏特異的臨床表現(xiàn)，它可以僅表現(xiàn)為腸鏡下結(jié)腸呈“豹紋樣”或“蟾蜍背樣”的改變，也可出現(xiàn)腹脹、便秘、排便不適或腹部隱痛等，而這些癥狀與腸易激綜合征的臨床表現(xiàn)類似，其機(jī)制可能與色素沉積所致的炎性反應(yīng)以及腸道神經(jīng)系統(tǒng)受累有關(guān)[9]。MC 的組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，大量富含色素的巨噬細(xì)胞沉積在結(jié)腸固有層，其余層均正常，同時可伴見漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。MC 病理組織切片的特征表現(xiàn)為結(jié)腸層存在大片的色素顆粒，固有層胞質(zhì)中可見含色素顆粒的巨噬細(xì)胞，程度較輕的病變組織可無明顯黑變。本研究肉眼可見三組豚鼠結(jié)腸的不同，特殊染色方面，正常豚鼠結(jié)腸黑色素幾乎不可見，褪黑色素染色陰性，而模型組及白及組特殊染色均呈陽性改變，且白及組染色面積較MC 模型組減少，表明結(jié)腸黑變病經(jīng)白及水煎劑干預(yù)后，病變程度有所減輕。

MC 的發(fā)病機(jī)制，目前普遍認(rèn)為與細(xì)胞凋亡存在一定的相關(guān)性。透射電鏡能夠觀察到細(xì)胞在不同凋亡時期的特征性變化，而本研究結(jié)果亦與之相符。流式細(xì)胞儀能夠檢測細(xì)胞凋亡時細(xì)胞、亞細(xì)胞以及分子水平上所發(fā)生的特征性改變，本研究根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)快速定性、定量的分析與分選單個細(xì)胞，檢測豚鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，MC 豚鼠模型結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡率有明顯升高，而經(jīng)白及水煎劑灌腸后細(xì)胞凋亡率降低，表明藥物干預(yù)后MC 有所改善。

MC 屬于良性、可逆性病變，也有研究發(fā)現(xiàn)，MC與結(jié)腸癌存在一定的相關(guān)性，因此對于重度MC 應(yīng)盡早干預(yù)。與西藥相比，中醫(yī)中藥在治療MC 方面發(fā)揮了獨(dú)特的效果和優(yōu)勢。一項數(shù)據(jù)挖掘研究顯示，中藥治療MC，用藥以益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)血潤腸為主，兼以理氣祛瘀為法，必要時標(biāo)本兼顧,靈活權(quán)變加減，可以取得較好的療效[9]。

本研究結(jié)果顯示，白及組結(jié)腸顏色、電鏡下超微結(jié)構(gòu)、結(jié)腸細(xì)胞凋亡率較模型組均有一定程度的減輕，說明白及水煎劑確實對蒽醌類所致MC 有一定的改善作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)，仍需進(jìn)一步研究佐證。