文超婷，張繼賢*，段玉清

1. 揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（揚(yáng)州 225127）；2. 江蘇大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（鎮(zhèn)江 212013）

脫脂大豆粕是大豆提油后剩下的副產(chǎn)物，產(chǎn)量非常大，常用于飼養(yǎng)動(dòng)物或以廢物處理。大豆粕中含有高比例的蛋白質(zhì)和優(yōu)質(zhì)氨基酸[1]。此外，一些研究表明大豆分離蛋白水解物還具有較好的生物活性[2-3]。大部分研究表明酶解法被普遍用于制備生物活性肽，然而，酶解法存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、蛋白轉(zhuǎn)化率低和成本高等缺點(diǎn)[4]。超聲是一種新型、綠色、環(huán)保的方法，它能夠彌補(bǔ)酶解法的不足。大量文獻(xiàn)表明，超聲波處理能夠顯著提高多肽的制備效率和改善生物活性[5-6]。然而，有關(guān)超聲輔助酶解制備西瓜籽多肽的研究卻未見報(bào)道。

因此，試驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面分析，研究超聲時(shí)間、超聲功率、蛋白濃度和酶解溫度對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響，為超聲前處理輔助蛋白酶解工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（山東西亞化工有限公司）；堿性蛋白酶（諾維信生物技術(shù)有限公司）；NaOH、濃鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-5C離心機(jī)（上海安亭有限公司）；DHG-9920A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 超聲預(yù)處理酶解反應(yīng)

將大豆分離蛋白粉配制成一定濃度的溶液，對(duì)蛋白溶液進(jìn)行超聲前處理。根據(jù)Wen等[7]的酶解方法，加入0.1 mol/L NaOH將蛋白溶液調(diào)至pH 9.0，加酶量為蛋白粉質(zhì)量的1%，在50 ℃恒溫水浴中酶解4 h。結(jié)束后加入0.1 mol/L NaOH溶液，調(diào)解至反應(yīng)初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量。

1.3.2 水解度的測(cè)定

酶解過(guò)程中水解度的測(cè)定采用pH-start[8]法，計(jì)算公式見式（1）。

式中：V為酶解過(guò)程中所消耗的NaOH溶液體積，mL；n為NaOH溶液的濃度，mol/L；α為α-NH3平均解離度；m為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 超聲前處理時(shí)間對(duì)蛋白水解度的影響

在超聲功率200 W、底物濃度3.5 g/L、溫度50 ℃條件下，超聲前處理時(shí)間分別為10，20，30，40和50 min，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調(diào)解至反應(yīng)初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對(duì)水解度進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3.2 超聲功率對(duì)蛋白水解度的影響

在底物濃度3.5 g/L、溫度50 ℃和超聲前處理時(shí)間30 min的條件下，超聲前功率分別為100，150，200，250和300 W，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調(diào)解至反應(yīng)初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對(duì)水解度進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3.3 底物濃度對(duì)蛋白水解度的影響

在超聲功率200 W、溫度50 ℃和超聲前處理時(shí)間30 min的條件下，底物濃度分別為2.5，3.0，3.5，4.0和4.5 g/L，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調(diào)解至反應(yīng)初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對(duì)水解度進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3.4 溫度對(duì)蛋白水解度的影響

在超聲功率200 W、底物濃度3.5 g/L和超聲前處理時(shí)間30 min的條件下，溫度分別為30，40，50，60和70 ℃，加入堿性磷酸酶，在50 ℃水浴中酶解4 h，滅酶活力后，加入NaOH溶液，調(diào)解至反應(yīng)初始pH，記錄NaOH溶液的消耗量，并對(duì)水解度進(jìn)行計(jì)算。

1.3.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定各因素的最佳水平范圍，采用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各參數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響規(guī)律，并得到最佳添加量條件。以超聲前處理時(shí)間（A）、超聲功率（B）、底物濃度（C）、溫度（D）為自變量，以水解度為響應(yīng)值，其因素水平編碼見表1，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因子水平及編碼

1.3.5 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行變化顯著性分析。使用Origin 2011軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪制圖表，使用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 超聲前處理時(shí)間對(duì)蛋白水解度的影響

水解度能夠反映蛋白酶解的程度。由圖1可知，隨著超聲前處理時(shí)間的增加，蛋白水解度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，這表明適宜的超聲前處理能夠促進(jìn)大豆分離蛋白的酶解程度。這種現(xiàn)象可能是由于超聲波能夠改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，暴露更多的酶切位點(diǎn)[9]。試驗(yàn)結(jié)果與Uluko等[12]報(bào)道的結(jié)果相一致，超聲前處理能夠顯著提高牛奶蛋白的水解度。然而，當(dāng)時(shí)間超過(guò)30 min后水解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，這主要是由于過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間會(huì)導(dǎo)致蛋白分子發(fā)生再聚集，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行[10]。因此，選擇超聲前處理20，30和40 min用于后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)化。

圖1 不同前處理時(shí)間對(duì)水解度的影響

2.1.2 超聲功率對(duì)蛋白水解度的影響

由圖2可知，隨著超聲功率的增加，蛋白水解度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在功率為200 W時(shí)到達(dá)最大值，這表明超聲在適宜的功率范圍內(nèi)，能夠顯著促進(jìn)蛋白的酶解。隨著超聲功率的增加，水解程度的增加可歸因于超聲空化效應(yīng)的增強(qiáng)，這是由于時(shí)間的推移，會(huì)產(chǎn)生更多的空化活性體積[11]。

圖2 不同功率對(duì)水解度的影響

2.1.3 底物濃度對(duì)蛋白水解度的影響

從圖3中可以看出，隨著底物濃度的增加，蛋白水解度先增加后減少，在底物濃度4 g/L時(shí)達(dá)到最大值。底物濃度超過(guò)4 g/L時(shí)，蛋白水解度有所下降?？紤]到盡可能少地使用原料，實(shí)現(xiàn)更多的酶解，選取3.0，3.5和4.0 g/L用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 不同底物濃度對(duì)水解度的影響

2.1.4 溫度對(duì)蛋白水解度的影響

不同溫度對(duì)大豆分離蛋白水解度的影響如圖4所示。隨著溫度的增加，水解度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，這可能是由于超聲和熱能夠加速蛋白結(jié)構(gòu)的改變，增加蛋白內(nèi)部分子展開的速率，加速酶與底物的反應(yīng)效率[12]。然而，溫度超過(guò)50 ℃后水解度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是由于過(guò)高的溫度會(huì)引起蛋白分子的聚集，阻礙酶解反應(yīng)的進(jìn)行[13]。因此，選擇40，50和60℃用于后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化。

圖4 不同溫度對(duì)水解度的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 模型建立與數(shù)據(jù)分析

基于單因素試驗(yàn)分析，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)方案根據(jù)表2的因素與水平設(shè)計(jì)，所得回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

得到以水解度（Y）為響應(yīng)值的四元二次回歸方程：水解度（Y）=11.02-0.33A-0.16B+1.43C+0.25D+1.70AB-0.82AC+0.54AD+1.07BC-0.95BD-0.035CD-0.36A2-1.34B2+0.36C2-0.47D2。回歸模型方差分析見表3。

由表3可知，所建立的水解度回歸模型P=0.000 1，達(dá)到極顯著水平，得出R2=0.995 3，失擬項(xiàng)（P=0.396 3）不顯著，說(shuō)明回歸模型和預(yù)測(cè)值之間有較好擬合度。模型的一次項(xiàng)A、B、C、D（P＜0.01）影響極顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2（P＜0.01）影響均極顯著；交互項(xiàng)CD（P＞0.05）影響不顯著，AB、AC、AD、BC、BD（P＜0.01）影響極顯著。由此可知，4個(gè)因素對(duì)水解度影響的順序?yàn)镃＞A＞D＞B，即底物濃度＞時(shí)間＞溫度＞功率。

表3 回歸模型及顯著性檢驗(yàn)（水解度）

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

軟件給出的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲時(shí)間20 min、超聲功率188.67 W、底物濃度4.0 g/L和酶解溫度59.55℃，此時(shí)水解度為13.73%。選取超聲時(shí)間20 min、功率190 W、樣品濃度4 g/L、酶解溫度60 ℃進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，水解度為13.61%±0.21%，接近預(yù)測(cè)值13.73%，工藝參數(shù)與軟件給出預(yù)測(cè)值較吻合。因此，可作為最優(yōu)工藝參數(shù)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)，確定超聲前處理時(shí)間、超聲功率、底物濃度、溫度各因素在單一因素變化的情況下的最優(yōu)值。以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，用響應(yīng)面法對(duì)蛋白水解度進(jìn)行優(yōu)化，建立超聲前處理時(shí)間、超聲功率、底物濃度和酶解溫度對(duì)水解度的二次回歸方程模型。經(jīng)驗(yàn)證，該數(shù)學(xué)模型可靠，可用于水解度優(yōu)化參數(shù)的預(yù)測(cè)。結(jié)合單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定水解度最優(yōu)超聲前處理參數(shù)：超聲時(shí)間20 min、超聲功率190 W、蛋白濃度4 g/L和酶解溫度60 ℃。在此最優(yōu)工藝參數(shù)下大豆分離蛋白水解度為13.61%±0.21%。