金慧慧

溫州市龍灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心（溫州 325024）

參照現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35—2016《食品中合成著色劑的測(cè)定》，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在254 nm下檸檬黃、莧菜紅、日落黃、胭脂紅都能得到明顯的響應(yīng)值，唯獨(dú)亮藍(lán)響應(yīng)值低且難以分離[1]。不僅如此，該方法前處理步驟復(fù)雜，而且試驗(yàn)回收率偏低，由于需要通過(guò)漏斗真空抽濾，考慮到漏斗和真空泵數(shù)量，不能同時(shí)大批量檢測(cè)，已不能滿(mǎn)足日常批量的食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)任務(wù)。為此，有很多商家生產(chǎn)出聚酰胺小柱，可以批量高效富集并洗脫分離出合成色素，但其價(jià)格昂貴，聚酰胺粉洗脫時(shí)不能充分?jǐn)嚢?，柱容積也有限，很難一次將樣品溶液全部上樣，分批上樣略顯繁瑣，且底面積小，遇到糖含量高的樣品，比如果凍，提取后樣品溶液里會(huì)出現(xiàn)一些絮狀物質(zhì)，離心后沉淀效果并不明顯，在過(guò)SPE柱時(shí)，容易出現(xiàn)堵塞柱子的現(xiàn)象[2]。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)樣品前處理步驟、樣品溶液凈化及濃縮步驟的改變，提高亮藍(lán)的回收率，同時(shí)通過(guò)自制聚酰胺小柱達(dá)到一次性全部上樣、底面積大不容易堵柱、可重復(fù)利用并且可靈活選擇聚酰胺粉填充量的效果。由于可以批量進(jìn)行處理，所以極大地提高合成色素的檢測(cè)效率，能夠很好地滿(mǎn)足實(shí)際工作的需要[3]，為批量檢測(cè)飲料中亮藍(lán)合成著色劑提供更快速、更經(jīng)濟(jì)、回收率更高的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、設(shè)備與試劑

1.1.1 儀器與設(shè)備

Waters I-class高效液相色譜儀（配PDA二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司）；AL204電子天平（d=0.1 mg，美特勒-托利多）；自制聚酰胺小柱（在30 mL romer免疫親和上樣專(zhuān)用柱內(nèi)嵌合G3砂芯濾板，固定于固相萃取裝置上，相當(dāng)于G3漏斗的作用）；旋渦混合器（德國(guó)IKA公司）；水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備）；GM 0.5A隔膜真空泵（天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備）；0.22 μm針式濾膜（上海安譜公司）。

1.1.2 材料與試劑

亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)，北京海岸鴻蒙，編號(hào)GBW（E）100162，質(zhì)量濃度1.0 mg/mL；乙酸、氨水、乙醇、甲酸、檸檬酸、聚酰胺粉（分析純）；甲醇（色譜純）；水為GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）；波長(zhǎng)629 nm；流量0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液（梯度洗脫，見(jiàn)表1）。

表1 亮藍(lán)測(cè)定的流動(dòng)相梯度

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的配制

吸取1 mL亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)（1.0 mg/mL）于10 mL容量瓶中，用純水稀釋至刻度，即100 mg/L，再吸取此溶液配制成0.1，1.0，10.0，20.0和30.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，相關(guān)系數(shù)為0.999 1。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)第二點(diǎn)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)第二點(diǎn)色譜圖

1.4 樣品處理方法

稱(chēng)取5 g樣品放入25 mL燒杯中，含二氧化碳的樣品加熱去除二氧化碳，含乙醇的樣品加熱去除乙醇，試樣pH偏高時(shí)用檸檬酸水溶液（20%）調(diào)節(jié)至pH 3左右，加入1.0 g聚酰胺粉置于60 ℃恒溫水浴鍋中，不斷攪拌并保溫0.5 h后取出。將燒杯中樣品用10 mL水（pH 3，用20%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)）一次性全部沖洗轉(zhuǎn)移至自制聚酰胺小柱（見(jiàn)圖2），棄去濾液，并用10 mL甲醇-甲酸（6∶4，V/V）、10 mL純化水（pH 6～7）淋洗，通過(guò)真空泵吹干小柱，用20 mL乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V，現(xiàn)用現(xiàn)配）分4次洗脫并接收濾液，收集液于100 ℃水浴鍋蒸干，加乙酸調(diào)節(jié)pH至中性，用純水定容至10 mL，在漩渦混合器上充分混勻后，過(guò)0.22 μm針式濾膜，待測(cè)。

圖2 自制聚酰胺小柱

2 結(jié)果與討論

2.1 聚酰胺粉吸附環(huán)境酸度的選擇

亮藍(lán)屬于人工合成色素，是由苯甲醛鄰磺酸與N-乙基-N-（3-磺基芐基）-苯胺經(jīng)縮合、氧化而制得的，屬于偶氮類(lèi)化合物[4]。鑒于聚酰胺粉吸附原理是在酸性條件下酰胺鍵能以氫鍵形式結(jié)合質(zhì)子，表面帶著大量正電荷，容易吸附偶氮類(lèi)合成色素在水中解離出的帶負(fù)電荷的大陰離子，從而形成穩(wěn)定化合物，根據(jù)GB 5009.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》中“試樣pH偏高時(shí)用檸檬酸水溶液（20%）調(diào)節(jié)pH 6左右攪拌吸附”的操作，試驗(yàn)分別設(shè)計(jì)pH為3，4和6時(shí)，在礦泉水中分別加標(biāo)10 mg/L亮藍(lán)，進(jìn)行加標(biāo)回收率的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH 3時(shí)，亮藍(lán)的加標(biāo)回收率最高。

表2 不同pH下聚酰胺粉吸附能力的比較結(jié)果

2.2 聚酰胺粉用量的選擇

聚酰胺粉用量也是影響吸附效果的關(guān)鍵之一，選擇0.25，0.50，1.00和2.00 g聚酰胺粉分別對(duì)加標(biāo)20 mg/L亮藍(lán)的礦泉水進(jìn)行加標(biāo)回收率的比較，結(jié)果顯示，聚酰胺粉1.00 g時(shí)就能達(dá)到和2.00 g時(shí)差不多的效果，故選用1.00 g聚酰胺粉進(jìn)行吸附洗脫。

表3 不同質(zhì)量聚酰胺粉的吸附能力的比較

2.3 60 ℃水浴恒溫時(shí)長(zhǎng)的選擇

聚酰胺粉吸附還需時(shí)間活化，對(duì)此將水浴時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行不同的設(shè)定，比較各時(shí)長(zhǎng)的加標(biāo)回收率，由此確定，最佳時(shí)長(zhǎng)為30 min。

表4 不同水浴時(shí)長(zhǎng)下聚酰胺粉的吸附能力的比較

2.4 淋洗液pH的選擇

淋洗液pH分別為3，4和6時(shí)，比較亮藍(lán)加標(biāo)10 mg/L時(shí)的回收率。pH 3時(shí)，回收率為95.1%；pH 4時(shí)，回收率為87.0%；pH 6時(shí)，回收率為85.2%。由此確定，最佳pH為3。

2.5 洗脫液的選擇

洗脫液主要有乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）與10%氨化甲醇2種，分別對(duì)2種洗脫液進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，結(jié)果顯示礦泉水中加標(biāo)20 mg/L亮藍(lán)時(shí)，亮藍(lán)乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）回收率為98.7%，10%氨化甲醇回收率達(dá)95.1%，乙醇-氨水-水的效果更好，且更安全。

2.6 方法檢出限及精密度

按照該試驗(yàn)條件，方法的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ）分別以3倍信噪比和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算[5]。結(jié)果顯示，亮藍(lán)0.100 mg/L的rSN為34.76，檢出限為0.009 mg/L，定量限為0.03 mg/kg。對(duì)加標(biāo)10 mg/L的礦泉水進(jìn)行7次精密度測(cè)試，結(jié)果分別為9.91，9.87，9.88，9.91，9.92，9.90和9.92 mg/L，平均值為9.90 mg/L，回收率為99.0%，精密度為0.20%。

3 結(jié)論

通過(guò)線(xiàn)性、檢出限、精密度等方法確認(rèn)，此次試驗(yàn)所介紹的方法符合檢驗(yàn)要求，回收率高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并且可以批量檢測(cè)，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間和資源，可用于飲料中亮藍(lán)合成色素的定量檢測(cè)。