何 涵 冶亞平 陰常欣 周玲玲 昌 媛 李婷婷▲

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院血液科，廣東廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東廣州 510515

結(jié)直腸癌是全球高發(fā)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威 脅人類生命健康[1]，闡明結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制，對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行早期診斷和預(yù)后評(píng)估是結(jié)直腸癌研究的重要內(nèi)容。

腫瘤組織中存在具有自我更新和不斷增殖能力的細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，這些細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cell，TSC）[2]。TSC極強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)和遷徙能力能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]。B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1（B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion site-1，BMI1）基因是多梳基因家族中重要的調(diào)控基因，在維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新及多向分化的過程中起著重要作用[4-6]。BMI1的過表達(dá)可以促進(jìn)腸癌的增殖并誘導(dǎo)癌細(xì)胞出現(xiàn)化療抵抗[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-365a-3p可以靶向結(jié)合BMI1，而miR-365a-3p在結(jié)直腸癌中的作用在國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道，本研究通過檢測(cè)miR-365a-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)，觀察其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力和干細(xì)胞特性的影響，明確其抑制結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑儀器及細(xì)胞株

1.1.1 試劑 血清（美國(guó)Gibco）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本寶生物），PCR試劑盒（日本寶生物）；BMI1質(zhì)粒、miR-365a-3p、抑制劑及其空白對(duì)照均購(gòu)自廣州銳博生物公司；CCK8（東仁公司）。

1.1.2 儀器 CO2孵箱（上海潤(rùn)度）；顯微鏡（德國(guó)萊卡）；離心機(jī)（德國(guó)艾本德）；酶標(biāo)儀（深圳匯松）；紫外分光光度計(jì)（上海箐華）。

1.1.3 細(xì)胞株 HCT15和SW620購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 臨床標(biāo)本收集

收集南方醫(yī)院2018年9月至2019年9月住院患者的結(jié)直腸癌標(biāo)本，本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 提取RNA

按照試劑說明書提取RNA，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度及純度。

1.4 Q-PCR

①按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄提取好的RNA。②用PCR試劑盒檢測(cè)miR-365a-3p和基因的表達(dá)，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃ 6 min、95℃ 15 s、60℃ 32 s、72℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。U6及GAPDH為內(nèi)參，重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.5 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

①利用在線網(wǎng)站TargetScanHuman 7.2預(yù)測(cè)miR-365a-3p的靶基因。②構(gòu)建BMI1野生型及突變型的熒光素酶載體，分別與對(duì)照組（空白）、實(shí)驗(yàn)組（miR-365a-3p）、干擾組（miR-365a-3p抑制劑）共轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞。48 h后，按熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒的說明書檢測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中。12 h后，按照Lipo3000試劑說明書，分別轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及干擾組質(zhì)粒。

1.7 CCK8實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1×103個(gè)/孔接種至96孔板中，每孔加100 μl培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在待測(cè)定孔中加入CCK8，2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及干擾組吸光度值，連續(xù)測(cè)7 d，重復(fù)3次，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.8 干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS洗兩次以去除血清。用5 ml干細(xì)胞培養(yǎng)基（成分：DMEM+B27+FGF+EGF）重懸細(xì)胞，按5×102個(gè)/孔鋪到24孔超低吸附板中，補(bǔ)加干細(xì)胞培養(yǎng)基400 μl。12 d后觀察干細(xì)胞球的狀態(tài)及數(shù)目。成球率=每孔中直徑＞75 μm的細(xì)胞球的個(gè)數(shù)/原始接種細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。CCK8增殖能力比較用Two-way ANOVA；相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織中miR-365a-3p的表達(dá)檢測(cè)

miR-365a-3p在正常組織中的表達(dá)高于癌組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.148，P=0.015），見圖1A。miR-365a-3p在T1～T2期患者中的表達(dá)高于T3～T4期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.676，P=0.027），見圖1B。

圖1 miR-365a-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

2.2 miR-365a-3p與BMI1的結(jié)合情況

生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)出miR-365a-3p與BMI1的3’UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)，見圖2A，實(shí)驗(yàn)組雙熒光素酶的數(shù)值明顯下降，對(duì)照組雙熒光素酶的數(shù)值無明顯變化，實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.112，P=0.013），見圖2B。

圖2 BMI1與miR-365a-3p的結(jié)合情況

2.3 BMI1的表達(dá)情況

Q-PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組BMI1表達(dá)下降（t=6.378、5.784，P=0.004、0.005），干 擾 組BMI1表達(dá)升高（t=8.547、9.651，P=0.003、0.002），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

圖3 BMI1的表達(dá)情況

2.4 CD44、CD133及Lgr5的表達(dá)情況

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CD44、CD133及Lgr5的表達(dá)下降（t=9.232、8.774、6.155，P=0.012、0.010、0.017），見圖4A；而干擾組CD44、CD133及Lgr5的表達(dá)升高（t=5.271、6.157、5.125，P=0.032、0.029、0.033），見圖4B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖4 干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

2.5 結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

CCK8實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力低于對(duì)照組，干擾組細(xì)胞的增殖能力高于對(duì)照組，第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見圖5。

圖5 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

2.6 結(jié)直腸癌干細(xì)胞特性檢測(cè)

干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)表明，實(shí)驗(yàn)組干細(xì)胞成球數(shù)低于對(duì)照組（t=17.341、19.232，P=0.004、0.002），見圖6A，而干擾組干細(xì)胞成球數(shù)高于對(duì)照組（t=8.212、5.473，P=0.017、0.041），見圖6B，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖6 干細(xì)胞成球情況

3 討論

miRNA是一類在真核細(xì)胞中廣泛存在的非編碼小RNA的總稱，其主要通過誘導(dǎo)靶基因降解起到翻譯抑制作用[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，一些miRNA可以通過靶向結(jié)合干細(xì)胞相關(guān)基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，如miR-34a可通過結(jié)合CD44抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖[13]，miR-150可通過抑制肝癌細(xì)胞中C-myc、Bcl-2的表達(dá)而影響肝癌干細(xì)胞的特性[14-15]。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-365a-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)降低，并且其表達(dá)與患者T分期相關(guān)，miR-365a-3p低表達(dá)的患者分期較差；生物信息學(xué)軟件及熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-365a-3p與BMI1的3’UTR區(qū)有結(jié)合位點(diǎn)，miR-365a-3p可抑制干細(xì)胞相關(guān)基因BMI1、CD44、CD133及Lgr5的表達(dá)，使結(jié)直腸癌干細(xì)胞的成球能力下降，并抑制癌細(xì)胞的增殖能力。但腫瘤的發(fā)生發(fā)展是極其錯(cuò)綜復(fù)雜的過程，本研究還需要繼續(xù)驗(yàn)證和探索。

綜上所述，miR-365a-3p是一種抑制結(jié)直腸癌發(fā)生的重要microRNA，其通過調(diào)節(jié)BMI1的表達(dá)，影響結(jié)直腸癌干細(xì)胞特性，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖。本研究將為結(jié)直腸癌的預(yù)防、治療和藥物研制提供新思路和新靶標(biāo)。