郝一鳴，權(quán) 鑫，李勝友，馬 騰，夏 冰，梅良偉，鄭 毅，高 雪，黃景輝，羅卓荊

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科，陜西 西安 710032； 2西北大學(xué)生命科學(xué)院，陜西 西安 710068)

創(chuàng)傷是45歲以下成年人的第一死因。創(chuàng)傷患者最多見、最嚴(yán)重的疾痛是神經(jīng)損傷造成的肢體殘疾。我國(guó)目前周圍神經(jīng)損傷患者有近2 000萬人，是周圍神經(jīng)損傷發(fā)生數(shù)量最多的國(guó)家之一。周圍神經(jīng)雖然具有一定的再生能力，但其再生能力有限，大部分再生神經(jīng)纖維還沒有到達(dá)其支配的靶組織，遠(yuǎn)端靶組織就已萎縮，最終導(dǎo)致功能無法恢復(fù)[1-2]。因此，周圍神經(jīng)損傷后，“如何加快神經(jīng)軸突生長(zhǎng)”是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。電刺激在臨床上已被廣泛用于周圍神經(jīng)損傷的治療。周圍神經(jīng)損傷后，在近端神經(jīng)干給予短時(shí)程電刺激(3 V，20 Hz，20 min)，可縮短神經(jīng)元的休克期，使神經(jīng)再生速度加快20%，顯著提高運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[3-4]。臨床研究同樣證實(shí)了神經(jīng)干電刺激加快周圍神經(jīng)生長(zhǎng)的有效性[5-6]。目前，研究證實(shí)了電刺激加快神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的潛能，但關(guān)于其分子機(jī)制的研究卻一直停滯不前[7]。

非編碼RNA是一類不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，在基因調(diào)控、人類疾病防治及生物進(jìn)化探索等方面都具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性具有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的重要方式，在發(fā)育及再生等過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。前期，我們的體外研究發(fā)現(xiàn)了miR-363-5p通過靶向DCLK1參與了電刺激促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)[7]。那么，miR-363-5p在體內(nèi)神經(jīng)損傷模型中對(duì)神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的作用究竟如何，值得探究。本研究通過制備miR-363-5p 抑制與過表達(dá)的慢病毒表達(dá)載體，并將其顯微注射入背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)內(nèi)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)miR-363-5p表達(dá)，并通過制備坐骨神經(jīng)損傷模型，評(píng)價(jià)miR-363-5p對(duì)神經(jīng)再生的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平(日本Shimadzu公司)；肌電圖記錄儀(丹麥Dantec公司)；透射電子顯微鏡(日本JEM-2000EX)；肌電圖記錄儀(Dantec, Denmark)；顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)；解剖顯微鏡(安徽蕪湖光學(xué)儀器廠)；熒光顯微鏡(日本尼康公司)；冰凍切片機(jī)(日本萊卡公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑：Sprague-Dawley(SD)大鼠(空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)；熒光金(美國(guó)Biotium公司)；冰醋酸溶液、多聚甲醛、蔗糖、四氧化鋨(上海碧云天公司)；Masson染色試劑盒、二甲苯、無水乙醇、戊二醛、甲苯胺藍(lán)(西安天隆科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 人工合成轉(zhuǎn)染模擬物的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 合成miR-363-5p mimic、miR-363-5p mimic對(duì)照、miR-363-5p inhibitor及miR-363-5p inhibitor對(duì)照，將miR-363-5p mimic和miR-363-5p inhibitor分別轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)大鼠脊髓背根節(jié)神經(jīng)元內(nèi)，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率。人工合成轉(zhuǎn)染模擬物上標(biāo)記有cy-3紅色熒光，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后24 h的轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組 成年雄性SD大鼠(200～250 g) 25只，每5只一籠飼養(yǎng)于特定的無病原體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，控制溫度，12 h/12 h光暗循環(huán)。本研究由空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：IACUC-20201023)，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南》(國(guó)家衛(wèi)生研究院出版物第80～123號(hào)，1996年修訂)進(jìn)行。所有動(dòng)物隨機(jī)分為5組：①自體神經(jīng)移植組；②miR-363-5p mimic對(duì)照組(miR-363-5p mimic 對(duì)照+PCL導(dǎo)管)；③miR-363-5p mimic組(miR-363-5p mimic +PCL導(dǎo)管)；④miR-363-5p inhibitor 對(duì)照組(miR-363-5p inhibitor 對(duì)照 +PCL導(dǎo)管)；⑤miR-363-5p inhibitor組 (miR-363-5p inhibitor+PCL導(dǎo)管)。用10 g/L戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉動(dòng)物。將左側(cè)坐骨神經(jīng)暴露在無菌環(huán)境中，并在神經(jīng)中創(chuàng)建一個(gè)5 mm的間隙。自體移植組將5 mm神經(jīng)段倒置180°，鏡下縫合。在其他四組中，神經(jīng)PCL導(dǎo)管用于橋接神經(jīng)缺損，并用3根神經(jīng)周圍10/0尼龍線縫合至神經(jīng)殘端近端和遠(yuǎn)端。同時(shí)，背側(cè)入路一次切開實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚、皮下組織及背側(cè)肌肉，小心進(jìn)入大鼠脊柱旁間隙，將包裝好的miR-363-5p inhibitor和mimic等慢病毒顆粒經(jīng)顯微注射方法注射入同側(cè)的L4～6 DRG內(nèi)，自體神經(jīng)組注射等量的PBS。

1.2.3 坐骨神經(jīng)形態(tài)計(jì)量學(xué)分析 術(shù)后4、8、12周，經(jīng)心臟穿刺左心室胸主動(dòng)脈快速注入生理鹽水和甲醛，然后緩慢灌注200 mL甲醛固定各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)組織，切取自體神經(jīng)移植組或不同注射轉(zhuǎn)染組損傷節(jié)段中段處的神經(jīng)組織。分別制備半薄(厚度：1.0 μm)及超薄切片(厚度：50.0 nm)，行透射電鏡觀察，并觀察記錄、測(cè)算以下指標(biāo)：①再生神經(jīng)面積；②單位面積神經(jīng)組織上有髓神經(jīng)纖維的數(shù)量；③有髓神經(jīng)纖維平均直徑；④再生神經(jīng)髓鞘化程度(軸突直徑與神經(jīng)纖維直徑的比值)。

1.2.4 熒光金逆行示蹤標(biāo)記 術(shù)后4、8、12周進(jìn)行熒光金逆行示蹤標(biāo)記，以評(píng)價(jià)各miRNA片段轉(zhuǎn)染組對(duì)損傷神經(jīng)逆行示蹤神經(jīng)元存活的影響。在熒光顯微鏡下(紫外激發(fā)波長(zhǎng))觀察，統(tǒng)計(jì)脊髓及DRG組織中對(duì)應(yīng)的標(biāo)記陽性的神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.5 痛溫覺功能檢測(cè) 對(duì)大鼠術(shù)前及術(shù)后4、8、12周痛溫覺指標(biāo)進(jìn)行觀察，評(píng)價(jià)miRNA轉(zhuǎn)染組與各實(shí)驗(yàn)對(duì)照組神經(jīng)損傷后大鼠感覺功能的恢復(fù)情況。

后肢皮膚機(jī)械痛覺檢測(cè)von Frey實(shí)驗(yàn)：各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物站立于特制的升起的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，實(shí)施機(jī)械刺激的金屬細(xì)絲刺扎于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左后肢裸露無毛的皮膚，將強(qiáng)度由0.08～10.00 g逐漸增高，觀察針刺后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)次數(shù)。

溫度覺實(shí)驗(yàn)：工作臺(tái)同von Frey實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用RTY-3型熱刺激儀，選擇100 W鹵素投射燈，電壓10 mV，調(diào)節(jié)燈源與玻璃板之間的距離，使投射到足底的光圈直徑為5 mm，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物熱光源照射左后肢，觀察針刺后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的陽性反應(yīng)和陰性反應(yīng)次數(shù)。

1.2.6 坐骨神經(jīng)指數(shù)(sciatic functional index，SFI)計(jì)算 術(shù)后4、8、12周，在大鼠后足底涂敷紅色無毒染料，將白紙平鋪于步行通道底部，讓各轉(zhuǎn)染組大鼠自行步行通過記錄通道，獲得大鼠足跡軌跡印記。計(jì)算其SFI，公式如下：SFI=[-38.3×(EPL-NPL)/NPL]+[109.5×(ETS-NTS)/NTS]+[13.3×(EIT-NIT)/NIT]-8.8。EPL和NPL分別代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組足跟至第三趾尖的距離；ETS和NTS分別代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第一趾至第五趾的距離；EIT及NIT分別代表實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組第二趾至第四趾的距離。

1.2.7 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)靶肌肉萎縮情況(Masson染色) 術(shù)后12周，取各組大鼠術(shù)側(cè)腓腸肌，甲醛固定24 h后，脫水石蠟包埋，制備6 μm石蠟切片，進(jìn)行Masson染色。電子顯微鏡觀察：每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)算肌肉面積與視野面積比值，以此比值代表肌肉萎縮程度。染色結(jié)果：肌肉組織呈暗紅色，纖維結(jié)締組織呈藍(lán)色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。記錄平均質(zhì)量并計(jì)算相對(duì)質(zhì)量，行各實(shí)驗(yàn)組間肌肉質(zhì)量比較，間接反映靶肌肉萎縮情況。

1.2.8 神經(jīng)電生理檢測(cè) 術(shù)后4、8、12周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織取材前，行神經(jīng)電生理學(xué)檢查以評(píng)估大鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)情況。通過刺激電極對(duì)各組神經(jīng)損傷節(jié)段近側(cè) 10 mm處神經(jīng)干進(jìn)行電刺激，測(cè)量刺激電極到記錄電極的距離，以便計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度，并記錄復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential，CMAP)的峰值及潛伏期；根據(jù)上述記錄數(shù)據(jù)計(jì)算出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)傳導(dǎo)速度(nerve conduction velocity，NCV)。

1.2.9 神經(jīng)免疫組織熒光染色 術(shù)后4、8、12周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷節(jié)段坐骨神經(jīng)組織取材，行免疫組織熒光染色，分析神經(jīng)再生與靶蛋白生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 人工合成轉(zhuǎn)染模擬物的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

原代培養(yǎng)神經(jīng)元轉(zhuǎn)染miR-363-5p mimic后轉(zhuǎn)染效率在92%以上(圖1A～D)。轉(zhuǎn)染miRNA模擬物后提取神經(jīng)元RNA并行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-363-5p mimic組DCLK1表達(dá)量較miR-363-5p mimic對(duì)照組顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-363-5p inhibitor組DCLK1表達(dá)量較miR-363-5p inhibitor對(duì)照組顯著增高(圖2)。

A：原代神經(jīng)元光鏡圖片；B：原代神經(jīng)元cy-3表達(dá)；C：原代神經(jīng)元細(xì)胞核DAPI表達(dá)；D：原代神經(jīng)元免疫熒光圖片。 圖1 人工合成轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

A：miR-363-5p mimic對(duì)照組；B：miR-363-5p mimic組；C：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；D：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05， bP<0.01。圖2 RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后DCLK1的表述水平

2.2 神經(jīng)形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

甲苯胺藍(lán)及透射電鏡結(jié)果顯示，術(shù)后12周各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)損傷中段均可觀察到再生神經(jīng)纖維，自體神經(jīng)移植組及miR-363-5p inhibitor組較對(duì)照組排列更為規(guī)則致密(圖3)。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組損傷神經(jīng)中段均可見再生有髓神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)，但結(jié)構(gòu)密度與分布各組存在差異，其中自體神經(jīng)移植組及 miR-363-5p inhibitor組可見大量分布均勻，密度、直徑適中的有髓神經(jīng)纖維，而在miR-363-5p mimic組，再生神經(jīng)纖維密度較低，且直徑不均一，分布零散，髓鞘厚度較miR-363-5p inhibitor組及自體神經(jīng)移植組更低(圖3)。

圖3 術(shù)后12周各實(shí)驗(yàn)組再生神經(jīng)甲苯胺藍(lán)及透射電鏡圖

形態(tài)計(jì)量學(xué)分析結(jié)果顯示，術(shù)后4、8、12周，miR-363-5p mimic組再生神經(jīng)的有髓神經(jīng)纖維數(shù)目、再生軸突總面積、有髓神經(jīng)纖維平均直徑顯著低于miR-363-5p mimic 對(duì)照組及自體神經(jīng)移植組(P<0.05,圖4)。miR-363-5p inhibitor組與自體神經(jīng)移植組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。各組不同時(shí)間點(diǎn)再生神經(jīng)的髓鞘化程度無顯著性差異 (圖4)，表明miR-363-5p對(duì)再生神經(jīng)髓鞘化過程無顯著影響。

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05。圖4 神經(jīng)形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

2.3 熒光金逆行示蹤標(biāo)記

術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)miR-363-5p mimic組感覺神經(jīng)元及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)均顯著低于miR-363-5p mimic對(duì)照組、miR-363-5p inhibitor組及自體神經(jīng)移植組，提示神經(jīng)內(nèi)高表達(dá)miR-363-5p抑制了損傷神經(jīng)再生修復(fù)；術(shù)后12周時(shí)，miR-363-5p inhibitor組與自體神經(jīng)移植組無顯著差異，但神經(jīng)元逆行示蹤陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著高于miR-363-5p inhibitor對(duì)照組(圖5～6)。

圖5 脊髓及DRG內(nèi)熒光金逆行示蹤標(biāo)記

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05。圖6 感覺神經(jīng)元、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計(jì)

2.4 行為學(xué)檢測(cè)痛溫覺及坐骨神經(jīng)指數(shù)

術(shù)后4周痛覺檢測(cè)(von Frey實(shí)驗(yàn))和溫度覺檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-363-5p mimic組的痛覺感受閾值及熱敏感反應(yīng)時(shí)間顯著高于miR-363-5p mimic 對(duì)照組及自體神經(jīng)移植組，表明神經(jīng)元內(nèi)上調(diào)miR-363-5p不利于神經(jīng)損傷后痛溫覺功能的恢復(fù)(圖7)。miR-363-5p inhibitor組的痛覺感受閾值及熱敏感反應(yīng)時(shí)間與自體神經(jīng)移植組無顯著性差異，但顯著低于miR-363-5p inhibitor 對(duì)照組，表明神經(jīng)元內(nèi)下調(diào)miR-363-5p可促進(jìn)神經(jīng)損傷后痛溫覺功能恢復(fù)(圖7)。

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05， bP<0.01。圖7 痛溫覺檢測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物步態(tài)足印采集狀況良好。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，術(shù)后4、8、12周各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物SFI值均有逐漸回升趨勢(shì)，說明各組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能均存在不同程度恢復(fù)。術(shù)后4、8、12周miR-363-5p mimic組的SFI值顯著低于miR-363-5p mimic 對(duì)照組及自體神經(jīng)移植組，表明神經(jīng)元內(nèi)上調(diào)miR-363-5p不利于神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)(圖8)。術(shù)后12周miR-363-5p inhibitor組的SFI值與自體神經(jīng)移植組無顯著性差異，但顯著低于miR-363-5p inhibitor 對(duì)照組，表明神經(jīng)元內(nèi)下調(diào)miR-363-5p可促進(jìn)神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)(圖8)。

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05。圖8 坐骨神經(jīng)指數(shù)

2.5 靶肌肉萎縮情況的組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

術(shù)后12周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腓腸肌取材稱質(zhì)量并進(jìn)行大體形態(tài)觀察及肌肉Masson染色，miR-363-5p mimic組肌肉失神經(jīng)萎縮情況更重(圖9)，平均肌纖維橫截面積比值及肌肉相對(duì)質(zhì)量顯著低于miR-363-5p mimic 對(duì)照組及自體神經(jīng)移植組(圖10)。miR-363-5p inhibitor組的平均肌纖維橫截面積比值與miR-363-5p inhibitor 對(duì)照組及自體神經(jīng)移植組無顯著性差異，但miR-363-5p inhibitor組的肌肉相對(duì)質(zhì)量顯著高于miR-363-5p inhibitor 對(duì)照組(圖10)。

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。Masson染色 ×10。圖9 靶肌肉萎縮情況的組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05， bP<0.01。圖10 靶肌肉組織質(zhì)量對(duì)比

2.6 神經(jīng)傳導(dǎo)功能的電生理檢測(cè)

各miRNA轉(zhuǎn)染組神經(jīng)分別于術(shù)后4、8、12周行神經(jīng)電生理檢測(cè)，評(píng)估神經(jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)傳導(dǎo)功能的恢復(fù)情況。結(jié)果顯示，術(shù)后8、12周，miR-363-5p mimic 對(duì)照組NCV和CMAP峰值顯著高于miR-363-5p mimic組(P<0.05,圖11)，術(shù)后4、8、12周，自體神經(jīng)移植組NCV、CMAP潛伏期及CMAP峰值均高于miR-363-5p mimic組(圖11)。但術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)miR-363-5p inhibitor組NCV和CMAP峰值并未顯著高于miR-363-5p inhibitor對(duì)照組及自體神經(jīng)移植組，這可能與顯微注射操作在一定程度上造成了部分神經(jīng)元損傷有關(guān)，從而影響其促神經(jīng)功能恢復(fù)作用。以上結(jié)果表明，體內(nèi)注射轉(zhuǎn)染miR-363-5p mimic增加miR-363-5p表達(dá)可阻礙抑制神經(jīng)損傷后的神經(jīng)傳導(dǎo)功能恢復(fù)。

A：自體神經(jīng)移植組；B：miR-363-5p mimic對(duì)照組；C：miR-363-5p mimic組；D：miR-363-5p inhibitor對(duì)照組；E：miR-363-5p inhibitor組。 aP<0.05。圖11 神經(jīng)電生理檢測(cè)

3 討論

周圍神經(jīng)損傷，尤其是嚴(yán)重的周圍神經(jīng)損傷，往往帶來功能缺失與部分殘疾。多年來，雖然顯微手術(shù)修復(fù)技術(shù)得到了一定的發(fā)展，但僅僅依靠手術(shù)修復(fù)獲得功能恢復(fù)滿意的患者占不到10%的比例[10-12]。周圍神經(jīng)損傷后，受損的感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞啟動(dòng)再生相關(guān)基因，這些被激活的基因均有其上游的啟動(dòng)機(jī)制，包括轉(zhuǎn)錄因子激活、相關(guān)miRNA分子的差異表達(dá)等[9]。我們的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-363-5p在體外培養(yǎng)DRG神經(jīng)元細(xì)胞中發(fā)揮了一定的調(diào)控軸突再生的功能[7]，而這種功能是否在體內(nèi)環(huán)境中也同樣發(fā)揮作用尚不清楚。因此，我們開展了miR-363-5p對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。

將目標(biāo)miRNA分子成功導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型體內(nèi)，同時(shí)不帶來任何明顯副作用，是研究面臨的首要問題。慢病毒載體作為現(xiàn)階段基因轉(zhuǎn)染治療的主要轉(zhuǎn)染載體，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。既往有研究者利用慢病毒載體在大鼠外周神經(jīng)損傷模型及神經(jīng)橫斷后手術(shù)修復(fù)模型中成功進(jìn)行了目的基因的轉(zhuǎn)染，并觀察到目的基因促進(jìn)神經(jīng)軸突再生情況[13-14]。另有研究者利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)高表達(dá)于脊髓腹側(cè)靠近運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元處，促進(jìn)了該部分神經(jīng)元存活并引起腹側(cè)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的卷曲[15-16]。同樣應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染在神經(jīng)離斷傷模型中也有許多的研究[17-19]。在神經(jīng)離斷后，損傷遠(yuǎn)端1 cm處神經(jīng)逆行示蹤顯示，應(yīng)用慢病毒載體注射轉(zhuǎn)染上調(diào)GDNF使得長(zhǎng)距離軸突再生受到抑制[20]。利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染高表達(dá)GDNF修飾的雪旺細(xì)胞，并將其充填于非細(xì)胞神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)修復(fù)周圍神經(jīng)缺損。研究表明，GDNF高表達(dá)可抑制阻礙再生軸突生長(zhǎng)延長(zhǎng)[21]。本研究利用慢病毒表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-363-5p inhibitor、miR-363-5p mimic以及相應(yīng)的陰性對(duì)照片段，實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)元內(nèi)miR-363-5p的上調(diào)和下調(diào)。

損傷神經(jīng)的再生延長(zhǎng)依賴于損傷神經(jīng)元自發(fā)的軸突再生能力，因此，尋找一種促進(jìn)損傷軸突再生的方法對(duì)促進(jìn)神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)尤為重要。我們成功合成構(gòu)建了慢病毒載體表達(dá)的miR-363-5p抑制物或模擬物及其對(duì)應(yīng)陰性對(duì)照片段，并通過體內(nèi)、體外驗(yàn)證合成轉(zhuǎn)染效率。通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)評(píng)估術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)損傷大鼠的局部神經(jīng)再生情況、神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)、靶肌肉失神經(jīng)支配萎縮情況、感覺運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況等。結(jié)果顯示，雖然單純上調(diào)或下調(diào)miR-363-5p并未引起明顯神經(jīng)再生變化，但與自體神經(jīng)移植組相比，坐骨神經(jīng)局部miR-363-5p表達(dá)升高引起的神經(jīng)再生及功能恢復(fù)抑制效應(yīng)是有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，而隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，這種差異逐漸縮小，這可能與神經(jīng)損傷再生的關(guān)鍵時(shí)期集中在損傷早期有關(guān)。轉(zhuǎn)染注射miR-363-5p inhibitor組人為降低miR-363-5p表達(dá)可較miR-363-5p mimic組有明顯的促進(jìn)神經(jīng)再生與功能恢復(fù)能力，提示miR-363-5p在周圍神經(jīng)再生中的重要作用，但較miR-363-5p inhibitor 對(duì)照組并無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與DRG局部注射對(duì)外周神經(jīng)局部組織的輕微損傷破壞有關(guān)，從而影響神經(jīng)本身的恢復(fù)，而這樣會(huì)無形中縮小單純miR-363-5p的局部抑制所帶來的促神經(jīng)再生恢復(fù)的優(yōu)勢(shì)。

然而，需要注意的是，神經(jīng)損傷再生的機(jī)制復(fù)雜[22-24]，相關(guān)分子參與激活的種類很多[18,25]，單純miRNA表達(dá)調(diào)控引起的促神經(jīng)效應(yīng)并不能替代其他機(jī)制通路，這也是為何單純體內(nèi)調(diào)控miR-363-5p表達(dá)并未引起完全的神經(jīng)再生恢復(fù)的原因。

綜上所述，本研究在大鼠坐骨神經(jīng)損傷體內(nèi)環(huán)境下，在慢病毒體內(nèi)成功轉(zhuǎn)染miR-363-5p模擬物或抑制物，在局部上調(diào)或下調(diào)miR-363-5p表達(dá)試圖影響損傷軸突的再生延長(zhǎng)及神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)。本研究將慢病毒體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染與特異性miR-363-5p調(diào)控作用相結(jié)合，體內(nèi)驗(yàn)證了電刺激促進(jìn)軸突生長(zhǎng)延長(zhǎng)的特異miRNA分子的作用機(jī)制，首次在體內(nèi)環(huán)境下明確了電刺激促神經(jīng)再生特異性miRNA分子功能，為進(jìn)一步研究電刺激促進(jìn)神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的分子調(diào)控機(jī)制提供了新線索，具有一定理論意義。