劉鑫成，孟星星，張 昭，張煜珅，孫立國,3，黨競醫(yī)，朱東澤，范宏斌

(空軍軍醫(yī)大學： 1西京醫(yī)院骨科， 2航空航天醫(yī)學系航空航天衛(wèi)生學教研室，陜西 西安 710032； 3陜西省中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)療處，陜西 西安 710003)

軟骨損傷多見于外傷和骨關節(jié)炎等疾病，是一種臨床上的常見疾患。由于軟骨再生能力較弱，損傷后往往難以自我修復[1]，最終會進展為骨關節(jié)炎，極大地降低患者的生活質量[2-3]。臨床上多使用非甾體抗炎藥等對癥治療，但治療效果有限[4]。由于疾病不斷進展，患者最終需進行關節(jié)置換[5-6]。組織工程技術的發(fā)展給軟骨損傷修復帶來曙光，但目前此技術的實施需要在體外大量擴增患者的自體軟骨細胞，且原代軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)多次傳代后常發(fā)生去分化現(xiàn)象[7-8]，軟骨細胞去分化后，其標志物Col2a1[9]和Sox 9[10]表達降低，且在移植后因軟骨細胞外基質(extracellular matrix，ECM)相關成分的減少會直接影響細胞信號和黏附分子的傳導等重要的細胞功能[11-14]，糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)是ECM的主要成分，其降低會影響軟骨組織的負重能力[15-16]，最終會導致軟骨細胞失去形成正常軟骨組織的能力[17-18]。 而3D多層培養(yǎng)可以促進去分化的軟骨細胞再分化[19]，再分化的軟骨細胞可提升其在軟骨組織工程中的適用性[20-23]。

靜電紡絲技術可以高效連續(xù)地制備微米級甚至納米級纖維，是一種常用的細胞支架制作方法。該技術制作的支架材料具有較高的孔隙率、較大的表面積等特點，有利于細胞在支架材料上的黏附和增殖。此優(yōu)點使電紡材料成為軟骨細胞3D培養(yǎng)常用的細胞支架材料之一。

殼聚糖是甲殼素通過N-脫乙?；幚砗蟮玫降囊环N天然堿性高分子多糖，具有良好的生物相容性、低免疫原性和生物可降解性，且降解產物安全無毒[24]，目前已被應用在水凝膠材料上[25-27]，而且可以和蠶絲[28]、電紡材料[29]等相互融合復合使用。研究證明軟骨細胞可在殼聚糖處理的細胞支架上黏附和增殖，使ColⅡ和GAG的表達增多，促進軟骨細胞表型的維持和間充質干細胞向成軟骨細胞方向分化[30-31]。究其原因，一方面，殼聚糖的性質與GAG相近，可以很好地促進軟骨修復；另一方面，它有穩(wěn)定的聚合電解質的性質，因而可以聚合很多ECM中的陰離子成分，如膠原和硫酸軟骨素[32]。本研究使用殼聚糖對聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]材料做表面處理也是基于此性質。

既往研究采用靜電紡絲技術進行軟骨組織工程相關研究時，多使用膠原[33-34]、水凝膠[35]、生長因子[36]或其他成分[34]與紡絲材料進行復合處理，且多需要經過復雜的復合處理。本研究通過使用殼聚糖對PLGA電紡材料進行表面處理，進而觀察這種處理對軟骨細胞去分化的抑制作用。此種表面處理方法相對簡單易行，為軟骨細胞的3D培養(yǎng)提供新的方法選擇，為后續(xù)軟骨組織工程的發(fā)展提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley(SD)大鼠取自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心；高糖DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；2.5 g/L胰酶(Solarbio公司)；雙抗(青霉素+鏈霉素，Solarbio公司)；ColⅡ酶(MP公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Trizol裂解液(Life公司)；逆轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix(Takara公司)；微孔板檢測系統(tǒng)(Biotek公司)；細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；實時熒光定量PCR儀Lightcycler 96(Roche公司)；PLGA(深圳博立公司)；六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol, HFIP)(阿拉丁公司)；殼聚糖(Sigma公司)；戊二醛(天津天力公司)；Alamar blue(上海翎圣公司)；靜電紡絲機(北京永康樂業(yè)公司)；冷凍干燥機(Christ Alpha公司)；掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)(日立公司)。

1.2 方法

1.2.1 配制PLGA的HFIP溶液 于-20 ℃冰箱中取出PLGA固體粉末，室溫復溫，稱取PLGA 8.754 5 g，移入50 mL離心管；通風櫥操作：吸取40 mL HFIP，移入放有PLGA的50 mL離心管，將蓋子擰緊，封口膠密封，鋁箔紙遮蓋管身避光，將離心管放在搖床上，1 d后通?？赏耆芙?，得到120 g/L PLGA的HFIP溶液。

1.2.2 靜電紡絲實驗 取10 mL的注射器2支，拔出活塞，將適量PLGA溶液倒入注射器中，復裝活塞。在靜電紡絲機內的電極板上用4塊小磁鐵固定一張鋁箔紙，打開靜電紡絲機開關，設置參數，其中正極電壓為12.21 V，負極電壓為-1.07 V，注射器加壓速度為0.19 mm/min。將預先用氯仿浸泡過夜的20號針頭晾干后安裝在注射器上，隨后立刻把注射器安裝于靜電紡絲機上，打開正負高壓電開關，開始電紡實驗，注意防止PLGA溶液凝固堵住針頭。當針頭噴出紡絲后，用試管夾夾一塊載玻片粘取少量紡絲，在光學顯微鏡下觀察紡絲是否光滑、有無黏結并粗略估計紡絲粗細。注意通風，每隔10 min觀察一次靜電紡絲機工作情況，每30 min用放電棒將極板上的靜電釋放一次。當一支注射器的PLGA溶液耗盡時，更換另一支注射器，直到PLGA溶液用盡。關閉靜電紡絲機電源，取下黏附PLGA材料的鋁箔紙，并將其在通風處晾置 3 d，使HFIP盡可能揮發(fā)。

1.2.3 PLGA材料的表面處理 將晾置的PLGA材料和鋁箔紙分離，剪去圓形PLGA材料外周較薄處，保留中心較厚的材料；將其剪成直徑約0.75 cm的小圓片和少量邊長約3 mm的正方形，小圓片放入24孔板內，小正方形放入96孔板內；用PBS清洗PLGA材料2～3次，每次3 min；將洗好的PLGA小圓片和小正方形各取出半數做殼聚糖表面處理：少量PLGA材料放入一支50 mL注射器中，吸入2 g/L 殼聚糖溶液(溶劑為10 g/L 乙酸溶液)，使材料全部浸入液體中，用封口膠密封注射器乳頭，對活塞加壓處理1 min后取出材料，放回24孔板；凍干處理8 h；用PBS清洗2～3次，每次3 min；晾干后環(huán)氧乙烷滅菌。

1.2.4 原代軟骨細胞的分離和培養(yǎng) 處死2周齡SD大鼠，取膝關節(jié)透明軟骨，將其切碎后置于2 g/L的ColⅡ酶溶液(溶于高糖DMEM培養(yǎng)基)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內消化12 h后，離心(1 000 r/min，5 min)棄上清，加入高糖DMEM培養(yǎng)液(含100 mL/L胎牛血清+10 mL/L雙抗)，用膠頭滴管反復吹打重懸細胞，混勻后將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶移入37 ℃ 50 mL/L CO2恒溫培養(yǎng)箱內，隔天換液。當貼壁的軟骨細胞數量大于或等于80%鏡下視野時，用胰酶將貼壁細胞消化后傳代。

1.2.5 PLGA材料上軟骨細胞的培養(yǎng) 將傳代至P2離心完成的軟骨細胞用含100 mL/L FBS的培養(yǎng)液重懸細胞，使細胞密度為(4～5)×108/L，在每塊PLGA小圓片上加一滴混合液，放入37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內10 min，再次取出，復加0.5 mL培養(yǎng)液，37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液。邊長3 mm的PLGA材料和PLGA+Chi材料取出放在96孔板里，每組4個復孔，吸取10 μL含細胞培養(yǎng)液加在材料中央，放入37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內10 min，再次取出，復加100 μL培養(yǎng)液。37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，1 d后吸去培養(yǎng)液，取出材料移入新的96孔板，加入200 μL培養(yǎng)液，37 ℃ 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液，用于Alamar blue實驗。

1.2.6 Alamar blue實驗 96孔板培養(yǎng)的PLGA組和PLGA+Chi組軟骨細胞分別在第3、6、9、12日做Alamar blue細胞增殖活力檢測實驗，用于觀察兩組軟骨細胞的增殖情況。按Alamar blue試劑的說明書進行操作。具體步驟：①吸去培養(yǎng)液，用PBS洗材料3次，加入培養(yǎng)液100 μL，另外在空白孔也加入等量培養(yǎng)液；②在含培養(yǎng)液的孔內加入10 μL Alamar blue，于37 ℃ 50 mL/L CO2中孵育3 h；③從每個實驗孔中吸出100 μL液體，移入另一個無菌的96孔板，用微孔板檢測儀檢測A570 nm值和A630 nm值；④用PBS洗材料3次，重新加入200 μL培養(yǎng)液，于37 ℃ 50 mL/L CO2中常規(guī)培養(yǎng)；⑤根據說明書公式計算Alamar blue的還原率,還原率=[(34 798×A570 nm)-(80 586×A630 nm)]/[(155 677×C630 nm)-(5 494×C570 nm)] ×100%。A570 nm、A630 nm為檢測孔檢測值；C570 nm、C630 nm為陰性對照孔檢測值(培養(yǎng)基，Alamar blue，無細胞)。

1.2.7 SEM觀察 將未處理的PLGA材料、殼聚糖處理的PLGA材料、接種細胞的PLGA組和PLGA+Chi組(培養(yǎng)14 d)共4種材料，25 mL/L戊二醛固定過夜，噴金處理，SEM觀察材料表面形貌狀況。

1.2.8 實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 接種細胞的2組材料每組分別取4塊，PBS沖洗3遍，每組細胞樣品做3個復孔。采用Trizol法提取軟骨細胞RNA，取 1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，再取1 μL cDNA進行實時定量PCR，檢測軟骨細胞表型相關基因ColⅡ和Sox9在mRNA水平的表達情況。本實驗中內參選取三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)，數據分析采用 2-△△Ct 法。引物序列見表1。

2 結果

2.1 材料大體形貌觀察

未經處理的PLGA材料表面平整，使用殼聚糖表面處理的PLGA材料在凍干后，材料表面殘留的殼聚糖溶液流至孔板底部，隨著冷凍干燥變成晶體針狀。

2.2 Alamar blue細胞增殖活力實驗結果

兩組材料上的軟骨細胞在培養(yǎng)期間持續(xù)增殖，兩組細胞的增殖速度在同一時間點無顯著性差異(圖1)，說明材料表面處理與否對細胞增殖能力沒有影響。

PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；Chi：殼聚糖。圖1 兩組電紡材料不同時間點Alamar blue細胞增殖實驗結果

2.3 SEM觀察

利用SEM放大材料表面后，觀察PLGA電紡材料處理前后表面的變化，以及細胞接種到材料以后的生長情況(圖2)。與圖2A～B相比，圖2C～D紡絲表面附上了一層亮白色的涂層，表面光滑，說明殼聚糖復合成功；圖2E～F中，PLGA組的軟骨細胞排列較為疏松，存在部分未覆蓋細胞的區(qū)域；圖2G～H中PLGA+Chi組軟骨細胞已經開始生長成膜，較難看出單個完整的軟骨細胞，但仍可觀察到細胞下面的材料形態(tài)，這說明細胞成膜覆蓋材料并不完全，且軟骨細胞數量稍多，細胞之間聯(lián)系較緊密。

A：PLGA組(×1 000，50 μm)；B：PLGA組(×3 000，10 μm)；C：PLGA+Chi組(×1 000，50 μm)。D：PLGA+Chi組(×3 000，10 μm)； E：PLGA組材料負載軟骨細胞14 d后(×500，100 μm)；F：PLGA組材料負載軟骨細胞14 d后(×1 500，30 μm)；G：PLGA+Chi組材料負載軟骨細胞14 d后(×500，100 μm)；H：PLGA+Chi組材料負載軟骨細胞14 d后(×1 500，30 μm)。PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；Chi：殼聚糖。圖2 SEM觀察PLGA和PLGA+Chi組材料及軟骨細胞的生長情況

2.4 qRT-PCR檢測軟骨細胞相關基因表達結果

qRT-PCR檢測軟骨細胞相關基因表達，結果顯示，與PLGA組相比，PLGA+Chi組ColⅡ和Sox 9的表達顯著增高(P<0.01，圖3)，PLGA+Chi材料對軟骨細胞去分化有更好的抑制作用。

PLGA：聚乳酸-羥基乙酸共聚物；Chi：殼聚糖。圖3 兩組電紡材料軟骨細胞qRT-PCR檢測結果

3 討論

軟骨組織工程常用的靜電紡絲多聚合物材料有聚乳酸[37]、PLGA[38]、聚ε-己內酯[39]、左旋聚乳酸[40]、聚環(huán)氧乙烷[41]、聚乙二醇[42]、聚醚酰亞胺[43]等。目前電紡實驗的發(fā)展已不再是使用單一材料，而是將不同的材料相互組合[29,44-46]或將電紡材料做表面涂層處理，例如ColⅠ[47]和羥基磷灰石[48]或本實驗中的殼聚糖，亦或是將電紡材料與其他支架復合處理，例如明膠[49]和蠶絲蛋白[50]等復合，再或將材料與細胞因子(如TGF-β[51]等)做復合處理。

殼聚糖是一種堿性高分子多聚糖，具有良好的生物相容性、低免疫原性和生物可降解性[24]。研究證明軟骨細胞可在殼聚糖細胞支架上黏附增殖，使ColⅡ和GAG的表達增多，促進軟骨細胞表型的維持[30]。究其原因，一方面，殼聚糖的性質與GAG相近，可以很好地促進軟骨修復；另一方面，它有穩(wěn)定的聚合電解質的性質，因而可以聚合很多ECM中的陰離子成分，如膠原和硫酸軟骨素[32]。殼聚糖已被應用在水凝膠材料上[25-27]，而且可以和蠶絲[28]和電紡材料[29]等相互融合復合使用。本研究使用殼聚糖對PLGA材料做表面處理也是基于這一性質。

原代軟骨細胞在體外單層培養(yǎng)多次傳代后，軟骨細胞形態(tài)會從多角形逐漸變?yōu)槌衫w維細胞的長梭形[52]，關節(jié)軟骨ECM的關鍵成分如ColⅡ、GAG、蛋白聚糖等表達降低，軟骨細胞纖維化的標志物ColⅠ表達上升[53]，常發(fā)生去分化現(xiàn)象而不能形成正常軟骨組織[7-8]。

本研究使用殼聚糖表面處理的PLGA材料，在含有一定空隙且不完全平坦的電紡材料進行3D培養(yǎng)軟骨細胞的基礎上，增加了殼聚糖表面涂層，殼聚糖幾乎不溶于水，培養(yǎng)過程中殼聚糖涂層不會因為在水中溶解而減少，因此可持續(xù)發(fā)揮作用。通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對PLGA材料的表面處理是成功的，纖維表面變得更加光滑；Alamar blue實驗顯示殼聚糖表面處理對于軟骨細胞的增殖情況沒有影響；qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PLGA+Chi組的軟骨細胞表型相關標志基因表達相對于PLGA組得到了提升，顯示殼聚糖表面處理對軟骨細胞去分化有抑制作用。

本實驗使用殼聚糖表面處理的PLGA材料，因支架較厚較硬，無法進行切片去了解材料內部殼聚糖處理是否完全，后續(xù)將繼續(xù)探索能同時溶解殼聚糖和PLGA的有機溶劑，使殼聚糖和PLGA于有機溶劑中完全混合均勻，再進行電紡實驗制備材料。此方法得到的材料——殼聚糖分布將更加均勻，與本實驗得到的材料相比，在抑制軟骨細胞去分化的效果方面可能存在差別。另外，本研究仍需動物體內實驗進一步證實。