胡建華，張兆昆，李永麗，蘭輝，劉占英

(1.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，呼和浩特 010051；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)發(fā)酵產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排工程技術(shù)研究中心，呼和浩特 010051)

核黃素又稱維生素B2是一種水溶性維生素，不能直接參與細(xì)胞代謝，但其衍生物能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的多種生理活動(dòng)，因此具有重要的生理功能，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[1-2]，此外還可作為色素、營(yíng)養(yǎng)添加劑等在食品行業(yè)被普遍應(yīng)用。此外由于人體自身不能合成核黃素，需要從外界攝取，所以核黃素的生產(chǎn)具有重要的社會(huì)意義。最早的生產(chǎn)方法為化學(xué)合成法，后來(lái)發(fā)展為化學(xué)半合成法，當(dāng)今的生產(chǎn)方法采用微生物發(fā)酵法，常用的工程菌種為棉囊阿舒氏酵母和枯草芽孢桿菌[3]。棉囊阿舒氏酵母能夠天然積累核黃素，枯黃芽孢桿菌則具有生長(zhǎng)期短產(chǎn)能高的優(yōu)點(diǎn)，湖北廣濟(jì)藥業(yè)利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素其產(chǎn)量可達(dá)26.5 g/L[4]，文獻(xiàn)報(bào)道的菌株也多以枯草芽孢桿菌為主[5]，高產(chǎn)菌株的選育及改造仍是研究的熱點(diǎn)之一。

重離子束是通過(guò)剝離或部分剝離原子序數(shù)>2的原子核外圍電子形成具有能量的帶電離子束，照射生物細(xì)胞進(jìn)行誘變，是一種有別于其他輻射源的誘變育種方式，具有突變率高、突變譜廣、誘變效果好、不易回復(fù)突變等特點(diǎn)[6-7]。目前世界上僅有幾個(gè)國(guó)家有重離子加速器裝置，我國(guó)的設(shè)備在中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，重離子輻照誘變技術(shù)在植物及微生物育種中有廣泛應(yīng)用且有較好的發(fā)展前景[8]。楊陽(yáng)等[9]利用12C6+離子束輻照誘變丙酮丁醇梭菌CICC 8012，篩選獲得高產(chǎn)且高抗丁醇脅迫的丙酮丁醇梭菌突變株，產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高33%。本課題組篩選得到復(fù)合酶活力最高的菌株B.subtilisKC-1，其濾紙酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶、蛋白酶及α-淀粉酶等活力均有較高增加[10]，崔金娜[11]采用二次重離子誘變B.subtilisKC-1，其α-淀粉酶活力提高42.34%。本文通過(guò)重離子誘變選育高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌，為進(jìn)一步探討重離子的誘變機(jī)理及調(diào)控高產(chǎn)核黃素的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌B.subtilisC0，本實(shí)驗(yàn)室保存。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取粉5.0，氯化鈉10.0，pH自然，固體培養(yǎng)基加1.8%瓊脂。

Spizizen基本培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8.0，(NH4)2SO40.2，KH2PO41.31，Na2HPO40.6，MgSO4·7H2O 0.2，檸檬酸三鈉二水 0.25，谷氨酰胺 2.0，色氨酸 0.05，VB1溶液0.01，1 000×微量元素溶液 1 mL；1% VB1溶液：0.1 g維生素B1溶解于10 mL去離子水中，無(wú)菌無(wú)機(jī)濾膜過(guò)濾除菌[12]。

酵母粉培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉20.0，Na2HPO46.8，KH2PO43.0，MgSO40.5去離子水溶解混勻調(diào)至所需pH滅菌；配制500 g/L D-葡萄糖糖溶液，115 ℃滅菌30 min；配制200 g/L尿素溶液，過(guò)濾除菌；培養(yǎng)基使用前添加尿素最終濃度為6 g/L和D-葡萄糖最終濃度為60 g/L及補(bǔ)充適量無(wú)菌水至體積為1 L。

發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉1.0，酵母粉9.0，Na2HPO40.5，KH2PO40.5,MgSO40.5，調(diào)至所需pH值滅菌，使用前加入尿素(終濃度為2 g/L)和D-葡萄糖(終濃度為10 g/L)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉2.0，酵母粉18.0，Na2HPO46.8，KH2PO43.0，MgSO40.5，調(diào)至所需pH值，培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中121 ℃滅菌30 min，使用前加入尿素(終濃度為6 g/L)和D-葡萄糖(終濃度為60 g/L)[13]。

上述pH值為6.2～8.2，滅菌條件沒(méi)有特殊說(shuō)明均為121 ℃ 20 min。所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 誘變處理

在中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所蘭州重離子加速器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成重離子誘變處理。在輻照皿內(nèi)放入2 mL對(duì)數(shù)期的枯草芽孢桿菌液，用能量為80 MeV/u的12C6+離子束以140、180及220 Gy的輻照劑量進(jìn)行處理，束流速度為30 Gy/min。

對(duì)第一次重離子誘變選育出的高產(chǎn)核黃素的菌株進(jìn)行第二次重離子誘變，選擇180 Gy及220 Gy的輻照劑量，束流速度為30 Gy/min。

1.2.2 核黃素高產(chǎn)菌株的選育及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

(1)致死率計(jì)算。將原始菌株培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋后取100 μL涂布于LB平板培養(yǎng)基上，對(duì)菌落個(gè)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)后選擇10-5為最佳稀釋濃度。不同輻照劑量后的菌懸液稀釋至10-5，取100 μL涂布到LB平板培養(yǎng)基上(每個(gè)樣品3個(gè)平行樣)，37 ℃培養(yǎng)48 h，致死率計(jì)算公式如下：

(2)選擇性培養(yǎng)基平板初篩。將原始菌株的菌懸液經(jīng)適度稀釋，取100 μL涂布在含有 20、25、30、35、40、45和50 mg/L 8-氮鳥嘌呤(8-NA)的Spizizen基本鹽培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)48～72 h，以不含篩選拮抗物平板上菌體的生長(zhǎng)狀況為對(duì)照并記錄菌體個(gè)數(shù)，觀察并記錄未長(zhǎng)出菌落的篩選拮抗物的最低濃度，即為該篩選拮抗物的 MIC[12]。將重離子誘變后的菌液稀釋至10-3，取稀釋液涂布在抗性平板上，37 ℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落為止，根據(jù)菌落周圍的黃色痕跡的大小深淺，劃線分離后保存單菌落到斜面培養(yǎng)基上得初篩菌種。

(3)搖瓶復(fù)篩。取一環(huán)初篩菌株及原始菌株接于8 mL pH 7.2酵母粉培養(yǎng)基的試管中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)72 h后檢測(cè)核黃素的含量。將初篩得到的菌株及原始菌株接到50 mL pH 7.2的酵母粉培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶)，起始OD600均調(diào)為0.06，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)，每24 h測(cè)定核黃素含量及生長(zhǎng)曲線。

(4)二次重離子誘變選育。對(duì)二次重離子誘變的菌株重復(fù)第一次篩選的過(guò)程，選育出新的核黃素高產(chǎn)菌株。

(5)培養(yǎng)條件優(yōu)化。選擇核黃素產(chǎn)量最高的菌株進(jìn)行研究。取1 mL種子液接入到50 mL pH 7.7的酵母粉培養(yǎng)基中，不同溫度(34 ℃、37 ℃、40 ℃)下，220 r/min培養(yǎng)；取1 mL種子液接入到50 mL不同pH值(6.7、7.2、7.7、8.2)的酵母粉培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)；取1 mL種子液接入到50 mL pH 7.7的酵母粉培養(yǎng)基中，37 ℃在不同轉(zhuǎn)速下(180、220、260 r/min)培養(yǎng)。每個(gè)樣品均為3個(gè)平行樣。

1.2.3 發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

300 mL pH 7.7的種子培養(yǎng)基接入15 mL的菌液，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)14 h，接入到3 L pH 7.7的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在5 L的雙聯(lián)平行發(fā)酵罐(上海迪畢爾生物)中發(fā)酵，37 ℃，控制pH 7.7，通氣量為1～3 vvm，轉(zhuǎn)速在200～800 r/min，溶氧濃度(DO)分別控制為20%、30%及40%，每個(gè)條件重復(fù)3批。

1.2.4 遺傳穩(wěn)定性測(cè)試

將獲得的高產(chǎn)菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)傳代6次，每隔2代接入發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)定核黃素產(chǎn)量。

1.2.5 測(cè)試分析方法

(1)生物量測(cè)定方法。以空白培養(yǎng)基為參比溶液，發(fā)酵液靜置15 min后取上清液測(cè)定OD600的吸光度值，吸光度值為0.3～0.8，如超出該吸光度值，用空白培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定值在該線性范圍內(nèi)為宜[13]。

(2)核黃素測(cè)定方法。盡量搖勻搖瓶或發(fā)酵罐中的核黃素結(jié)晶，取100 μL發(fā)酵液加入900 μL 0.5 mol/L NaOH溶液后混勻，將稀釋后的待測(cè)溶液與乙酸-乙酸鈉溶液等體積混勻，13 800 r/min離心2 min，取上清液，以乙酸-乙酸鈉緩沖液作為參比溶液，OD444應(yīng)在0.3～0.8范圍之內(nèi)，如果超出此范圍，則繼續(xù)用乙酸-乙酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，直到吸光度值落入線性區(qū)間。計(jì)算公式：核黃素濃度(mg/L) =稀釋倍數(shù)×(吸光度-0.005 7)/0.032 1[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重離子誘變及平板初篩結(jié)果

不同輻照劑量對(duì)枯草桿菌的致死率如圖1所示。通過(guò)致死率分析可知，重離子輻照誘變產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的作用較明顯，隨著輻射劑量的增加，致死率也在增加。在60～140 Gy的輻照劑量范圍時(shí)，致死率曲線會(huì)呈現(xiàn)類似“馬鞍形”的變化趨勢(shì)[10]，這種存活效應(yīng)即低劑量輻射超敏感效應(yīng)及增強(qiáng)的輻射抗性[14]，本實(shí)驗(yàn)采取較高的輻射劑量，未出現(xiàn)此種效應(yīng)。

圖1 輻照劑量對(duì)菌株致死率的影響Figure 1 Effection of irradiation dose on mortality rate of B. subtilis

8-NA是核黃素合成途徑中核黃素的前體物質(zhì)GTP的結(jié)構(gòu)類似物，能夠阻斷磷酸核糖焦磷酸合成酶對(duì)GTP的反饋抑制，從而積累GTP進(jìn)一步促進(jìn)核黃素的高效生成。30 mg/L的8-氮鳥嘌呤是該菌株的MIC。郭佳欣等[12]的研究結(jié)果是40 mg/L MIC，這表明不同的菌株其MIC值也有所差別。將誘變后的菌液稀釋涂布在此最低MIC的篩選平板上，圖2為平板上長(zhǎng)出的菌落，能夠觀察到誘變菌株的菌落沒(méi)有明顯變化，但誘變菌株的菌落周圍有明顯的橙黃色，說(shuō)明核黃素產(chǎn)量較高，通過(guò)加入拮抗物能夠明顯看出菌株的核黃素產(chǎn)量，從而降低篩選的工作量，是選育高產(chǎn)菌株的有效手段之一。

(a)誘變菌株；(b)原始菌株。圖2 菌落形態(tài)Figure 2 The colony morphology of B. subtilis

2.2 搖瓶復(fù)篩

挑選菌落周圍顏色較深，菌苔較厚的菌落進(jìn)行保存，由于平板上高產(chǎn)菌株的核黃素染色將相鄰的菌落蘊(yùn)染成一片，無(wú)法通過(guò)單菌落周圍顏色的深淺準(zhǔn)確判斷高產(chǎn)菌株，所以將初步選擇的60個(gè)單菌落接入試管培養(yǎng)后測(cè)定核黃素產(chǎn)量進(jìn)一步篩選高產(chǎn)菌株，結(jié)果表明有4株菌核黃素產(chǎn)量明顯高于原始菌株。將此4株菌及原始菌株分別接入搖瓶進(jìn)一步驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，原始菌及誘變后的菌生長(zhǎng)規(guī)律相似，在72 h到達(dá)峰值，而核黃素是生長(zhǎng)相關(guān)型，產(chǎn)量隨著菌株的生長(zhǎng)而增加，篩選的4株誘變菌比原始菌株要高，提高最明顯的是誘變菌株B13，產(chǎn)量為(401.8±9.2)mg/L，比原始菌株(339.1±10.5)mg/L提高18.5%，由此可見(jiàn)，重離子輻射誘變具有較好的誘變特性。

圖3 不同菌株在72 h的核黃素產(chǎn)量Figure 3 The yield of riboflavin in 72 h of different strains

2.3 二次重離子誘變及選育高產(chǎn)菌株

選擇B.subtilisB13作為新的出發(fā)菌株對(duì)其進(jìn)行二次重離子誘變，從平板上挑取邊緣光滑周圍顏色深的菌落80個(gè)，經(jīng)試管及搖瓶發(fā)酵篩選，獲得3株核黃素產(chǎn)量較高的菌株，72 h產(chǎn)量如圖4所示。菌株BII7核黃素產(chǎn)量(818.8±17.3)mg/L，比一次誘變菌株B3的產(chǎn)量提高77.7%，可作為新的研究菌株，其余兩株菌分別提高55.4%、37.8%，表明二次重離子誘變?nèi)跃哂休^好的效果，本課題組對(duì)產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌進(jìn)行重離子二次誘變，也獲得高酶活菌株[11]。

圖4 二次誘變菌株的核黃素產(chǎn)量Figure 4 The yield of riboflavin of secondary mutagenic strains

2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

一次重離子選育的高產(chǎn)菌株B13也進(jìn)行過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化(數(shù)據(jù)略)，優(yōu)化后的最佳條件為37 ℃、pH 7.7及220 r/min，優(yōu)化后的核黃素產(chǎn)量從(401.8±9.2)mg/L提高到(460.8±7.7)mg/L，對(duì)二次誘變菌株BII7再次進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果圖5所示。圖5(a)表明高產(chǎn)菌株的最適發(fā)酵溫度沒(méi)有發(fā)生變化，仍然為37 ℃；圖5(b)為37 ℃時(shí)在不同的pH值條件下誘變菌株的核黃素產(chǎn)量，在pH值為7.2～7.7時(shí)，酶活較高，弱堿性的條件有利于核黃素的生產(chǎn)；圖5(c)為37 ℃、pH 7.7時(shí)在不同轉(zhuǎn)速下的核黃素產(chǎn)量，220 r/min以上核黃素產(chǎn)量較高。二次誘變菌株同一次誘變菌株最適發(fā)酵條件一致，沒(méi)有明顯變化。

2.5 5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

控制不同溶氧條件下的5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果如圖6所示，誘變菌株B.subtilisBII7的發(fā)酵周期比在搖瓶中提前12 h即在60 h時(shí)達(dá)到核黃素最高生產(chǎn)時(shí)間，在發(fā)酵罐中，核黃素產(chǎn)量也有較大提高。溶氧水平明顯對(duì)核黃素產(chǎn)量有較大影響，溶氧控制40%時(shí)60 h核黃素產(chǎn)量達(dá)到1 385.3 mg/L，但是與溶氧濃度30%時(shí)沒(méi)有顯著差異，因此維持30%以上的溶氧濃度，核黃素產(chǎn)量不受影響，比搖瓶發(fā)酵提高69.2%，表明此誘變菌株具有較好的發(fā)酵罐適應(yīng)能力。經(jīng)過(guò)兩次重離子誘變后，核黃素的產(chǎn)量有了較大的提高，推測(cè)菌株的代謝途徑或者一些關(guān)鍵酶的合成發(fā)生了變化，具有深入研究的意義。

(a)溫度；(b)pH值；(c)轉(zhuǎn)速。圖5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化Figure 5 Optimization of culture conditions

圖6 5 L發(fā)酵罐擴(kuò)培Figure 6 The riboflavin fermentation profile in 5 L fermenter

2.6 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

工業(yè)生產(chǎn)需要生產(chǎn)菌株具備良好的遺傳穩(wěn)定性，誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性如圖7所示，由圖7可以看出，誘變菌株傳代6次后依然具有較好的遺傳穩(wěn)定性，因此具有工業(yè)應(yīng)用的潛力。

圖7 枯草芽孢桿菌BII7遺傳穩(wěn)定性Figure 7 Genetic stability of B. subtilis BII7

3 結(jié)論與展望

重離子輻射具有較好的誘變特性，產(chǎn)核黃素的枯草桿菌經(jīng)二次誘變選育及培養(yǎng)條件優(yōu)化后，在發(fā)酵罐中有較高的產(chǎn)量，最高產(chǎn)量1 385.3 mg/L，且具有穩(wěn)定的遺傳特性，但是菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基可用較低成本或其他物質(zhì)代替，張續(xù)等[15]以木糖為主的木糖/蔗糖共代謝發(fā)酵枯草芽孢桿菌產(chǎn)核黃素，產(chǎn)量具有顯著提高效應(yīng)。還有學(xué)者應(yīng)用不同的方法進(jìn)行誘變選育，祝金山等[4]用常壓室溫等離子體誘變選育核黃素，獲得枯草桿菌高產(chǎn)突變株產(chǎn)量達(dá)9 447 mg/L，比原始菌株提高16.8%，而郭佳欣等[12]在用等離子體誘變后篩選得到的高產(chǎn)菌株比原始菌株產(chǎn)量提高83.59%，又將核黃素操縱子表達(dá)質(zhì)粒pMX45 轉(zhuǎn)入誘變菌株，得到穩(wěn)定性的高產(chǎn)菌株產(chǎn)量高達(dá)(4 467.08±99.47)mg/L,比原始菌株提高140.94%。張續(xù)等[15]采用ribA-ribH基因共表達(dá)的方法獲得高產(chǎn)菌株核黃素產(chǎn)量達(dá)到 3.6 g/L。此外誘變菌株的選育方法也可大幅提高效率，郭佳欣等[12]采用第一輪以 8-氮鳥嘌呤為篩選拮抗物進(jìn)行篩選，第二輪以寡霉素為篩選拮抗物進(jìn)行篩選得到高產(chǎn)誘變菌株。付首穎等[16]采用工業(yè)菌種選育與高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，對(duì)流式細(xì)胞分選、液滴微流控分選和96孔板篩選在核黃素工業(yè)菌株篩選中的應(yīng)用進(jìn)行研究，并對(duì)96孔板篩選方法進(jìn)行了優(yōu)化，得到高產(chǎn)菌株產(chǎn)量為2.53 g/L，比原始菌提高了15%，這些都是提高核黃素產(chǎn)量的研究方向。

重離子輻射誘變的機(jī)理也是值得深入探討的內(nèi)容，輻照過(guò)程中重離子能致細(xì)胞表面穿孔，進(jìn)而引起DNA損傷和變異[17]，還會(huì)引起DNA斷裂，片段的數(shù)量隨輻射劑增加而增多[18]。不同類型的重離子誘變，引發(fā)如倒置、易位、缺失、重排、點(diǎn)突變等[19]。高質(zhì)量的重離子輻射更可能引起基因缺失的現(xiàn)象[20]。本課題組在前期的研究中使用重離子誘變產(chǎn)α-淀粉酶枯草桿菌獲得高產(chǎn)菌株，發(fā)現(xiàn)淀粉酶基因表達(dá)量提高了1.64倍，誘變前后的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)有63處突變位點(diǎn)[11]。因此對(duì)重離子誘變的高產(chǎn)核黃素菌株進(jìn)行機(jī)理研究，有助于對(duì)核黃素代謝途徑進(jìn)行改造，從而獲得更高產(chǎn)量的菌株。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所對(duì)本研究的支持和幫助。