鄧楷煜，安秋菊，陳安琪，俞繼華，張富麗，廖 海

(1.西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，成都 610066)

α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor，ASI)是具有Kunitz結(jié)構(gòu)域的活性肽，其由180～200個(gè)氨基酸殘基組成，含有2個(gè)二硫鍵。ASI能夠與α-淀粉酶形成靶酶-抑制劑復(fù)合物，從而抑制α-淀粉酶的活性。ASI的分子結(jié)構(gòu)中抑制淀粉酶的活性區(qū)域分布于C末端，主要的活性氨基酸殘基為谷氨酸[1]。目前已從大麥、小麥與大米中分別發(fā)現(xiàn)該類(lèi)型抑制劑的蛋白及其基因序列[1-4]。分析大麥來(lái)源的BASI與大麥淀粉酶-2(AMY2)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Ca2+、水分子與BASI形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，加強(qiáng)了復(fù)合物表面的靜電作用，提高了復(fù)合物的穩(wěn)定性[2]。ASI在植物的生長(zhǎng)發(fā)育與抗逆防御等重要生理過(guò)程中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[5]，不僅對(duì)多種昆蟲(chóng)體內(nèi)的α-淀粉酶發(fā)揮抑制作用，影響昆蟲(chóng)吸收營(yíng)養(yǎng)，起抗蟲(chóng)的作用[6-8]，還能抑制人體腸道內(nèi)α-淀粉酶的活性，減少糖在人體內(nèi)的消化吸收，具有降血糖、降血脂的功效[9-10]。目前，ASI已廣泛應(yīng)用在減肥、糖尿病治療和抗蟲(chóng)害等領(lǐng)域。因此，為更好地開(kāi)展ASI基因的功能鑒定、應(yīng)用、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及轉(zhuǎn)基因植物培育等研究，需要提高LASI在宿主中的表達(dá)效率。

中藥川芎(LigusticumchuanxiongHort)是四川省的道地藥材，在云南、甘肅等地均廣泛分布，具有降糖、祛風(fēng)止痛、行氣等多種功效[11]，但是川芎在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受害蟲(chóng)侵害[6]。課題組在前期已成功擴(kuò)增出川芎α-淀粉酶抑制劑基因的全長(zhǎng)cDNA序列(Ligusticumchuanxiongα-amylase inhibitor，LASI，GenBank登錄號(hào) KX580040)，結(jié)合已有文獻(xiàn)資料，推測(cè)川芎α-淀粉酶抑制劑(LASI)具有降糖作用與抗蟲(chóng)活性[5-6]，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。文章以大腸桿菌為宿主細(xì)胞，確定LASI的最適表達(dá)載體與最優(yōu)誘導(dǎo)表達(dá)條件。為達(dá)此目標(biāo)，構(gòu)建pET28a-LASI等4種不同的表達(dá)質(zhì)粒，初步考察4種不同表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)效率，發(fā)現(xiàn)pET28a是LASI基因的較適合表達(dá)載體，隨后以pET28a-LASI作為表達(dá)質(zhì)粒，探究誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度與誘導(dǎo)溫度對(duì)LASI重組蛋白表達(dá)的影響，并檢測(cè)純化后的LASI重組蛋白對(duì)豬源α-淀粉酶[12]的抑制活性。研究結(jié)果為L(zhǎng)ASI的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)、糖尿病治療、抗蟲(chóng)及相關(guān)轉(zhuǎn)基因植物培育[13-14]奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)化菌：LASI-T重組質(zhì)粒由課題組構(gòu)建完成并保存于TOP10菌株中。試劑與培養(yǎng)基：NdeI、XbaI、BamH I、NotI、NcoI、XhoI、EcoR I、T4 DNA連接酶、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素、氯霉素均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；豬源淀粉酶購(gòu)自Sigma公司?？贵w：Anti-His(Rabbit)、Anti-Rabbit IgG，HRP-labeled(Goat)購(gòu)自Thermo公司。

1.2 表達(dá)載體的篩選

以L(fǎng)ASI-T重組質(zhì)粒為目標(biāo)，依次設(shè)計(jì)引物(表1)，經(jīng)PCR擴(kuò)增出的LASI基因片段分別連入載體pCznI的NdeI(CATATG)-XbaI(TCTAGA)位點(diǎn)之間、載體pGEX-4T-1的BamH I (GGATCC)-NotI(GCGGCCGC)位點(diǎn)之間、載體pET22b的NcoI(CCATGG)-XhoI(CTCGAG)位點(diǎn)之間、載體 pET28a的BamH I (GGATCC)-EcoRI(GAATTC)位點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pCznI-LASI、pGEX-4T-1-LASI、pET22b-LASI及pET28a-LASI。將獲得的重組質(zhì)粒pCznI-LASI、pGEX-4T-1-LASI、pET22b-LASI及pET28a-LASI分別轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.3 轉(zhuǎn)化菌的培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)

在含50 μg/mL卡那霉素(Kan) 和25 μg/mL氯霉素(Chl)的LB液體培養(yǎng)基中活化含有pET28a-LASI重組質(zhì)粒的Rosetta菌株。在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)至OD600值大于0.6后，加入誘導(dǎo)劑(IPTG)使終濃度為1.0 mmol/L，在誘導(dǎo)溫度為27 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min和誘導(dǎo)時(shí)間為8 h的條件下誘導(dǎo)LASI蛋白高效表達(dá)。于超聲細(xì)胞破碎機(jī)破碎菌體，隨后取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。以未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌株為對(duì)照組。

在含50 μg/mL氨芐西林(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中活化含有pCznI-LASI、pGEX-4T-1-LASI的Rosetta菌株。分別在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)至OD600值大于0.6后，加入誘導(dǎo)劑(IPTG)使終濃度為0.5 mmol/L，在誘導(dǎo)溫度為20 ℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min的條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

在含50 μg/mL氨芐西林(Amp)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)液中活化含有pET22b-LASI的Rosetta菌株。在37 ℃下?lián)u床培養(yǎng)至OD600值大于0.6后，在誘導(dǎo)溫度20 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

1.4 誘導(dǎo)適宜時(shí)間的篩選

經(jīng)過(guò)初步篩選，在Rosetta菌株中含有pET28a-LASI重組質(zhì)粒的蛋白表達(dá)量最高，因此選擇該基因工程菌為目標(biāo)菌株，在此基礎(chǔ)上，分別探究誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度和誘導(dǎo)溫度對(duì)pET28a-LASI重組蛋白表達(dá)的影響。

在37 ℃下將重組菌株培養(yǎng)至OD600值為0.6后，加入IPTG使終濃度為1.0 mmol/L。在27 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)1、2、4、8和24 h 后分別取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。將含有pET28a空載的Rosetta菌株作為空白組，未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌株作為對(duì)照組。

1.5 IPTG濃度的篩選

在37 ℃下將含有pET28a-LASI重組質(zhì)粒的Rosetta菌株培養(yǎng)至OD600值為0.6后，將IPTG分別加入5個(gè)相同的培養(yǎng)瓶中，使IPTG終濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 mmol/L，在27 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)，8 h后取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。將含有pET28a空載的Rosetta菌株作為空白組，未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌株作為對(duì)照組。

1.6 誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度篩選

在37 ℃下將含有pET28a-LASI重組質(zhì)粒的Rosetta菌株培養(yǎng)至OD600值為0.6后，加入IPTG使終濃度達(dá)到1.0 mmol/L。在17 ℃、22 ℃、27 ℃、32 ℃和37 ℃ 等5個(gè)溫度下分別誘導(dǎo)表達(dá)8 h后取樣進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。將含有pET28a空載的Rosetta菌株作為空白組，未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌株作為對(duì)照組。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物純化

在IPTG濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間8 h，誘導(dǎo)溫度27 ℃的條件下,誘導(dǎo)表達(dá)LASI重組蛋白，于超聲波細(xì)胞破碎機(jī)破碎菌體，并離心收集上清液，將上清液加入Ni2+親和柱結(jié)合3 h，取經(jīng)400 mmol/L咪唑緩沖液洗脫后的目的蛋白LASI，將樣品富集后進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)。將含有pET28a空載的Rosetta菌株作為空白組，未加IPTG誘導(dǎo)的重組菌株作為對(duì)照組。LASI蛋白濃度利用改良型BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)。具體相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為562 nm。

1.8 Western Blot分析

以兔源His 標(biāo)簽抗體作為一抗(稀釋比1∶1 000)，羊抗兔IgG為二抗(稀釋比1∶5 000)對(duì)純化的蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定。操作步驟如下：將獲得的LASI蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，取5 μL樣品上樣。聚丙烯酰胺凝膠于90 V下跑完積層膠，后將電壓增加到200 V至電泳結(jié)束。電泳結(jié)束后，在恒壓100 V、恒流250 mA條件下轉(zhuǎn)膜1.5 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用PBST洗滌4次，每次5 min。隨后將膜置于5%脫脂奶粉封閉液中37 ℃封閉1 h。用封閉液稀釋一抗，并將膜置于一抗稀釋液中于4 ℃過(guò)夜。次日將膜取出用PBST洗滌4次，每次5 min。用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗，將膜置于二抗稀釋液中37 ℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)完畢后，取出膜置于干凈的盒子中洗滌4次，每次5 min。ECL顯影，曝光。

1.9 LASI重組蛋白抑制活性檢測(cè)

分別配制0.15%淀粉溶液、I2-KI溶液、1 mg/mL的淀粉酶溶液備用。檢測(cè)LASI對(duì)淀粉酶的抑制活性參考Erlanger法[15]和碘-淀粉呈色法，淀粉遇碘變藍(lán)[16-17]，在波長(zhǎng)為640 nm下采用可見(jiàn)光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)(表2)。

表2 抑制活性測(cè)定流程Table 2 Inhibitory activity assay process

淀粉酶抑制活性(IA)計(jì)算公式：IA=100%×{[(A3-A2) -(A3-A1)]/(A3-A2)}

2 結(jié)果與分析

2.1 不同表達(dá)載體LASI重組蛋白表達(dá)

分別采用pET28a、pCznI、pGEX-4T-1和pET22b構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，于大腸桿菌Rosetta (DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知，因誘導(dǎo)載體的不同，重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)率差異較大。pCznI-LASI、pGEX-4T-1-LASI、pET28a-LASI均有表達(dá)，pET22b-LASI無(wú)明顯表達(dá)，pET28a-LASI能成功誘導(dǎo)出LASI重組蛋白，并且有較多重組蛋白為可溶性形式。因此pET28a是LASI蛋白較好的表達(dá)載體。

(a)pET22b-LASI原核表達(dá)(M：蛋白 Marker；1：pET22b-LASI未誘導(dǎo)；2：pET22b-LASI誘導(dǎo)后；3：pET22b-LASI誘導(dǎo)后上清液；4：pET22b-LASI誘導(dǎo)后沉淀)。(b)pCznI-LASI原核表達(dá)(M：蛋白 Marker；1：pCznI-LASI未誘導(dǎo)；2：pCznI-LASI誘導(dǎo)后；3：pCznI-LASI誘導(dǎo)后上清液；4：pCznI-LASI誘導(dǎo)后沉淀)。(c)pGEX-4T-1-LASI原核表達(dá)(M：蛋白 Marker；1：pGEX-4T-1-LASI未誘導(dǎo)；2：pGEX-4T-1-LASI誘導(dǎo)后；3：pGEX-4T-1-LASI誘導(dǎo)后上清液；4：pGEX-4T-1-LASI誘導(dǎo)后沉淀)。(d)pET28a-LASI原核表達(dá)(M：蛋白 Marker；1：pET28a-LASI未誘導(dǎo)；2：pET28a-LASI誘導(dǎo)后；3：pET28a-LASI誘導(dǎo)后上清液；4：pET28a-LASI誘導(dǎo)后沉淀)。圖1 LASI基因的原核表達(dá)Figure 1 Prokaryotic expression of LASI gene

2.2 不同誘導(dǎo)時(shí)間LASI重組蛋白表達(dá)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)可知，在誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑(IPTG)濃度相同的情況下，1 h后pET28a-LASI重組蛋白開(kāi)始表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間在1～8 h，重組蛋白的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有所增加，8 h后表達(dá)量逐漸趨于平穩(wěn)，并沒(méi)有明顯增加。表明LASI重組蛋白的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。

圖2 誘導(dǎo)時(shí)間梯度對(duì)LASI蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effect of induction time gradient on LASI protein expression

2.3 不同IPTG濃度的LASI重組蛋白表達(dá)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)可知，在誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間相同的情況下，在IPTG終濃度為0.1 mmol/L時(shí)即開(kāi)始表達(dá)出pET28a-LASI重組蛋白，當(dāng)IPTG終濃度在0.1～1.0 mmol/L時(shí)，LASI重組蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)劑濃度的增加并未大幅度增加，且當(dāng)濃度達(dá)1.0 mmol/L時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大值。

圖3 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)LASI蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of different IPTG induced concentrations on LASI protein expression

2.4 不同誘導(dǎo)溫度LASI重組蛋白表達(dá)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4)可知，在誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度相同的情況下，誘導(dǎo)溫度為17 ℃時(shí)，pET28a-LASI重組蛋白開(kāi)始表達(dá)。蛋白表達(dá)量隨著溫度的增加而增加，但在27 ℃后表達(dá)量到達(dá)峰值且趨于穩(wěn)定。表明27 ℃為誘導(dǎo)表達(dá)LASI重組蛋白的最佳溫度。

圖4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)誘導(dǎo)LASI蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effect of different induction temperature on the expression of LASI protein

2.5 LASI重組蛋白純化結(jié)果

在最佳誘導(dǎo)條件(IPTG濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度27 ℃以及誘導(dǎo)時(shí)間8 h)下誘導(dǎo)表達(dá)LASI重組蛋白，將表達(dá)后的菌體經(jīng)超聲破碎后，破裂的菌體釋放蛋白至重懸緩沖液中。經(jīng)離心后取上層溶液，通過(guò)純化柱純化并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，純化后的LASI重組蛋白顯示出清晰的條帶，檢測(cè)LASI純化蛋白的濃度為614 μg/mL，可用于后續(xù)活性檢測(cè)。

M：蛋白 Marker；1：pET28a-LASI未誘導(dǎo)；2：pET28a-LASI誘導(dǎo)后;3：pET28a-LASI誘導(dǎo)后上清液；4：純化后的pET28a-LASI。圖5 LASI蛋白純化后SDS-PAGE電泳Figure 5 SDS-PAGE electrophoresis of purified LASI protein

2.6 LASI重組蛋白鑒定

Western Blot結(jié)果如圖6所示，實(shí)驗(yàn)獲得的LASI重組蛋白能與His單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，雜交帶位置在22 ku附近，與LASI重組蛋白預(yù)期分子質(zhì)量相符，表明得到了LASI重組蛋白。

M：Marker；1：純化后樣品。圖6 蛋白Western Blot鑒定分析Figure 6 Western Blot analysis of protein

2.7 LASI重組蛋白抑制活性

LASI對(duì)豬源α-淀粉酶的抑制活性通過(guò)碘-淀粉呈色法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)添加30 μg純化的LASI時(shí)，觀察到66%的α-淀粉酶殘余活性，LASI對(duì)α-淀粉酶的最終抑制比為34%。由此可見(jiàn)，LASI重組蛋白對(duì)α-淀粉酶的活性有一定抑制作用。

圖7 LASI活性檢測(cè)Figure 7 LASI activity detection

3 討論與結(jié)論

表達(dá)載體的選擇不僅直接影響重組蛋白的整體表達(dá)量，還與重組蛋白的可溶性表達(dá)密切相關(guān)。然而，不同基因采用何種表達(dá)載體并無(wú)明顯規(guī)律性，只能通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選合適的表達(dá)載體。張姝等[18]通過(guò)構(gòu)建pET28a- MDBG-1、pGEX-4T-1- MDBG-1兩種表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)pET28a的表達(dá)量高于pGEX-4T-1，邱淑彬等[19]通過(guò)比較兩種不同原核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)pGEX-6p-1原核表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)出足量的CP05-GFP蛋白，孫文超等[20]通過(guò)構(gòu)建多種歐洲型PRRSV GP5蛋白原核表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)GP5蛋白在pGEX-4T-1載體中高效表達(dá)。構(gòu)建pET28a-LASI等4種不同的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示：以pET28a為載體時(shí)，LASI基因的表達(dá)效率較高，產(chǎn)生的LASI重組蛋白最多，因此pET28a為L(zhǎng)ASI基因的較好表達(dá)載體。

基因的表達(dá)還受到誘導(dǎo)時(shí)間等多種因素影響。適當(dāng)延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間能增加蛋白的表達(dá)量，但是當(dāng)?shù)鞍卓偙磉_(dá)量達(dá)到峰值后，即使再延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間也不會(huì)顯著增加蛋白表達(dá)量。羅非魚(yú)Galectin-8基因在誘導(dǎo)2 h后即達(dá)到最佳表達(dá)量[21]，水芹HSP90基因的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h[22]。結(jié)果表明，在誘導(dǎo)8 h后pET28a-LASI重組蛋白的表達(dá)量達(dá)到最佳。

誘導(dǎo)劑能夠明顯提高重組蛋白的整體表達(dá)量，但重組蛋白的可溶性表達(dá)會(huì)因誘導(dǎo)劑濃度偏高而有所降低，導(dǎo)致產(chǎn)生較多的包涵體，不利于后期純化[23]。水芹HSP90基因在IPTG終濃度為0.2 mmol/L時(shí)，即可表達(dá)HSP90蛋白，但蛋白的表達(dá)量并沒(méi)有隨著IPTG濃度的增加而顯示出大幅度的增加[22]。鯉魚(yú)IL-17N基因隨著IPTG濃度的變化，其蛋白表達(dá)量也沒(méi)有明顯差異[24]。結(jié)果表明：在 IPTG終濃度為0.1 mmol/L時(shí)，pET28a-LASI開(kāi)始表達(dá)，且IPTG終濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)，LASI基因的表達(dá)量隨著IPTG濃度的增加而增加，但并未呈現(xiàn)線(xiàn)性增長(zhǎng)關(guān)系，在IPTG終濃度為1.0 mmol/L時(shí)LASI基因的表達(dá)量達(dá)到峰值。

誘導(dǎo)溫度在基因表達(dá)中也是至關(guān)重要的一個(gè)因素，過(guò)高或者過(guò)低的溫度均不利于蛋白表達(dá)。如羅非魚(yú)Galectin-8在25 ℃時(shí)[21]的表達(dá)量比37 ℃時(shí)的表達(dá)量明顯減少。羅非魚(yú)NCCRP-1[25]在20 ℃達(dá)到最佳的表達(dá)效果。水芹HSP90[22]的最佳誘導(dǎo)溫度為37 ℃。結(jié)果表明，pET28a-LASI的最適誘導(dǎo)溫度為27 ℃。

Kunitz類(lèi)型的α-淀粉酶抑制劑含有兩個(gè)二硫鍵，采用Rosetta為宿主細(xì)胞，在最優(yōu)表達(dá)條件下，能夠成功表達(dá)出有生物學(xué)活性的LASI重組蛋白，這為后續(xù)的抗蟲(chóng)、抗逆與降糖等研究奠定基礎(chǔ)。