趙歷強，趙德蕊，單春苗，張聲祥，施圓圓，吳家文

(1．安徽中醫(yī)藥大學 研究生院，合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心新安醫(yī)學教育部重點實驗室，合肥 230038；3.安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥科學院，合肥 230012)

多花黃精(PolygonatumcyrtonemaHua,PC)為百合科黃精屬植物，多生于林下、灌叢和山坡陰處[1]，是我國著名中草藥，其藥用部位為根狀莖，具有健脾、潤肺、益腎等功效[2]。多花黃精中含有多種藥用成分，主要包括多糖、黃酮、甾體皂苷等化合物[3]。多糖在多花黃精所有成分中含量較高[4]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[5-7]。

目前研究認為多花黃精的多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖等單糖構(gòu)成[8]，其生物合成途徑起始于蔗糖[9]，在果糖激酶、己糖激酶和GDP-甘露糖焦磷酸化酶等共同作用下合成黃精多糖[10]。果糖激酶(FRK)是黃精多糖生物合成途徑中第二個關(guān)鍵酶，催化果糖磷酸化生成6-磷酸果糖，其對果糖的親和性遠大于同樣催化果糖的己糖激酶[11-12]；GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GMPP)催化1-磷酸甘露糖生成GDP-甘露糖，GDP-甘露糖在黃精中廣泛參與多糖、抗壞血酸等的生物合成[13-14]。

近年來，F(xiàn)RK在枸杞[15]、蘋果[16]、楊梅[17]等植物中被相繼發(fā)現(xiàn)和克隆，同時石斛[18]、茶樹[19]、擬南芥[20]等植物的GMPP也被成功克隆與鑒定，但多花黃精的FRK和GMPP還尚未見報道。研究通過對多花黃精的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)掘黃精多糖生物合成途徑中一系列關(guān)鍵酶基因，并利用RT-PCR技術(shù)成功克隆出關(guān)鍵酶FRK和GMPP的完整開放讀碼框，通過分析其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特點，為揭示黃精多糖生物合成途徑中酶蛋白的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗多花黃精于2018年采自安徽中醫(yī)藥大學藥物園，經(jīng)中藥鑒定學專業(yè)楊青山老師確認。將新鮮的多花黃精根、塊莖、葉用純水洗凈擦干后置于50 mL離心管中，并放入液氮中速凍2 h后置于-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成

實驗器具經(jīng)高溫滅菌后，將多花黃精的各器官分別放入研缽中，加入液氮研磨至粉末，用RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)對RNA進行純化，用Agilent 2100生物分析儀檢測其濃度及完整性，高質(zhì)量的RNA作為模板進行cDNA的合成。

1.2.2 引物設(shè)計

PCFRK和PCGMPP序列來源于多花黃精的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，使用Primer 5.0軟件在ORF兩端設(shè)計出一對特異性擴增引物。

表1 PCFRK和PCGMPP引物序列Table 1 PCFRK and PCGMPP primer sequences

1.2.3PCFRK和PCGMPP的克隆

首先利用Oligo(dT)磁珠富集多花黃精mRNA，再以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板通過PCR對PCFRK和PCGMPP進行擴增。PCFRK基因較長，先用高保真酶(TOYOBO生物公司)進行PCR擴增，后以此PCR的產(chǎn)物為模板、用ExTaq酶(TAKARA生物公司)體系再次進行PCR擴增；PCGMPP基因則直接使用ExTaq酶進行PCR擴增，PCR的產(chǎn)物用試劑盒(AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit)進行膠回收，從而使目的基因片段PCFRK和PCGMPP得到純化。

1.2.4 克隆載體的構(gòu)建

將pMD19-T載體與純化后的PCFRK和PCGMPP基因片段連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞(E.coliDH5α)中培養(yǎng)，挑選經(jīng)菌液PCR鑒定正確的克隆進行測序。

1.2.5 生物信息學分析

利用TransDecoder(v3.0.1)軟件分析Unigene開放讀碼框(ORF)，用在線工具ExPASy(https:∥web.expasy.org/protparam /)計算編碼蛋白氨基酸種類、數(shù)目、相對分子質(zhì)量和等電點等理化性質(zhì)；用MEGA 5.0和CLUSTALX 1.83軟件對篩選出的PCFRK和PCGMPP的氨基酸序列進行比對并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進化樹，采用Swiss-Model(https:∥swissmodel.expasy.org/)模擬PCFRK和PCGMPP的空間結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件描繪其空間結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與PCFRK、PCGMPP基因的克隆

瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果顯示，在28 S，18 S，5 S處分別有3條清晰明亮的條帶，說明多花黃精的總RNA提取的純度和完整性較高，可用于cDNA的合成。將富集的mRNA作為模板逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再利用PCR技術(shù)對目的基因擴增，并進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示在約2 000 bp和1 000 bp處各出現(xiàn)一條亮帶，這與通過轉(zhuǎn)錄組分析獲得的目的基因片段(PCFRK：Un20408，PCGMPP：Un7094)長度一致(圖1)。

(a)總RNA純化；(b)PCFRK基因的克隆；(c)PCGMPP基因的克隆。(b)和(c)中箭頭示意目的基因片段。圖1 總RNA純化及PCFRK和PCGMPP基因的克隆Figure 1 Extraction of total RNA and cloning and identification of PCFRK and PCGMPP

2.2 生物信息學分析

生物信息學分析結(jié)果表明PCGMPP相對分子質(zhì)量為39 650.38，理論等電點為6.33，為偏酸性蛋白質(zhì)，ORF為1 086 bp，編碼361個氨基酸，其中亮氨酸數(shù)量最多，為35個，占9.7%；PCFRK相對分子質(zhì)量為64 413.25，理論等電點為6.18，也是偏酸性蛋白質(zhì)，ORF為1 725 bp，編碼574個氨基酸，其中絲氨酸數(shù)量最多，為52個，占9.1%(圖2)。

2.3 PCFRK和PCGMPP基元和結(jié)構(gòu)域分析

利用Motif Scan軟件對PCFRK和PCGMPP蛋白的基元和結(jié)構(gòu)域進行分析(圖3)，結(jié)果顯示PCFRK具有 3個糖基化位點，5個N-蛋白質(zhì)豆蔻?；稽c，16個酪蛋白激酶II磷酸化位點，19個蛋白激酶C磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位點；PCGMPP具有1個糖基化位點，4個N-蛋白質(zhì)豆蔻酰化位點，4個酪蛋白激酶II磷酸化位點，3個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點(表2)。

(a)PCFRK讀碼框序列和編碼的蛋白質(zhì)序列；(b) PCGMPP讀碼框序列和編碼的蛋白質(zhì)序列。 圖2 PCFRK和PCGMPP讀碼框序列和編碼的蛋白質(zhì)序列 Figure 2 ORFs and amino acid sequences of PCFRK and PCGMPP

表2 PCFRK和PCGMPP蛋白的基元和結(jié)構(gòu)域分析Table 2 Analysis of motifs or domains of PCFRK and PCGMPP

2.4 PCFRK和PCGMPP的同源關(guān)系及進化樹分析

將PCFRK和PCGMPP與不同植物中的FRK和GMPP進行親緣關(guān)系比對，結(jié)果顯示在已知數(shù)據(jù)庫中PCFRK與深圳擬蘭(Apostasiashenzhenica)親緣關(guān)系最近，PCGMPP與蘆筍(Asparagusoffcinalis)親緣關(guān)系最近(表3、表4和圖3)。

表3 PCFRK與不同物種的FRK比對Table 3 Homologous alignment of FRK proteins

表4 PCGMPP與不同物種GMPP比對Table 4 Homologous alignment of GMPP proteins

2.5 PCFRK和PCGMPP二級結(jié)構(gòu)及空間結(jié)構(gòu)分析

利用Pymol軟件，分別以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中的5ey7.1.B和5z0a.1.A的晶體結(jié)構(gòu)為模板模擬出PCFRK和PCGMPP的三維結(jié)構(gòu)。PCFRK二級結(jié)構(gòu)包含13個β折疊、10個α螺旋和5個TT結(jié)構(gòu)，空間結(jié)構(gòu)由一個大結(jié)構(gòu)域和一個小結(jié)構(gòu)域組成，大結(jié)構(gòu)域是由9個β-折疊和10個α-螺旋構(gòu)成，α-螺旋位于β-折疊的兩側(cè)，構(gòu)成“夾心餅干”狀結(jié)構(gòu)，其中“β3-α1-β4-α2-β5”構(gòu)成了Rossmann折疊，是NAD結(jié)合區(qū)域[21]；而小結(jié)構(gòu)域也被稱作蓋狀結(jié)構(gòu)域，獨立于大結(jié)構(gòu)域之外，由4個β-折疊構(gòu)成[圖4(a)]。此外，PCFRK具有磷酸果糖激酶B家族共同的保守位點“GG”和“DMSXSGD”[22][圖4(b)和(c)]。

(a)PCFRK進化樹；(b) PCGMPP進化樹。下方坐標表示遺傳距離；黑色三角形突出顯示多花黃精中的PCFRK和PCGMPP。圖3 PCFRK和PCGMPP系統(tǒng)進化樹Figure 3 Phylogenetic analysis of PCFRK and PCGMPP

(a) PCFRK三級結(jié)構(gòu)模型(藍色和粉色圓圈分別表示大結(jié)構(gòu)域和小結(jié)構(gòu)域)；(b) PCFRK三級結(jié)構(gòu)模型(紅色球形和綠色球形分別表示保守位點)；(c) PCFRK二級結(jié)構(gòu)(藍色和綠色方框分別顯示保守位點)。圖4 PCFRK二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)模型Figure 4 The secondary structure and tertiary structure model of PCFRK

(a) PCGMPP三聚體結(jié)構(gòu)模型(紅色、藍色、綠色分別示意一個單體)；(b) PCGMPP單體結(jié)構(gòu)模型(紅色棍棒結(jié)構(gòu)示意保守位點，綠色球形結(jié)構(gòu)示意活性位點)；(c) PCGMPP二級結(jié)構(gòu)(藍色方框內(nèi)顯示保守位點氨基酸，黑色方框內(nèi)顯示活性位點氨基酸)。圖5 PCGMPP二級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)模型Figure 5 The secondary structure and tertiary structure model of PCGMPP

PCGMPP空間結(jié)構(gòu)為三聚體，其單體包含22個β折疊、10個α螺旋和10個TT結(jié)構(gòu)，單體的C末端有數(shù)個規(guī)則的左手螺旋式β-折疊，構(gòu)成“杯狀”結(jié)構(gòu)，其N端具有焦磷酸化酶家族“GGXGXRLXPLX5PK”保守序列，同時也具有特異性活性位點“FVEKP”[23](圖5)。

2.6 PCFRK和PCGMPP基因在多花黃精不同組織中的表達

選取具有完整讀碼框且unigene的標準表達量(FragmentsPer Kilobase per Million，F(xiàn)PKM)大于1的基因繪制熱圖，結(jié)果顯示在根狀莖中PCFRK和PCGMPP基因的總體表達量要高于葉和根，這一結(jié)果與根狀莖中多糖含量高于其他組織一致[24](圖6)。

3 討論與結(jié)論

多花黃精是我國著名的藥食同源的藥材，具有健脾、補氣養(yǎng)陰、益腎、潤肺等功效[25-26]，其中黃精多糖是多花黃精的主要藥用成分之一，具有抗氧化、降血糖和抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[27-29]。

L：葉；R：根；T：塊狀莖；熱圖中紅色為高表達；綠色為低表達。圖6 FRK和GMPP在多花黃精不同組織中的基因表達Figure 6 Gene expression of FRK and GMPP in different tissues of PC

課題組基于高通量測序?qū)Χ嗷S精多糖生物合成途徑進行了分析，鑒定了一系列與此途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶[24]，研究成功克隆出其中PCFRK和PCGMPP兩種關(guān)鍵酶基因。PCFRK的ORF為1 725 bp，編碼574個氨基酸，其三維結(jié)構(gòu)由一個大結(jié)構(gòu)域和一個小結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，活性中心位于這兩個結(jié)構(gòu)域之間的裂隙中[30-31]。PCFRK具有兩個磷酸果糖激酶B家族的特征保守基序“GG”和“DMSXSGD”[22]，其中GG為二甘氨酸構(gòu)象開關(guān)，當腺苷與酶的特定位點結(jié)合時，保守基序GG會發(fā)生彎曲，完成催化前構(gòu)象改變[32]；而“DMSXSGD”在構(gòu)象發(fā)生改變后形成一個陰離子通道結(jié)構(gòu)，使ATP上的磷酸轉(zhuǎn)移到腺苷上，完成6-磷酸果糖的生物合成[33-34]。目前研究表明，F(xiàn)RK是多糖生物合成中重要的關(guān)鍵酶之一，可以控制植物中果糖和蔗糖比值[35]，當番茄中FRK過表達時，會導致生長和光合作用受損，影響多糖的合成，從而導致番茄果實和種子變小[36]。Yang等[37]從蘋果多糖生物合成中發(fā)現(xiàn)當FRK代謝合成增加時會導致蔗糖含量下降和山梨醇的增加；趙建華等[16]對枸杞的研究發(fā)現(xiàn)當果糖被FRK磷酸化后含量降低，會促進蔗糖的分解轉(zhuǎn)化。

PCGMPP的ORF為1 086 bp，編碼361個氨基酸，空間結(jié)構(gòu)模型為三聚體，PCGMPP單體的C末端有β-折疊構(gòu)成的“杯狀”結(jié)構(gòu)，“杯體”內(nèi)部為疏水結(jié)構(gòu)，有大量脂肪族殘基[38]。PCGMPP具有焦磷酸化酶家族保守位點“GGXGXRLXPLX5PK”和活性位點“FVEKP”[23]。其中保守位點上的精氨酸和賴氨酸與焦磷酸鹽基團通過靜電相互作用而結(jié)合[23]，而活性位點“FVEKP”與甘露糖相互作用，并在輔助因子Mg2+的共同作用下催化1-磷酸甘露糖生成GDP-甘露糖[39]，GDP甘露糖可參與細胞壁多糖合成、蛋白質(zhì)糖基化和維生素C合成等多種反應[40-41]。Keller等[42]研究發(fā)現(xiàn)抑制土豆中GMPP的表達會引起甘露糖含量降低30%～50%；王維鵬等[20]利用農(nóng)桿菌介導法將擬南芥GMPP酶基因?qū)肷酥?，結(jié)果顯示其維生素C的含量明顯高于對照組；對霍山石斛GMPP研究發(fā)現(xiàn)，GMPP在不同組織中的表達水平與其組織中的多糖含量呈正相關(guān)[43]；研究表明PCFRK和PCGMPP在多花黃精塊莖中高表達與黃精多糖在塊莖中的高積累是一致的，因此推測在黃精多糖的生物合成和積累中PCFRK和PCGMPP同樣也發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

研究通過對多花黃精多糖生物合成途徑兩種關(guān)鍵酶PCFRK和PCGMPP的基因克隆和結(jié)構(gòu)、性質(zhì)分析，為進一步探究PCFRK和PCGMPP在黃精多糖生物合成中發(fā)揮的作用提供了實驗基礎(chǔ)。