張 麗，李 勇，王 昆，張 偉**

(1.昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 650503)

替格瑞洛是由英國阿斯利康(AstraZeneca)公司研發(fā)的一種口服新型強效抗血小板藥物，是第一個可逆地P2Y12受體拮抗劑[1]，臨床上主要用于急性冠脈綜合征 (ACS) 患者及心腦血管血栓事件的預防和治療。替格瑞洛在2011年獲FDA批準，自批準上市以來，因其獨特的藥效學、藥動學和藥理學特征[2-3]，在臨床上被廣泛應用，是我國公立醫(yī)療機構(gòu)終端前10抗血栓藥物產(chǎn)品之一[4]。替格瑞洛分散片是阿斯利康推出的一款新劑型，于2017年5月獲歐盟委員會批準，2020年9月正式在中國獲批進口上市。該劑型既可用于常規(guī)抗血小板治療的患者 ，也可用于只能通過插管法治療，或?qū)Ρ∧ひ缕型萄世щy的患者。當患者急需用藥時，分散片無需壓碎藥片或者尋找飲用水，避免將藥丸壓碎使用，保障患者按量用藥。同時，ACS患者受疾病特點、年齡、治療方式、給藥時間和給藥方式等因素的影響[5-6]，如疾病群體以中老年人為主，患者大多需進行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)，且患者多為急危重癥，常伴有昏迷、心梗等并發(fā)癥[7]。因此，替格瑞洛分散片的研發(fā)和使用可為ACS患者提供一種更安全、更有效、更方便的給藥替代方法。經(jīng)查閱相關(guān)文獻資料和現(xiàn)有質(zhì)量標準，當前對替格瑞洛分散片的質(zhì)量分析研究較少，尤其在含量測定方面的研究。現(xiàn)行質(zhì)量標準和文獻資料中[8-10]，主要以高效液相色譜法測定替格瑞洛含量和含量均勻度。HPLC法專屬性強，靈敏度高，但使用該方法做檢測分析存在一些不足之處，如操作繁瑣、耗時長、需要大量有機溶劑，增加試驗周期,同時也不環(huán)保[11]。另外，從成本上考慮，與紫外分光光度法相比，該方法耗資大幅增加。因此，本研究擬采用UV法測定替格瑞洛分散片的含量均勻度，以期開發(fā)一種簡便快捷、準確、經(jīng)濟、環(huán)保的檢測分析方法，同時可為替格瑞洛分散片相關(guān)質(zhì)量研究提供一定科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ThermoEvolution350紫外/可見分光光度計(美國Thermofisher Scientific公司)；Shimadazu UV-2600i紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；SECURA225D-1CN型賽多利斯電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；SK8300GT超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司)。

1.2 試藥

替格瑞洛對照品(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司標定，批號：ZM032020001-F02，純度：100%)；替格瑞洛分散片(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：90 mg，批號：20210830、20210903、20210907)；空白輔料(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號：20210829)；聚四氟乙烯(PTFE)濾膜(天津津騰試驗設(shè)備有限公司)；乙腈(色譜純，默克股份兩合公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液

取替格瑞洛對照品 15 mg，精密稱定，置于 100 mL 量瓶中；加溶劑[乙腈-水(體積比35∶65)]適量，超聲使替格瑞洛溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取 5 mL，置于 50 mL 量瓶中，加溶劑[乙腈-水(體積比35∶65)]稀釋至刻度，搖勻，制成 15 μg/mL 對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液

取本品10片，分別置于 200 mL 量瓶中，加溶劑[乙腈-水(體積比35∶65)]適量，使替格瑞洛溶解，用溶劑[乙腈-水(體積比35∶65)]稀釋至刻度，搖勻，經(jīng) 0.45 μm 濾膜(PTFE)濾過。精密量取續(xù)濾液 1 mL 置于 30 mL 量瓶中，搖勻，制成 15 μg/mL 供試品溶液 。

2.1.3 空白輔料溶液

按制劑處方比例和制備工藝，制成不含替格瑞洛的空白輔料。取該空白輔料 100 mg(約相當于替格瑞洛 15 mg)，精密稱定，同“2.1.1”項下對照品溶液制備方法同法操作，即得。

2.2 測定原理和方法

2.2.1 測定原理

按公式(1)計算替格瑞洛的質(zhì)量濃度：

(1)

將上述測得的替格瑞洛質(zhì)量濃度代入公式(2)中，即可計算出替格瑞洛的含量：

(2)

式中：V為稀釋體積 200 mL；m為替格瑞洛分散片標示質(zhì)量 90 mg。

2.2.2 測定方法

按照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2020年版四部通則0401[12])在所選檢測波長 300 nm 處依次測定空白溶劑、空白輔料溶液、對照品溶液和供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性及檢測波長選擇

取“2.1”項下制備的對照品溶液、空白輔料溶液及空白溶劑[乙腈-水(體積比35∶65)]在190～500 nm 波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖1。從圖1可知，在222、256和 300 nm 波長處有最大吸收，其中，樣品在 300 nm 波長處無吸收干擾，因此本試驗選定 300 nm 作為替格瑞洛分散片檢測波長，且空白溶劑和空白輔料不影響主藥成分含量均勻度測定。

圖1 替格瑞洛、空白輔料、空白溶劑紫外吸收光譜掃描圖

2.3.2 線性關(guān)系考察

精密稱取替格瑞洛對照品 15.62 mg，置于 100 mL 量瓶中，加溶劑[乙腈-水(35∶65,體積比)]溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為 156.2 μg/mL 時對照品溶液。分別精密量取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL 至 50 mL 量瓶中，加溶劑[乙腈-水(體積比35∶65)]稀釋至刻度，搖勻，得到系列質(zhì)量濃度溶液。在 300 nm 波長處測得系列質(zhì)量濃度溶液吸光度值A(chǔ)。以質(zhì)量濃度(ρ，μg/mL)為橫坐標，吸光度值A(chǔ)為縱坐標，進行線性回歸處理，得線性回歸方程：A=0.0318ρ+0.0017，其中r= 0.999 9(n=8)。結(jié)果表明，替格瑞洛在3.1240～24.992 μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗

取同一供試品溶液(批號20210907)，在 300 nm 波長處連續(xù)掃描6次，記錄吸光度，測得平均吸光度為0.497，RSD為0.08%(n=6)。結(jié)果表明，該儀器精密度良好，能較好滿足測試要求。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗

取本品(批號20210903)，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在ThermoEvolution 350紫外/可見分光光度計和Shimadazu UV-2600i紫外/可見分光光度計上，由不同分析人員測定吸光度。其中，在ThermoEvolution 350紫外/可見分光光度計上測得替格瑞洛分散片平均標示量為100.25%，A+2.2S為1.57。Shimadazu UV-2600i紫外/可見分光光度計上測得替格瑞洛分散片平均標示量為99.78%，A+2.2S為1.25。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 回收率試驗

1)對照品貯備液制備。取替格瑞洛對照品 1800 mg ，精密稱定，置 100 mL 量瓶中，制備成 18 mg/mL 的對照品貯備液。

2)供試品貯備液制備。取12個 200 mL 容量瓶(編號為1～12)，按制劑處方比例制備空白輔料，各加入空白輔料約 510 mg，分別精密量取對照品貯備液3.5、5.0、6.5、7.5 mL 分別加入1、2、3號樣品，4、5、6號樣品，7、8、9號樣品,10、11、12號樣品中，制備成70%、100%、130%、150%的供試品溶液，測定各溶液吸光度并計算回收率及其RSD，結(jié)果見表1。替格瑞洛的平均回收率為101.75%，RSD為0.92%(n=12)。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗

取本品(批號20210907)，按“2.1.2”項下供試品溶液配制方法，制備供試品溶液，室溫、避光下放置，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 測定吸光度。結(jié)果表明，樣品吸光度基本保持不變，RSD為0.25%(n=7)，樣品在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 替格瑞洛分散片含量均勻度的測定

取本品3批(批號：20210830、20210903、20210907)，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2”項下測定方法進行樣品含量均勻度測定。另參照《歐洲藥典》第10.4版[9]和《替格瑞洛片中國進口藥品注冊標準》[10]按高效液相色譜法(《中國藥典》2020年版四部通則0512[12])測定相同3批替格瑞洛分散片含量的均勻度。色譜條件為：以Agilent Zorbax SB-C18(150×φ4.6 mm，1.8 μm)為色譜柱；流動相：磷酸鹽緩沖液-乙腈(48∶52,體積比)；流速：1.2 mL/min；檢測波長：242 nm；柱溫：55 ℃，結(jié)果見表2。從表2可知：兩種方法測得不同批次替格瑞洛分散片含量均勻度均符合規(guī)定[12](A+2.2S≤15)，測定結(jié)果基本一致。本試驗建立的UV法與HPLC相比，測定結(jié)果無明顯差異，該方法準確可靠、易行。

3 討論

3.1 檢測波長和檢測濃度的選擇

鑒于采用紫外分光光度法測定樣品吸光度讀數(shù)，以0.3～0.7之間為宜，因此需將供試品溶液稀釋至一定質(zhì)量濃度，以保證準確測量[13]。本試驗前期對檢測濃度進行探索，最終選擇檢測質(zhì)量濃度是 15 μg/mL，其吸光度在0.5左右，符合朗伯-比爾定律。根據(jù)紫外吸收光譜掃描圖可知，替格瑞洛具有較強的紫外吸收，尤在222、256和 300 nm 波長處有最大吸收，其中空白溶劑和輔料在 300 nm 波長處無吸收干擾，故本試驗選擇 300 nm 作為最終檢測波長。

3.2 溶劑的選擇

替格瑞洛為生物藥劑學分類Ⅳ類藥物，即難溶性藥物，幾乎不溶于水。因此選擇在水中加入一定量的有機試劑乙腈，最終選擇乙腈-水(35∶65,體積比)作為溶劑，能較好溶解替格瑞洛。

3.3 UV法和HPLC法比較

本研究表明，UV法和HPLC法測得相同三批樣品的含量均勻度均符合要求，兩種方法測得結(jié)果基本一致。目前，現(xiàn)有質(zhì)量標準及相關(guān)文獻資料主要采用HPLC法測定其含量及含量均勻度[8-10]，該方法靈敏、專屬性較強[13]，但試驗耗時長，費用高，增加勞動和經(jīng)濟成本，這與仿制藥研究中經(jīng)濟性原則不相符[14]；同時，試驗中需使用大量對人體有害的有機試劑如乙腈、甲醇，不環(huán)保和不健康[11]。與HPLC法相比，本試驗所建立的UV法，快速、可節(jié)省試驗時間，成本低，檢測效率高，降低人力和物力成本，有其獨特優(yōu)勢。

3.4 替格瑞洛分散片含量及含量均勻度測定方法建議

本試驗對所建立的UV法測定替格瑞洛分散片含量均勻度進行方法學考察，所選檢測波長處，輔料無吸收干擾，專屬性高，線性關(guān)系和精密度均良好，回收率試驗RSD值較小。該方法操作簡單、快速、經(jīng)濟、準確度高、健康環(huán)保，能滿足藥物分析檢驗要求，可用于替格瑞洛分散片含量均勻度測定，同時可為該藥物的質(zhì)量分析研究提供一定科學依據(jù)。