賈妮娜，張銘林，丁伊曲，胡庭俊

（廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧 530005）

山豆根作為一種天然中藥，最初記載于《開寶本草》。2020版《中國藥典》中記載，山豆根具有清火解毒、消腫止痛等功效[1]。山豆根多糖（SSP）是山豆根的有效成分之一。研究表明，SSP可以增強機體免疫功能，具有抗炎、抗病毒和抗氧化等作用[2-3]。目前，已知豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）感染導致的機體免疫抑制可能是由病毒刺激機體產(chǎn)生炎性反應所致。因此，降低PCV2感染后產(chǎn)生的炎癥至關(guān)重要[4]。本試驗擬建立PCV2感染小鼠脾淋巴細胞的炎癥模型，利用SSP降低PCV2感染后導致的炎癥，探索合適的藥物濃度和作用時間，為后續(xù)抗PCV2的藥物開發(fā)提供思路。

實驗室前期觀察了不同濃度（25~1 600 mg/L）的SSP對小鼠脾淋巴細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)當SSP濃度低于400 mg/L時對小鼠脾淋巴細胞的活力無顯著影響；PCV2感染小鼠后，細胞活力顯著降低，并在48 h后顯著下降；而經(jīng)SSP處理后，細胞活性在12 h開始升高，且在72 h內(nèi)，隨著時間增加細胞活性也不斷升高?；诖?，本試驗選擇使用100、200和400 mg/L的SSP處理經(jīng)PCV2感染的小鼠脾淋巴細胞，并在8、12和24 h收取樣品檢測細胞中炎性因子的mRNA表達水平，探究SSP對PCV2感染小鼠脾淋巴細胞模型最佳給藥劑量和時間，為后續(xù)試驗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗藥品

SSP由廣西大學動物科學技術(shù)學院獸醫(yī)藥理與毒理學教研室制備，多糖中總糖含量為91.50%。

1.1.2 試驗動物

SPF級昆明種小鼠，4周齡，體重為（20±2）g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心。購入后適養(yǎng)3~7 d，期間飲水及采食自由。

1.1.3 主要試劑

胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；PBS（南京生航生物技術(shù)有限公司）；青、鏈霉素混合液及紅細胞裂解液（索萊寶試劑公司）；細胞篩（SORFA公司）、RNAiso Plus（Takara公 司）；All-In-One 5×RT MasterMix、BlasTaqTM2×qPCRMasterMix（abm公司）。

1.1.4 主要儀器

電子分析天平（Mettler Toledo公司）；Centrifuge 5418離心機（Eppendorf公司）；梯度PCR儀（BIO-RAD公司）；Roche LightCycler?96實時熒光定量PCR儀（Roche公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠脾淋巴細胞的制備

小鼠頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡2 min，取出小鼠置于無菌皿；超凈臺內(nèi)低溫取出脾臟，放入盛有預冷的適量PBS液的培養(yǎng)皿中清洗。

將脾臟放置于40μm細胞篩網(wǎng)上，PBS沖洗新鮮脾臟，采用5 mL注射器針芯研磨脾臟，培養(yǎng)皿收集篩網(wǎng)濾下的脾研磨液，并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。

加入紅細胞裂解液，置于冰上裂解15 min，期間每隔5 min輕搖一次；800 r/min離心5 min，棄除上清；加入PBS輕輕吹打混勻沉淀細胞，將細胞團塊吸出棄除，800 r/min離心5 min，棄除上清；再次加入PBS后800 r/min離心5 min，棄去上清；加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，經(jīng)40μm篩網(wǎng)過濾去除細胞團塊，懸浮沉淀細胞，收集細胞濾液。

1.2.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置細胞對照組、PCV2感染對照組、PCV2＋SSP100組（PCV2＋100 mg/L SSP）、PCV2＋SSP200組（PCV2＋200 mg/L SSP）、PCV2＋SSP400組（PCV2＋400 mg/L SSP）、SSP400組（400 mg/L SSP），共6組，每組3個重復。

將細胞濾液接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h后，6組均吸棄1.5 mL上清液，細胞對照組和SSP400組在細胞液中加入1 mL RPMI-1640培養(yǎng)基；PCV2感染對照組、PCV2＋SSP100組、PCV2＋SSP200組、PCV2＋SSP400組加入1 mL PCV2病毒液（感染劑量103TCID50）。于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育2 h。

PCV2＋SSP400組、SSP400組各組分別加入1.5 mL含800 mg/L SSP的10%FBS-RPMI-1640完全培養(yǎng)液；PCV2＋SSP100組、PCV2＋SSP200組各 組 分 別 加 入1.5 mL含200和400 mg/L SSP的10%FBS-RPMI-1640完全培養(yǎng)液；細胞對照組和PCV2感染對照組加入1.5 mL的10%FBS-RPMI-1640完全培養(yǎng)液。于37℃、5%CO2條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)8、12和24 h。試驗分組及處理見表1。

表1 試驗分組及處理Tab.1 Grouping and processing of experiment

1.2.3 樣品收集

從細胞培養(yǎng)箱中取出細胞培養(yǎng)板，輕輕挪至超凈臺上，保持液面靜止。將上層液體緩慢吸出，約留下1 mL，吸取剩余培養(yǎng)基輕輕吹打沉降在6孔板底部的細胞。將細胞連同剩余的培養(yǎng)基裝入RNase Free EP管中，1 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清；每管加入1 mL PBS吹散，再次1 500 r/min 4℃離心5 min，棄上清，加入1 mL的RNAiso Plus，反復吹吸，直至裂解液中無明顯沉淀，靜置5 min，轉(zhuǎn)移至-80℃保存。

1.2.4 總RNA提取及cDNA合成

將1.2.3中收集的樣品按RNAiso Plus試劑說明書進行提取。提取后采用超微量分光光度計對RNA的吸光度（OD值）進行檢測，OD260/280范圍在1.8~2.6之間視為RNA質(zhì)量合格。

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，配置1%瓊脂糖凝膠，每孔加入2.5μL RNA樣品和2.5μL 2×RNA Loading Buffer；電壓180 V，電流120 A，電泳12 min；使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，存在3條清晰、明亮的條帶，RNA可進行反轉(zhuǎn)錄。

檢測合格的RNA按照All-In-One 5×RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA于-20℃冷凍保存。

1.2.5 熒光定量PCR檢測炎癥因子相關(guān)基因表達

試驗中所用的mRNA引物由南寧捷尼斯生物科技有限公司設(shè)計與合成，引物序列見表2。

表2 mRNA特異性引物序列Tab.2 Primer sequenceof mRNA

Q-PCR反應體系（20μL）：BlasTaqTM2×qPCR MasterMix 10μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、cDNA模板1μL、ddH2O 8μL。

Q-PCR擴增條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸60 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95℃10 s，65℃60 s，97℃1 s；37℃冷卻30 s。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

以β-actin作為內(nèi)參基因，每個樣本設(shè)置兩個復孔，采用2-△△Ct法進行相對定量分析，并將細胞對照組中目的基因的表達水平設(shè)置為1。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染8 h后SSP對PCV2感染脾淋巴細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響（見表3）

表3 感染8 h后SSP對PCV2感染脾淋巴細胞炎癥因子mRNA表達水平Tab.3 Effect of SSPon expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytesat 8 h post PCV2-infection

由表3可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴細胞8 h后，PCV2感染對照組的各炎癥因子的表達水平與細胞對照組相比均有所下降，其中NF-κB、MCP-1和STAT1的表達水平與細胞對照組相比顯著下調(diào)（P<0.05）。

在給予不同濃度的SSP后，NF-κB、MCP-1和STAT1的表達水平仍有所下降；與PCV2感染對照組相比，各組STAT1的表達水平均顯著降低（P<0.05），SSP400組的NFκB表達水平顯著降低（P<0.05）。6個處理組CXCL10的表達水平差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 感染12 h后SSP對PCV2感染脾淋巴細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響（見表4）

由表4可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴細胞12 h后，PCV2感染對照組的各炎癥因子的表達水平與細胞對照組相比均顯著下降（P<0.05）。

表4 感染12 h后SSP對PCV2感染脾淋巴細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響Tab.4 Effect of SSPon expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 12 h post PCV2-infection

在給予不同濃度的SSP后，MCP-1、CXCL10、STAT1的表達水平均有所降低。與PCV2感染對照組相比，PCV2＋SSP400組、SSP400組NF-κB的表達水平顯著上升（P<0.05）；SSP400組MCP-1的表達水平顯著升高（P<0.05）。CXCL10的表達水平隨著SSP添加水平升高逐步降低，PCV2＋SSP200組和PCV2＋SSP400組的表達水平顯著低于PCV2感染對照組和細胞對照組（P<0.05）。STAT1的mRNA表達水平在經(jīng)SSP處理后先降低后升高，PCV2＋SSP200組和PCV2＋SSP400組的表達水平顯著低于PCV2感染對照組和細胞對照組（P<0.05）。

2.3 感染24 h后SSP對PCV2感染脾淋巴細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響（見表5）

由表5可知，在PCV2感染小鼠脾淋巴細胞24 h后，顯著升高了細胞內(nèi)NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1的mRNA表達水平（P<0.05），表明PCV2感染小鼠脾淋巴細胞的炎癥模型建立成功。

表5 感染24 h后山豆根多糖對PCV2感染脾淋巴細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響Tab.5 Effect of SSPon expression level of inflammatory factor in spleen lymphocytes at 24 h post PCV2-infection

經(jīng)過不同濃度的SSP處理后，各組炎癥因子的mRNA表達水平均有所降低。與PCV2感染對照組相比，小鼠脾淋巴細胞MCP-1的表達水平經(jīng)100、200和400 mg/L的SSP處理后均顯著降低（P<0.05）。NF-κB、CXCL10和STAT1表達水平經(jīng)100 mg/L的SSP處理后與PCV2感染對照組相比差異均不顯著（P>0.05）；經(jīng)200和400 mg/L的SSP處理后的小鼠脾淋巴細胞與PCV2感染對照組相比均顯著降低（P<0.05）。小鼠脾淋巴細胞感染PCV2后，NF-κB、MCP-1、CXCL10和STAT1等4種炎癥因子的表達水平在經(jīng)400 mg/L的SSP處理后與PCV2感染對照組相比均顯著降低（P<0.05）。

綜上所述，SSP對于炎癥因子mRNA表達水平呈現(xiàn)一定的劑量依賴，SSP的濃度越高，對于炎癥因子表達的抑制效果越明顯。

3 討論

豬圓環(huán)病毒（PCV）是一種單鏈、無囊膜的環(huán)狀DNA病毒，目前已發(fā)現(xiàn)4種基因型：PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[5-6]。其中PCV2的致病性最強，傳播也最為廣泛，由PCV2所引起的病癥被統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。╬orcine circovirus associated disease，PCVD）[7]，常與其他多種病原體混合感染[8]，加重臨床嚴重程度。目前對PCV2的治療僅停留于常規(guī)手段，防范手段也以疫苗免疫為主。但PCV2突變率極高，感染后會導致免疫抑制[9]，使疫苗失效。因此，養(yǎng)殖業(yè)需要一種新的手段防治PCV2。

多糖是一種從植物、藻類和動物等中分離出的天然高分子聚合物[10-11]。近年來，多糖的多種生物活性被不斷發(fā)掘，在安全、環(huán)保、無耐藥性的同時，多糖還具有調(diào)節(jié)機體免疫和代謝等功效。

此外，多糖還被證明具有抗炎和抗病毒等藥理作用[12]。黃賢能等[13]研究發(fā)現(xiàn)，柴胡多糖能夠降低LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥模型中一氧化氮（NO）的含量，起到抗炎的效果。鐘敏等[14]將正北芪多糖作用于結(jié)腸炎小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正北芪多糖能夠減少腸組織的潰瘍面積和炎性細胞浸潤，并且降低小鼠體內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子的含量，通過改善腸道黏膜屏障和減少炎癥因子釋放，進而緩解小鼠結(jié)腸炎的癥狀。劉丹華等[15]對黃芪多糖在LPS誘導的雞胚成纖維細胞系DF-1炎癥中的作用進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨使用黃芪多糖處理DF-1細胞能夠促進IL-1β和TNF-α的釋放，從而增強免疫功能；在給予LPS刺激后再使用黃芪多糖進行處理，結(jié)果顯示，黃芪多糖能夠通過抑制IL-1β和TNF-α的釋放起到抗炎的作用。馬升等[16]研究發(fā)現(xiàn)，金針菇多糖能增強RAW264.7細胞的吞噬能力，通過抑制NF-κB-NLRP3信號通路的激活抑制巨噬細胞炎癥反應。

本試驗中采用PCV2建立小鼠脾淋巴細胞的體外炎癥模型，在培養(yǎng)體系中分別加入100、200和400 mg/L的山豆根多糖繼續(xù)培養(yǎng)8、12和24 h；熒光定量PCR結(jié)果表明，當PCV2感染后24 h時，小鼠脾淋巴細胞內(nèi)NF-κB、CXCL10和STAT1的mRNA表達水平高于細胞對照組；3種不同濃度的山豆根多糖處理后均能夠降低炎性因子的表達水平，并隨著劑量的升高炎性因子的表達水平越低，其中以400 mg/L的SSP的效果最佳。結(jié)果表明，400 mg/L的山豆根多糖作用于PCV2感染的小鼠脾淋巴細胞24 h后能夠降低細胞內(nèi)炎癥因子的mRNA表達，起到抗炎的效果。

4 結(jié)論

本試驗使用熒光定量PCR法測定不同濃度的山豆根多糖對小鼠脾淋巴細胞體外感染PCV2后不同時間點的炎性因子分泌水平的影響。結(jié)果表明，400 mg/L山豆根多糖能夠降低PCV2感染小鼠脾淋巴細胞產(chǎn)生的炎癥因子mRNA表達。