楊向超，田由京，陳 禺，李 合 (海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普通外科，海南 ?？?570102)

胃癌屬于消化道腫瘤，在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和病死率[1]。手術(shù)切除是早期胃癌最有效的治療方法，然而，由于缺乏精確的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)，大部分患者診斷時(shí)已處于癌癥晚期[2-3]。在晚期胃癌的治療過(guò)程中，化療藥物耐藥性的產(chǎn)生導(dǎo)致患者預(yù)后差，病死率高[4]。越來(lái)越多的研究表明，參與介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥性發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜，因此，探究早期診斷的特異性生物標(biāo)志物以及克服腫瘤細(xì)胞耐藥性仍是胃癌研究中的兩大重點(diǎn)內(nèi)容。

MicroRNA(miRNA)是具有約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈RNA分子，是高度保守的非編碼RNA，能夠與目標(biāo)信使RNA(mRNA)的3’-UTR結(jié)合，從而抑制其表達(dá)和翻譯。miRNA現(xiàn)已用于癌癥或其他疾病的診斷研究中。miR-221已被證明與多種類型腫瘤相關(guān)，如Aslam等[5]研究表明，miR-221是結(jié)直腸癌的新型生物標(biāo)志物；Shah等[6]指出miR-221和miR-222參與了侵襲性細(xì)胞基底樣乳腺癌的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)高水平的miR-221和miR-222可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤(rùn)增加和預(yù)后不良。由此可見(jiàn)，miR-221可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的促癌作用。此外，有研究指出，miR-221能夠影響胃癌耐藥細(xì)胞增殖和化療敏感性[8]。但關(guān)于靶向下調(diào)miR-221介導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及其影響胃癌細(xì)胞化療敏感性的具體機(jī)制尚未明確。鑒于此，本研究通過(guò)檢測(cè)4種胃癌細(xì)胞系(SGC-7901、BGC-823、MGC803、MKN-28)中miR-221表達(dá)水平，并使用siRNA技術(shù)下調(diào)miR-221，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡及化療敏感性的影響，并初步探究其作用機(jī)制，以期為腫瘤的靶向治療及克服腫瘤細(xì)胞耐藥的研究提供新方案。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

將正常胃黏膜上皮細(xì)胞NGEC與4種胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823、MGC803、MKN-28[中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)(上海)細(xì)胞庫(kù)]加入RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

奧沙利鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司，TRIzol試劑盒和Lipofectamine 2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，JC-1熒光探針試劑盒購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，MTT試劑、Hoechst 33342染色試劑盒及Annexin Ⅴ-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海哈靈生物有限公司，BCA蛋白定量試劑盒和PVDF膜購(gòu)自上海碧云天生物研究所，兔抗人Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及P62單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和鼠抗人GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。miR-221 inhibitor、inhibitor control、siRNA-Parkin及siRNA-NC序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-221表達(dá)水平

采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop檢測(cè)儀測(cè)定提取的總RNA純度和濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成反轉(zhuǎn)錄序列，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒測(cè)定miR-221表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增程序設(shè)置為：95 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-221上游引物，5’-TCGTGGGAGCTACATTGTCTGC-3’，下游引物，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物，5’-AACGCTTCAGAAT TTGCGT-3’。擴(kuò)增結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-221相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-221組、Anti-miR-221+siRNA-NC組、Anti-miR-221+siRNA-Parkin組?？瞻讓?duì)照組進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，利用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體介導(dǎo)法將inhibitor control及miR-221 inhibitor分別轉(zhuǎn)染至Anti-miR-NC組和Anti-miR-221組細(xì)胞中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)轉(zhuǎn)染6 h，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果；Anti-miR-221+siRNA-NC組和Anti-miR-221+siRNA-Parkin組在轉(zhuǎn)染miR-221 inhibitor后分別轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照及siRNA-Parkin至細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性

將各組SGC-7901細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種至96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、12、24、48、72 h時(shí)每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的DMSO，置于搖床振蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚完全溶解，通過(guò)酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞的吸光度值(A值)。

1.5 JC-1熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位

將各組SGC-7901細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種至12孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，加入JC-1熒光探針工作液(1 μg/mL)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS重懸細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞熒光表達(dá)情況。

1.6 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平

利用RIPA裂解液提取各組SGC-7901細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)提取的蛋白濃度。取各組蛋白樣品50 μg上樣通過(guò)10% SDS-PAGE電泳(電壓90 V，時(shí)間20 min，后上調(diào)電壓至120 V，時(shí)間60 min)進(jìn)行分離，電轉(zhuǎn)移(電壓25 V，時(shí)間25 min)至PVDF膜，在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日棄一抗液，TBST洗膜，并加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)中曝光，Image J軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.7 Hoechst 33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平

收集各組SGC-7901細(xì)胞，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，滴加0.5%Triton X-100透化15 min，PBS洗滌細(xì)胞，滴加終濃度5 mg/L的Hoechst 33342染色，室溫避光孵育30 min，PBS再次洗滌細(xì)胞，脫水后封片干燥，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

用PBS洗滌各組SGC-7901細(xì)胞，以1 000 r/min 離心3 min，棄上清液，加入適量 1×binding buffer重懸，調(diào)節(jié)濃度為1×106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液并加入5 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育5 min，再加10 μL PI，混勻，繼續(xù)孵育10 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

1.8 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性

SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用不同濃度奧沙利鉑(2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)分別處理空白對(duì)照組、Anti-miR-NC組、Anti-miR-221組、Anti-miR-221+siRNA-NC組、Anti-miR-221+siRNA-Parkin組的SGC-7901細(xì)胞48 h，MTT法檢測(cè)各組SGC-7901細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)，使用SPSS 23.0軟件分析各組SGC-7901細(xì)胞IC50。藥物處理結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)孵育4 h，加入150 μL DMSO搖床振蕩至藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚完全溶解后，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞的A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常胃黏膜上皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞miR-221表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常胃黏膜上皮細(xì)胞NGEC比較，4種胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823、MGC803、MKN-28的miR-221相對(duì)表達(dá)水平明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。4種胃癌細(xì)胞系中SGC-7901的miR-221表達(dá)水平最高，因此選擇該細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞miR-221表達(dá)及活性變化

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SGC-7901細(xì)胞中miR-221表達(dá)，結(jié)果顯示，Anti-miR-221組SGC-7901細(xì)胞中miR-221表達(dá)水平較空白對(duì)照組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Anti-miR-NC組與空白對(duì)照組miR-221表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

MTT法結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)，Anti-miR-221組SGC-7901細(xì)胞活性較空白對(duì)照組下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Anti-miR-NC組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Anti-miR-221組比較，在轉(zhuǎn)染48 h和72 h時(shí)Anti-miR-221+siRNA-Parkin組細(xì)胞活性升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Anti-miR-221組與Anti-miR-221+siRNA-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

2.3 下調(diào)miR-221表達(dá)對(duì)Parkin介導(dǎo)胃癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1熒光探針檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，Anti-miR-221組SGC-7901細(xì)胞紅色熒光減弱而綠色熒光增加(P<0.05)，線粒體膜電位下降(P<0.05)；Anti-miR-NC組細(xì)胞紅色熒光和綠色熒光與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Anti-miR-221組比較，Anti-miR-221+siRNA-Parkin組紅色熒光增加(P<0.05)，綠色熒光有所減弱(P<0.05)，線粒體膜電位升高(P<0.05)，Anti-miR-221+siRNA-NC組細(xì)胞熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯變化，見(jiàn)圖4。

圖4 各組SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位(JC-1熒光探針，×100)

2.4 下調(diào)miR-221表達(dá)對(duì)Parkin介導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，Anti-miR-221組SGC-7901細(xì)胞Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平升高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上調(diào)，P62蛋白表達(dá)水平下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Anti-miR-NC組各蛋白表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Anti-miR-221組比較，Anti-miR-221+siRNA-Parkin組細(xì)胞Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)，P62蛋白表達(dá)水平升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Anti-miR-221+siRNA-NC組各蛋白表達(dá)水平與Anti-miR-221組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

1:空白對(duì)照組；2:Anti-miR-NC組；3:Anti-miR-221組；4:Anti-miR-221+siRNA-NC組；5:Anti-miR-221+siRNA-Parkin組 *：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與Anti-miR-221組比較，P<0.05

2.5 下調(diào)miR-221表達(dá)對(duì)Parkin介導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst 33342染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組和Anti-miR-NC組SGC-7901細(xì)胞胞核外圍輪廓較為清晰，大小一致，無(wú)明顯核濃縮現(xiàn)象；Anti-miR-221組和Anti-miR-221+siRNA-NC組細(xì)胞出現(xiàn)較多核濃縮、碎裂的藍(lán)色凋亡體，說(shuō)明凋亡細(xì)胞數(shù)目較多；而Anti-miR-221+siRNA-Parkin組細(xì)胞中核濃縮現(xiàn)象較Anti-miR-221組減少，說(shuō)明凋亡細(xì)胞數(shù)目減少，見(jiàn)圖6。

圖6 各組SGC-7901細(xì)胞凋亡情況(Hoechst 33342染色，×200)

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果顯示，Anti-miR-221組SGC-7901細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而Anti-miR-NC組細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Anti-miR-221+siRNA-Parkin組細(xì)胞凋亡率較Anti-miR-221組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Anti-miR-221+siRNA-NC組與Anti-miR-221組細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖7。

*：與空白對(duì)照組比較，P<0.05；#：與Anti-miR-221組比較，P<0.05

2.6 下調(diào)miR-221表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響

不同濃度奧沙利鉑(2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)處理各組SGC-7901細(xì)胞后，經(jīng)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞存活率均呈下降趨勢(shì)，IC50分別為8.14、8.07、4.79、4.74、7.23 μg/mL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白對(duì)照組比較，Anti-miR-221組細(xì)胞增殖抑制率升高，IC50下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Anti-miR-NC組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Anti-miR-221+siRNA-Parkin組的SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率較Anti-miR-221組有所下降，IC50較Anti-miR-221組升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Anti-miR-221+siRNA-NC組與Anti-miR-221組細(xì)胞增殖抑制率、IC50比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度奧沙利鉑對(duì)各組SGC-7901細(xì)胞的增殖抑制率(%)

3 討論

胃癌的發(fā)生過(guò)程十分復(fù)雜，涉及腫瘤相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)變化。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，對(duì)于不同類型的癌癥來(lái)說(shuō)其可能是非侵入性診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。以往研究表明，miRNA誘導(dǎo)的基因沉默與癌變之間的相互作用是胃癌研究中的熱點(diǎn)之一，胃癌中異常表達(dá)的miRNA在癌癥診治中具有重要價(jià)值[9]。目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA在胃癌患者組織或血液中存在異常表達(dá)，如胃癌患者血清中miR-21、miR-146a和miR-148a的水平與胃癌pN分期密切相關(guān)，這些miRNA水平可能是預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物[10]；miR-6778-5p通過(guò)靶向YWHAE來(lái)反饋調(diào)節(jié)宿主基因SHMT1的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞的干性，使腫瘤細(xì)胞維持惡性生物學(xué)特性[11]；miR-374-5p通過(guò)靶向SRCIN1和RECK基因來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12-13]。

本研究通過(guò)檢測(cè)正常胃黏膜上皮細(xì)胞NGEC和4種胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823、MGC803、MKN-28中miR-221表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-221在4種胃癌細(xì)胞系中均呈現(xiàn)異常高表達(dá)，因此推測(cè)miR-221可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。目前，關(guān)于miR-221在其他腫瘤中的作用研究逐漸增加，如Gramantieri等[14]研究發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌及復(fù)發(fā)的肝細(xì)胞癌患者中miRNA-221表達(dá)升高，揭示miRNA-221通過(guò)靶向Bmf參與肝細(xì)胞癌的發(fā)生，并與腫瘤大小、組織病理學(xué)分級(jí)、腫瘤多灶性等相關(guān)；Lu等[15]指出miR-221通過(guò)抑制腫瘤抑制因子TIMP2從而在腎癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中充當(dāng)致癌基因；Teixeira等[16]研究表明血漿樣本中miR-221的過(guò)表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者的總生存期縮短有關(guān)。由此可見(jiàn)，miR-221高表達(dá)可能促進(jìn)一些腫瘤的惡性進(jìn)展。胃癌作為惡性程度較高的腫瘤，一方面，由于缺乏典型的早期癥狀，大多數(shù)胃癌患者被診斷時(shí)已為晚期；另一方面，在治療過(guò)程中耐藥性的產(chǎn)生使得患者的治療效果降低，預(yù)后較差[2]。盡管目前已有大量研究分析了胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，但要確定用于胃癌檢測(cè)治療的特異性新靶標(biāo)并克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性仍然是一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。

大量研究表明，miRNA參與調(diào)控癌癥化療過(guò)程，這為克服胃癌細(xì)胞耐藥性提供了潛在的靶點(diǎn)。如miR-197和miR-130b分別通過(guò)靶向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3與Wnt/β-catenin途徑導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞產(chǎn)生順鉑耐藥性[17-18]，相反，miR-125a-5p能夠通過(guò)靶向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3減少其水平來(lái)逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌的順鉑耐藥性[19]；與鄰近正常組織相比，胰腺癌組織及胰腺癌順鉑耐藥細(xì)胞中的miR-374b-5p表達(dá)水平均降低，而miR-374b-5p通過(guò)直接靶向抗凋亡蛋白Bcl-2、BIRC3和XIAP增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)敏感性[20]。此外，已有研究表明miRNA-221參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的放射抗性[21]。奧沙利鉑是胃癌的一線化療藥物，與5-氟尿嘧啶聯(lián)合使用具有協(xié)同作用。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-221 inhibitor抑制胃癌細(xì)胞中miRNA-221表達(dá)后發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的化療敏感性增加，提示miRNA-221可能參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。

凋亡是受基因控制的自主而有序的細(xì)胞死亡過(guò)程，在生物體進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性以及多種系統(tǒng)的發(fā)展中均起著重要作用。凋亡途徑主要分為兩種，一種是細(xì)胞死亡受體介導(dǎo)的外源信號(hào)傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞死亡受體可以誘導(dǎo)Caspase-8和Caspase-10激活，鑒于一些Bcl-2家族成員蛋白觸發(fā)了與線粒體相關(guān)的內(nèi)在凋亡途徑，且隨后激活了Caspase-9和Caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；另一種是線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的內(nèi)源信號(hào)傳導(dǎo)途徑，隨著過(guò)度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、超載的自由基和Ca2+在雌激素受體管腔中產(chǎn)生并轉(zhuǎn)化為細(xì)胞質(zhì)和線粒體，使得線粒體受到這些超負(fù)荷壓力的干擾，觸發(fā)下游一系列反應(yīng)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22-23]。內(nèi)源性途徑可以由線粒體膜電位的喪失觸發(fā)，線粒體膜電位下降是細(xì)胞死亡的早期事件。當(dāng)線粒體受損時(shí)，蛋白激酶Pink1聚集于線粒體外膜同時(shí)激活Parkin，并將Parkin招募到受損線粒體上，通過(guò)一系列作用啟動(dòng)線粒體自噬途徑[24]。本研究結(jié)果顯示，在下調(diào)miRNA-221表達(dá)的胃癌細(xì)胞中檢測(cè)到線粒體膜電位下降，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。為了進(jìn)一步探討該作用的可能機(jī)制，本研究通過(guò)在下調(diào)miRNA-221的胃癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-Parkin抑制細(xì)胞線粒體自噬途徑后發(fā)現(xiàn)，Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下調(diào)，P62蛋白表達(dá)水平升高，同時(shí)，線粒體膜電位升高，抑制了細(xì)胞的凋亡，并且降低了胃癌細(xì)胞的化療敏感性。

綜上所述，miRNA-221參與調(diào)控Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬途徑，從而影響胃癌細(xì)胞的凋亡與化療敏感性，下調(diào)miRNA-221表達(dá)可激活Parkin介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞線粒體自噬途徑進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，增加胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的化療敏感性。這一結(jié)果提示，miRNA-221可能是胃癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，線粒體途徑可能是miRNA-221調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡與化療敏感性的途徑之一，這將有助于闡明胃癌的發(fā)病機(jī)制，并為克服胃癌化療耐藥性的研究提供參考。