馬曉惠，曹小青，管麗娜，李國(guó)棟，王一博

·藥材與資源?

黃草烏異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因的克隆與功能研究

馬曉惠*，曹小青，管麗娜，李國(guó)棟，王一博*

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 云南省南藥可持續(xù)利用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

對(duì)黃草烏的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI）基因進(jìn)行克隆及功能研究，為黃草烏中二萜生物堿的生物合成途徑解析奠定基礎(chǔ)。基于黃草烏的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選注釋為的基因，設(shè)計(jì)特異性引物克隆其編碼區(qū)，利用相關(guān)軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在黃草烏不同器官中的表達(dá)情況，在大腸桿菌中表達(dá)其重組蛋白，利用功能顯色驗(yàn)證其功能。從黃草烏中克隆得到1個(gè)基因（Genbank登錄號(hào)MZ814967）。生物信息學(xué)分析表明，的開放閱讀框（open reading frame，ORF）為897 bp，編碼298個(gè)氨基酸，分子式為C1516H2362N414O452S11，相對(duì)分子質(zhì)量為33 970，理論等電點(diǎn)為5.94，具有異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶TNTCCSHPL和WGEHELDY 2個(gè)保守序列。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，AvIDI與黃龍膽IDI的親緣關(guān)系最近。表達(dá)分析表明，基因在黃草烏根、莖、葉和花中均有表達(dá)，在莖中表達(dá)量最高。在大腸桿菌中成功表達(dá)了AvIDI重組蛋白，功能顯色實(shí)驗(yàn)表明，編碼有功能的IDI蛋白，能促進(jìn)大腸桿菌中番茄紅素的積累?？寺〉玫交?，并通過功能顯色實(shí)驗(yàn)證明其編碼有功能的IDI蛋白，該研究為利用基因調(diào)控黃草烏中二萜生物堿生物合成奠定了基礎(chǔ)。

黃草烏；異戊烯基焦磷酸酶；基因克??；生物信息學(xué)分析；功能顯色

黃草烏Kom.又被稱為藤草烏、昆明堵喇、昆明烏頭等，為毛茛科烏頭屬多年生草本植物[1]，其塊根作為藥材黃草烏入藥[2-3]，是云南白藥、云南紅藥等傷科藥的重要原料。黃草烏具有祛風(fēng)散寒、解毒消腫、活血止痛等功效[4]，其主要毒性成分和有效成分是二萜生物堿類成分[5-6]，二萜生物堿的生源合成途徑受到廣泛關(guān)注。二萜生物堿的氨基化過程發(fā)生在二萜環(huán)狀碳骨架形成后，其因氨基化過程較晚而被稱為假生物堿（pseudoalkaloids）[7]。根據(jù)二萜生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，科研工作者提出了其生源途徑：通過細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑和質(zhì)體中的2--甲基--赤藻糖醇-4-磷酸（2--methyl--erythritol- 4-phosphate，MEP）途徑合成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP），其在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IDI/IPI）的催化作用下和其異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP）進(jìn)行互相轉(zhuǎn)化，IPP和DMAPP在牻牛兒基焦磷酸合酶（geranyl diphosphate synthase，GPS）、法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）的作用下合成二萜前體牻牛兒牻牛兒焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP），GGPP在二萜合酶的作用下環(huán)化、重排形成二萜生物堿的基本環(huán)狀碳骨架結(jié)構(gòu)考烷（kaurane）和阿替烷（atisane），二者在氨基轉(zhuǎn)移酶及細(xì)胞色素P450等酶的作用下發(fā)生氨基化、氧化等反應(yīng)形成阿替生（atisines）型和維特欽型（veatchines）C20二萜生物堿，atisines和veatchines進(jìn)一步通過重排、脫氨基等反應(yīng)生成其他C20、C19和C18類二萜生物堿[7-9]。IDI通過調(diào)節(jié)IPP和DMAPP的穩(wěn)態(tài)比例影響二萜生物堿的生物合成，黃草烏中基因的克隆及功能研究對(duì)黃草烏中二萜生物堿的生物合成途徑研究具有重要意義。

本研究基于黃草烏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從黃草烏中克隆獲得1條基因，對(duì)其編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析其在黃草烏不同器官的表達(dá)情況，并在大腸桿菌中異源表達(dá)研究其功能，為今后利用基因調(diào)控黃草烏中二萜生物堿的生物合成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

植物樣品于2019年10月采自云南省玉溪市澄江縣梁王山，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李國(guó)棟副教授鑒定為黃草烏.Kom.。黃草烏沖洗干凈后經(jīng)液氮速凍后留樣保存于云南省道地瀕危中藥材繁育與栽培工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室?80 ℃冰箱。DH5α Chemically Competent Cell購(gòu)自翌圣生物科技（上海）有限公司；BL21（DE3）Chemically Competent Cell和1-Blue Chemically Competent Cell均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑

pCold GST DNA購(gòu)自寶生物工程有限公司；pTrc-和pAC-LYC由Francis X Cunningham Jr.Gantt（美國(guó)馬里蘭州學(xué)院馬里蘭大學(xué)）教授惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 總RNA提取及cDNA合成

采用Trizol法提取黃草烏根、莖、葉、花的總RNA，用超微量紫外可見分光光度計(jì)（DS-11，美國(guó)DENOVIXING）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real time）（TaKaRa公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA保存于?20 ℃冰箱。

2.2 基因克隆

從黃草烏轉(zhuǎn)錄組中共獲得1條注釋為基因的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)無縫克隆特異性引物pCold--F（5’-GGT- ACCCTCGAGGGATCCATGTCGACGATCGGATT-GAAC-3’）和pCold--R（5’-TCTAGACTG- CAGGTCGACTCAAGTCAATTTGTGGATTG-3’）。以黃草烏根cDNA為模板擴(kuò)增其全長(zhǎng)，PCR反應(yīng)體系（50 μL）：PrimeSTAR HS（Premix）25 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA 1 μL、雙蒸水（ddH2O）22 μL。反應(yīng)程序：94 ℃、5 min； 98 ℃、10 s，55 ℃、15 s，72 ℃、60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后純化，連入原核表達(dá)載體pCold GST DNA，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐青霉素（ampicillin，AMP）（100 mg/L）的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。從平板上挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，陽性結(jié)果送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒命名為pCold GST DNA-。

2.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI（National Center for Biotechnology Information）在線分析基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）和同源性；利用ExPASy-ProtParam tool （https://web.expasy.org/ protparam/）在線分析AvIDI蛋白的理化性質(zhì)；利用TMHMM 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）在線分析AvIDI蛋白的跨膜區(qū)；利用SignalP 5.0（https://services.healthtech.dtu.dk/ service.php?SignalP-5.0）分析信號(hào)肽；用WoLF PSORT （https://wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)AvIDI的亞細(xì)胞定位；使用InterPro（http://www.ebi.ac. uk/interpro /search/sequence-search）分析AvIDI的結(jié)構(gòu)域；使用SOMPA （https://npsa prabi. ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma. html）在線預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用SWISS- MODEL（http://swissmodel. expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用BioEdit軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)；利用NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫搜索同源序列，用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap為1000。

2.4 表達(dá)分析

根據(jù)序列設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物-qRT-F（5’-GCTTCTGGATGAACTGGGTA- TT-3’）和-qRT-R（5’-ATTTGACGTCGCGGA- CTATG-3’），以作為內(nèi)參基因[10]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在Roche LightCycler?96實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL、cDNA 2 μL、正向反向引物（10 μmol/L）各1 μL，雙蒸水（ddH2O）6 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、10 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，95 ℃、1 s。黃草烏根、莖、葉和花各設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。用LightCycler?96 SW以及SPSS軟件分析結(jié)果。的相對(duì)表達(dá)量用2?ΔΔCt法計(jì)算。

2.5 AvIDI重組蛋白表達(dá)

將重組質(zhì)粒pCold GST DNA-轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）Chemically Competent Cell，挑取單克隆于含AMP（100 mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r/min培養(yǎng)至吸光度（600）為0.6～1.0，加入異丙基-β--硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，于15 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)菌液15 h。離心收集菌體，加入PBS緩沖液復(fù)溶，用超聲波細(xì)胞破碎儀以5 s/8 s程序超聲破碎菌體至液體澄清，4 ℃離心收集上清和沉淀，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分析蛋白表達(dá)情況。以轉(zhuǎn)化pCold GST DNA的BL21（DE3）進(jìn)行隨行實(shí)驗(yàn)作為對(duì)照。

2.6 功能顯色

限制性核酸內(nèi)切酶I和H I酶切表達(dá)載體pTrc-，切膠回收獲得鏈狀pTrc載體；以重組質(zhì)粒pCold GST DNA-1為模板，用pTrc-AvIDI-F （5’-GGGGTACCATGTCGACGATC- GGATTGAA-3’）和pTrc-AvIDI-R （5’-CGGGAT- CCTCAAGTCAATTTGTGGATTGTT-3’）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后用I和H I酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4連接酶與鏈狀pTrc載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-Blue Chemically Competent Cell，于含AMP（100 mg/L）的LB平板37 ℃培養(yǎng)12～16 h，菌落PCR驗(yàn)證并送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pTrc-。將質(zhì)粒pTrc、pTrc-和pTrc-分別與pAC-LYC共轉(zhuǎn)化1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，于含AMP（100 mg/L）和氯霉素（chloramphenicol，Cm，20 mg/L）的LB平板37 ℃培養(yǎng)12～16 h。同時(shí)將pAC-LYC轉(zhuǎn)化1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，于含Cm（20 mg/L）的LB平板上培養(yǎng)。將菌落PCR驗(yàn)證正確的單克隆點(diǎn)于含AMP（100 mg/L）和Cm（20 mg/L）的LB平板上，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察菌斑的顏色變化。

3 結(jié)果與分析

3.1 AvIDI的基因克隆

以黃草烏根的cDNA為模板擴(kuò)增基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，在1000 bp附近有明亮的條帶（圖1），與黃草烏轉(zhuǎn)錄組中長(zhǎng)度一致，將PCR產(chǎn)物連入表達(dá)載體pCold GST DNA，獲得重組質(zhì)粒pCold GST DNA-，測(cè)序結(jié)果表明，的ORF為897 bp，編碼298個(gè)氨基酸。

3.2 生物信息學(xué)分析

3.2.1 理化性質(zhì)分析 AvIDI蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為33 970，理論等電點(diǎn)（pI）為5.94。跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，AvIDI蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，為非膜蛋白。信號(hào)肽分析表明，AvIDI蛋白無信號(hào)肽，為非分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，AvIDI蛋白定位于葉綠體上。結(jié)構(gòu)域分析表明（圖2），AvIDI含有NUDIX水解酶域（NUDIX hydrolase_dom，116～255 aa）和IPP異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)域（IsopentenylPP_isomerase_typ1，86～268 aa）。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，AvIDI蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占54.03%，延伸鏈占12.08%，β-轉(zhuǎn)角占5.37%，無規(guī)則卷曲占28.52%，AvIDI蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是α-螺旋和無規(guī)則卷曲。以人類IDI蛋白（2i6k.1.A）為模板（序列相似度為53.30%），用SWISS-MODEL模擬構(gòu)建AvIDI蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖3。3.2.2 多重序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析 NCBI在線blast分析表明，AvIDI蛋白與黃龍膽IDI蛋白相似度最高，相似度為91.06%。用BioEdit將AvIDI的氨基酸序列與其他物種已報(bào)道有功能的IDI氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，AvIDI具有IDI蛋白高度保守的TNTCCSHPL和WGEHELDY序列（圖4）。在NCBI中下載已報(bào)道的IDI蛋白序列，用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，AvIDI與植物IDI聚為一支，與黃龍膽的親緣關(guān)系最近（圖5）。

圖1 AvIDI的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 AvIDI功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖3 AvIDI蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

AtIDI-Arabidopsis thaliana IDI (NP197148.3) GlIDI-Gentiana lutea IDI (BAE92732.1) HpIDI-Hypericum perforatum IDI (JAW07394.1) OsIDI-Opuntia streptacantha IDI (MBM5471501.1) RmIDI-Rhizophora mucronate IDI (MBW95860.1) TwIDI-Tripterygium wilfordii IDI (ALB26774.1) CaIDI-Camptotheca acuminata IDI (ABI13583.1) SmIDI-Salvia miltiorrhiza IDI (ABV08818.1) GbIDI-Gossypium barbadense IDI (ABI94388.1) PvfIDI1-Panax vietnamensis var. fuscidiscus (MZ736417.1) PvfIDI2-Panax vietnamensis var. fuscidiscus (MZ736418.1)

3.3 AvIDI在黃草烏不同器官的表達(dá)分析

以為內(nèi)參基因分析在黃草烏根、莖、葉和花中的表達(dá)，結(jié)果如圖6所示，在黃草烏各個(gè)器官中均有表達(dá)，在莖中表達(dá)量最高，在根中表達(dá)量其次，在葉和花中表達(dá)量較低。

3.4 AvIDI重組蛋白表達(dá)

SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖7）顯示，含重組質(zhì)粒pCold GST DNA-的菌株在約60 000處有明顯蛋白條帶（融合蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為AvIDI理論相對(duì)分子質(zhì)量33 970與26 000的GST標(biāo)簽之和），與預(yù)期AvIDI融合蛋白大小一致，且上清和沉淀中均出現(xiàn)了明顯的條帶，說明在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)了。

3.5 功能顯色驗(yàn)證AvIDI功能

番茄紅素是一種天然紅色開鏈烴類胡蘿卜素，主要存在一些紅色果蔬中，大腸桿菌本身不能自身產(chǎn)生番茄紅素，由于pAC-LYC中含有3個(gè)參與番茄紅素合成的基因，即香葉基香葉基焦磷酸合成酶（）、八氫番茄紅素合成酶（）和八氫番茄紅素脫飽和酶（），轉(zhuǎn)化pAC-LYC的大腸桿菌可產(chǎn)生番茄紅素，菌斑顏色可以反映大腸桿菌中番茄紅素的產(chǎn)量，菌斑的顏色越深，番茄紅素的量越多[11-12]。將pTrc、pTrc-和pTrc-分別與質(zhì)粒pAC-LYC共轉(zhuǎn)化大腸桿菌1-blue。從圖8可知，僅轉(zhuǎn)化pAC-LYC的菌株（P2）在同時(shí)含有AMP和Cm的LB培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)，含有pTrc和pAC-LYC的菌株（P1）在同時(shí)含有AMP和Cm的LB培養(yǎng)基上能正常生長(zhǎng)并呈現(xiàn)淺粉色，說明其能產(chǎn)生少量番茄紅素，含有pAC-LYC及pTrc-和pTrc-的菌株（分別為At和Av）均能正常生長(zhǎng)，且其顏色較P1深，說明At和Av中產(chǎn)生的番茄紅素較P1多，由此表明，和編碼有功能的IDI蛋白，均可以促進(jìn)番茄紅素的生物合成。

圖5 IDI蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05）

Fig 6 Expression of AvIDI in different organs of

M-Marker TP-總蛋白 S-上清液 P-沉淀

圖8 AvIDI在大腸桿菌中的功能顯色

4 討論

烏頭屬含有多種藥用植物，二萜生物堿是黃草烏等多種烏頭屬植物的鎮(zhèn)痛活性成分，科研工作者構(gòu)建了烏頭屬異葉烏頭Pritz.[13-14]、烏頭Debeaux[15-18]和黃草烏[19]等多種植物的轉(zhuǎn)錄組，烏頭屬植物的轉(zhuǎn)錄組為二萜生物堿生物合成途徑研究提供了大量基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為二萜生物堿生物合成途徑中基因的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。然而，關(guān)于二萜生物堿生物合成途徑中相關(guān)基因的克隆及功能研究較少，Mao等[16]從烏頭中克隆并鑒定了12個(gè)二萜合酶，包括7個(gè)AcCPS和5個(gè)AcKSL，7個(gè)AcCPSs均催化GGPP生成ent-copalyl diphosphate（-CPP），而AcKSL催化ent-CPP分別生成-kaurene、-atiserene和-13-epi- sandaraco- pimaradie 3種產(chǎn)物，該研究推動(dòng)了二萜生物堿生物合成途徑的解析進(jìn)程。IPP和DMAPP是萜類化合物的重要前體，二者在IDI作用下進(jìn)行相互轉(zhuǎn)化，IDI通過調(diào)控IPP和DMAPP的比例及含量影響萜類及其衍生物的生物合成，因此基因的克隆及功能研究對(duì)萜類化合物的生物合成途徑研究及其應(yīng)用具有重要意義。目前，茶樹、煙草、擬南芥、雷公藤、丹參、海島棉和越南參等多種植物的基因已克隆獲得，并通過原核表達(dá)或RNAi等方法對(duì)其進(jìn)行功能研究[20-26]。其中，茶樹、擬南芥和越南參等植物中報(bào)道了2個(gè)基因[24-26]，而雷公藤和丹參等植物中僅報(bào)道了1個(gè)基因[20-21]。不同植物中的基因數(shù)量不完全一致，可能由于不同植物中本身存在的基因數(shù)量不一致，也可能與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序深度有關(guān)，目前很多基因的挖掘都依賴于轉(zhuǎn)錄組，而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的深度與基因的完整性密切相關(guān)，為了全面深入挖掘相關(guān)基因，可充分結(jié)合基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行相關(guān)工作。

黃草烏是云南特色藥用植物資源，二萜生物堿是其活性成分，為了研究黃草烏中二萜生物堿的生物合成途徑，本研究從黃草烏中克隆得到1條基因，對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，在大腸桿菌中成功表達(dá)AvIDI重組蛋白，并通過顯色反應(yīng)證明其編碼有功能的IDI蛋白，能促進(jìn)大腸桿菌中番茄紅素的積累。黃草烏中IDI基因的克隆及功能研究為利用IDI基因調(diào)控二萜生物堿的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

志謝：美國(guó)馬里蘭州學(xué)院馬里蘭大學(xué)Francis X Cunningham Jr. (Gantt) 教授惠贈(zèng)實(shí)驗(yàn)所用載體，首都醫(yī)科大學(xué)童宇茹博士對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 李雪佩, 何俊,賀水蓮, 等. 黃草烏植物的研究進(jìn)展 [J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2017, 46(6): 1-7.

[2] 重慶市中藥飲片炮制規(guī)范及標(biāo)準(zhǔn)（2006年版）[S]. 2006: 152.

[3] 云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)-第一冊(cè): 2005年版 [S]. 2005: 26.

[4] 王麗蘋, 陳強(qiáng)威, 沈志濱, 等. 黃草烏及其炮制品的毒性和鎮(zhèn)痛作用研究 [J]. 中藥材, 2018, 41(8): 1864-1868.

[5] 溫玉瑩, 王麗蘋, 沈志濱, 等. 黃草烏及其炮制品對(duì)心臟毒性的作用和機(jī)制研究 [J]. 中藥材, 2019, 42(6): 1277-1282.

[6] 黎雖宇, 劉小赟, 唐春萍, 等. 黃草烏炮制前后生物堿含量及心臟毒性差異研究[J]. 中草藥, 2018, 49(23): 5588-5593.

[7] Devkota K P, Sewald N. Terpenoid alkaloids derived by amination reaction [J]., 2013: 923-951.

[8] Cherney E C, Baran P S. Terpenoid-alkaloids: Their biosynthetic twist of fate and total synthesis [J]., 2011, 51(3/4): 391-405.

[9] 肖培根, 王鋒鵬, 高峰, 等. 中國(guó)烏頭屬植物藥用親緣學(xué)研究 [J]. 植物分類學(xué)報(bào), 2006, 44(1): 1-46.

[10] 曾禮芳, 李國(guó)棟, 王寶婕, 等. 黃草烏實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2021, 46(12): 3116-3122.

[11] Alonso-Gutierrez J, Chan R, Batth T S,. Metabolic engineering offor limonene and perillyl alcohol production [J]., 2013, 19: 33-41.

[12] Cunningham F X Jr, Sun Z, Chamovitz D,. Molecular structure and enzymatic function of lycopene cyclase from the cyanobacteriumsp strain PCC7942 [J]., 1994, 6(8): 1107-1121.

[13] Malhotra N, Kumar V, Sood H,. Multiple genes of mevalonate and non-mevalonate pathways contribute to high aconites content in an endangered medicinal herb,Wall [J]., 2014, 108: 26-34.

[14] Pal T, Malhotra N, Chanumolu S K,. Next-generation sequencing (NGS) transcriptomes reveal association of multiple genes and pathways contributing to secondary metabolites accumulation in tuberous roots ofWall [J]., 2015, 242(1): 239-258.

[15] Rai M, Rai A, Kawano N,. De novo RNA sequencing and expression analysis ofto analyze key genes involved in the biosynthesis of diterpene alkaloids [J]., 2017, 22(12): 2155.

[16] Mao L Y, Jin B L, Chen L L,. Functional identification of the terpene synthase family involved in diterpenoid alkaloids biosynthesis in[J]., 2021, 11(10): 3310-3321.

[17] Zhao D K, Shen Y, Shi Y N,. Probing the transcriptome ofreveals the candidate genes associated with the biosynthesis of the toxic aconitine-type C19-diterpenoid alkaloids [J]., 2018, 152: 113-124.

[18] 張大燕, 文歡, 王偉, 等. 烏頭萜類生物合成代謝的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(16): 45-50.

[19] Li Y G, Mou F J, Li K Z. De novo RNA sequencing and analysis reveal the putative genes involved in diterpenoid biosynthesis inroots [J]., 2021, 11(2): 96.

[20] Tong Y R, Zhang M, Su P,. Cloning and functional characterization of an isopentenyl diphosphate isomerase gene from[J]., 2016, 63(6): 863-869.

[21] Zhang X N, Guan H Y, Dai Z B,. Functional analysis of the isopentenyl diphosphate isomerase ofvia color complementation and RNA interference [J]., 2015, 20(11): 20206-20218.

[22] Wang Y C, Qiu C X, Zhang F,. Molecular cloning, expression profiling and functional analyses of a cDNA encoding isopentenyl diphosphate isomerase from[J]., 2009, 29(2): 111-119.

[23] Yan N, Zhang H B, Zhang Z F,. Organ- and growing stage-specific expression of solanesol biosynthesis genes inreveals their association with solanesol content [J]., 2016, 21(11): 1536.

[24] Phillips M A, D'Auria J C, Gershenzon J,. Thetype I isopentenyl diphosphate isomerases are targeted to multiple subcellular compartments and have overlapping functions in isoprenoid biosynthesis [J]., 2008, 20(3): 677-696.

[25] 陳丹, 王鵬杰, 陳笛, 等. 茶樹CsIDI1和CsIDI2基因的克隆及其表達(dá)分析 [J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2018, 38(5): 800-807.

[26] 王一博, 管麗娜, 曹小青, 等. 越南參變種異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶基因的克隆與功能研究 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2021, 56(12): 3362-3369.

Cloning and functional characterization of isopentenyl diphosphate isomerase gene from

MA Xiao-hui, CAO Xiao-qing, GUAN Li-na, LI Guo-dong, WANG Yi-bo

Yunnan Key Laboratory of Sustainable Utilization of Southern Medicine, College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

To clone and functionally study the isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) gene of, so as to lay a foundation for the analysis of the biosynthetic pathway of diterpene alkaloids in.The genes annotated aswere selected from the transcriptome data of. Specific primers were designed to clone the coding regions. Bioinformatics analysis was performed with relevant software. Real-time quantitative PCR was used to analyze their expression level in different organs of. The recombinant protein was expressed in, and its function was verified by functional coloration experiment.Angene (, Genbank accession No. MZ814967) was cloned from. Bioinformatics analysis showed that the open reading frame ofwere 897 bp encoding 298 amino acids. The molecular formula of AvIDI was C1516H2362N414O452S11. The molecular weight of AvIDI was 33 970 with a theoretical pI of 5.94. AvIDI contained two conserved sequences of TNTCCSHPL and WGEHELDY. Phylogenetic analysis showed that AvIDI was closely related toIDI. Expression analysis showed thatexpressed in root, stem, leaf and flower of, with highly expression in the stem. The recombinant protein of AvIDI was successfully expressed in. The functional coloration experiment inshowed thatencoded a functional IDI protein and promoted the accumulation of lycopene.Thewas cloned and proven to encode a functional IDI protein. This study laid a foundation for the regulation of diterpenoid alkaloids biosynthesis inwithgene.

Kom.; isopentenyl diphosphate isomerase; gene cloning; bioinformatics analysis; functional coloration

R282.12

A

0253 - 2670(2022)16 - 5142 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.023

2022-02-09

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）；云南省科技人才和平臺(tái)計(jì)劃（202105AG070012）

馬曉惠，講師，從事分子生藥學(xué)研究。E-mail: maxiaohui1988@126.com

王一博，碩士，從事分子生藥學(xué)研究。E-mail: 2498927287@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]