梁澤華，潘穎潔，邱麗媛，吳鑫雨，徐曉強，舒月文，袁 強*

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析黃精九蒸九曬炮制過程中化學(xué)成分的變化

梁澤華1，潘穎潔1，邱麗媛1，吳鑫雨1，徐曉強2，舒月文2，袁 強1*

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311400 2. 浙江棗椿堂農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 龍游 324400

應(yīng)用固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS），對黃精九蒸九曬炮制過程中的化學(xué)成分進行分析鑒定。采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈-0.1%甲酸水作為流動相梯度洗脫，體積流量0.3 mL/min，在電噴霧負離子模式下進行檢測，四級桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜對各主要色譜峰進行歸屬。根據(jù)所獲得的精確相對分子質(zhì)量，同時結(jié)合色譜保留行為、質(zhì)譜裂解規(guī)律、特征碎片離子、對照品比對以及相關(guān)文獻報道，共鑒定炮制前后黃精中的61個化學(xué)成分，包括16個甾體皂苷類成分、12個黃酮類成分、5個木脂素類成分、1個香豆素類成分、3個生物堿類成分、4個脂肪酸類成分、3個氨基酸類成分、2個糖類成分、4個酯類成分、1個醛類成分、1個有機酸類成分及9個未知成分。炮制對黃精中的化學(xué)成分影響很大，隨著炮制時間的增加如成分異構(gòu)化、原生苷種類以及含量減少、苷元含量的增加等。九蒸九曬黃精增效作用炮制或許與其化學(xué)成分變化有關(guān)，為黃精九蒸九曬炮制機制的研究提供理論依據(jù)，為黃精的進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

黃精；UPLC-Q-TOF-MS；九蒸九曬；炮制；成分變化；薯蕷皂苷元；黃精皂苷A

黃精為百合科植物滇黃精Coll. et Hemsl.、黃精Red.或多花黃精Hua的干燥根莖，味甘、性平，入脾、腎、肺經(jīng)，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎的功效[1]。作為藥食兩用的補益圣品，自古以來，黃精就被我國古代的佛家、道家、儒家、養(yǎng)生學(xué)家和醫(yī)藥學(xué)家所重視[2]，認為其為“服食要藥”。傳統(tǒng)中醫(yī)臨床常用于治療治療燥咳、腎精虧虛、腰膝酸軟[3]以及脾胃虛弱之癥，顯滋補強身之能。而現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃精具有降血糖[4]、調(diào)血脂[5-6]、降血壓[7]、抗腫瘤[8]、抗疲勞[3]等藥理作用。作為傳統(tǒng)補益藥，黃精用藥歷史悠久，常常以單味藥口服使用以達到補益之效。然而，生黃精口服具有咽喉刺激性及麻舌感，不利于服用，因此黃精常以炮制品入藥，炮制之后普遍被認為是刺激性成分的黃精粘液質(zhì)明顯降低[9]，有利于患者的服用。古法炮制黃精包括清蒸、酒蒸、九蒸九曬、酒燉合蒸、黑豆制、熟地汁制等，其中以九蒸九曬最為知名。經(jīng)過九蒸九曬后，黃精化學(xué)成分發(fā)生變化[10-11]，補益作用增強，咽喉刺激性消失，《本草綱目》中就有“單服九蒸九曝食之，駐顏斷谷，補諸虛，止寒熱，填精髓，下三尸蟲”的記載?？梢娋胖泣S精之盛名。黃精九制標(biāo)準(zhǔn)為色黑、味甜、滋潤[12]。隨著蒸曬次數(shù)的增加，黃精性狀發(fā)生變化的同時，化學(xué)成分也發(fā)生了變化。但是目前全面反映黃精蒸曬過程中化學(xué)成分變化方面的研究鮮有報道。

本實驗以黃精作為研究對象，采用固相萃取結(jié)合超高效液相色譜-電噴霧四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對黃精九蒸九曬炮制過程中的化學(xué)成分進行分析鑒定以期對黃精九蒸九曬過程中化學(xué)成分變化進行探究，為黃精九蒸九曬炮制機制的深入研究提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥材

黃精藥材產(chǎn)地為浙江龍游，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)黃真教授鑒定為百合科植物多花黃精Hua的干燥根莖。

1.2 試劑

色譜級甲醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、色譜級乙腈（華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司）、色譜級甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、超純水。5-羥甲基糠醛（北京華威銳科化工有限公司）、薯蕷皂苷元（南京草本源生物科技有限公司），以上對照品質(zhì)量分數(shù)大于98%。

1.3 儀器

SYNAPT G2-Si高分辨四級飛行時間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀（美國沃特世公司），RE52-99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、150T多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）、KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 黃精炮制品的制備

2.1.1 生黃精 除去雜質(zhì)，洗凈，略潤，切厚片，干燥。

2.1.2 黃精不同蒸曬時間炮制品 取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，將適量黃酒與凈選好的生品黃精攪拌均勻，并悶潤至黃酒被藥材吸盡（每100 kg黃精，用黃酒20 kg）。要求第1次蒸制10 h至黃精中央發(fā)虛（蒸制操作時，要把蒸制過程中流出的汁液進行收集），放在太陽下曬8 h至藥材外皮微干，之后將上一步的成品拌入收集的汁液和一定量的黃酒，并“悶潤至輔料被藥材吸盡”，再進行反復(fù)蒸曬，按第1回蒸制、干燥方法，再蒸10 h，再放到太陽下曬8 h至藥材表面微干，再拌入上一步收集的汁液，一定量的黃酒，依照此方法連續(xù)操作，根據(jù)實驗需求分別蒸曬1、3、5、7和9次，分別得到一蒸一曬黃精、三蒸三曬黃精、五蒸五曬黃精、七蒸七曬黃精和九蒸九曬黃精。

蒸曬過程中除去首末2次蒸制，其余蒸制所需酒的量為總體的70%。最后1次蒸制、曬干，將其余（20%）酒及收集的汁液拌入藥材中，蒸至表面黑漆色，表面發(fā)亮。

2.1.3 酒黃精 取凈黃精，加黃酒拌勻，置蒸制容器內(nèi)，蒸30 h至蒸透，色澤黑潤，口嘗無麻舌感時，取出，稍晾，切厚片。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 分別精密稱取對照品薯蕷皂苷元1.7 mg、5-羥甲基糠醛2.0 mg，置于500 mL量瓶中，加甲醇溶解并至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得到薯蕷皂苷元3.476 4 mg/L、5-羥甲基糠醛3.974 0 mg/L混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 按照“2.1”項方法炮制得到黃精生品、酒黃精、一蒸一曬、三蒸三曬、五蒸五曬、七蒸七曬、九蒸九曬黃精炮制品，精密稱定黃精粉末（過四號篩）4 g，加入70%乙醇100 mL，超聲提取30 min，提取2次，合并濾液，減壓濃縮至干，用70%甲醇復(fù)溶，通用型親水親脂平衡（PSL）固相萃取小柱，用20 mL甲醇活化，20 mL超純水洗滌，將5 mL樣品溶液倒入固相萃取小柱中，用20 mL超純水淋洗，用40 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，用70%甲醇復(fù)溶并定容至25 mL，12 000 r/min離心取上清液。0.22 μm濾膜濾過后得到供試品溶液，4 ℃冰箱保存。

2.3 UPLC液相色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，采用二元梯度洗脫：0～8 min，5%～21% A；8～17 min，21%～22% A；17～20 min，22%～40% A；20～30 min，40%～45% A；30～40 min，45%～73% A；40～45 min，73%～100% A；45～50 min，100%～5% A；50～55 min，5% A。體積流量0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量0.5 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

ESI源負離子模式檢測。質(zhì)譜參數(shù)：毛細管電壓3.00 kV，樣品錐孔電壓40 V，源偏移電壓80 V，源溫120 ℃，脫溶劑溫度450 ℃，錐孔氣50 L/h，脫溶劑氣體積流量800 L/h，霧化氣壓力600 kPa；掃描范圍/50～1500。

2.5 黃精化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫建立

從ScienceDirect、Web of Science、CNKI、TCMSP等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫收集黃精屬植物各種化學(xué)成分及名稱。通過Masslynx V4.1軟件Molecular Weight Calculator工具根據(jù)各成分分子式計算相對分子質(zhì)量。建立包括化合物名稱、分子式、相對分子質(zhì)量、[M－H]?、[2M－H]?、和[M－H＋HCOOH]?等信息的化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。

2.6 質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理

使用Masslynx V4.1軟件比較黃精九蒸九曬過程炮制過程成分變化，對比黃精化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫共鑒定炮制前后黃精中的61個化學(xué)成分，包括16個甾體皂苷類成分、12個黃酮類成分、5個木脂素類成分、1個香豆素類成分、3個生物堿類成分、4個脂肪酸類成分、3個氨基酸類成分、2個糖類成分、4個酯類成分、1個醛類成分、1個有機酸類成分及9個未知成分，具體見表1。

表1 UPLC-Q-TOP-MS對黃精九制過程中成分變化的鑒定分析

Table 1 UPLC-Q-TOP-MS identification and analysis of component changes in Polygonati Rhizoma during preparation

序號tR/min離子模式質(zhì)量數(shù)(m/z)分子式裂解碎片鑒定成分歸屬 10.781[M－H]?142.049 7C6H9NO3127 [M－H－CH3]?L-焦谷氨酸甲酯[13]或異構(gòu)體1～3 20.810[M－H]?341.109 3C12H22O11161 [M－H－H2O－Glc]?, 179 [M－H－Glc]?, 310 [M－H－CH2OH]?麥芽糖[14]或異構(gòu)體1～7 30.820[M－H]?179.060 1C6H12O6161 [M－H－H2O]?葡萄糖[14]或異構(gòu)體1～7 41.080[M－H]?128.037 2C5H7NO3110 [M－H－H2O]?L-焦谷氨酸[15]或異構(gòu)體1～7 5*1.891[M－H]?125.024 8C6H6O3108 [M－H－OH]?5-羥甲基糠醛[15] 或異構(gòu)體2～6 62.062[M－H]?164.071 2C9H12NO2134 [M－H－CH2OH]?, 146 [M－H－H2O]?polygonatine A[15] 或異構(gòu)體1～4 73.370[M－H]?203.082 8C11H12N2O2158 [M－H－COOH]?, 186 [M－H－NH2]?L-色氨酸[16]或異構(gòu)體1～4 83.470[M－H]?193.049 5C10H10O4149 [M－H－CO2]?, 178 [M－H－CH3]?silvaticol[15]或異構(gòu)體1～5 93.500[M－H]?417.154 6C22H26O8399 [M－H－H2O]?, 402 [M－H－CH3]?(?)-丁香樹脂酚[17]或異構(gòu)體1～3 104.586[M－H]?125.024 8C6H6O3108 [M－H－OH]?未知16,7 115.333[M－H]?164.075 2C9H12NO2134 [M－H－CH2OH]?, 146 [M－H－H2O]?未知25～7 126.138[M－H]?563.141 6C26H28O14299 [M－H－2Xyl]?, 431 [M－H－Xyl]?, 545 [M－H－H2O]?牡荊素2"-O-葡萄糖苷[18]或異構(gòu)體1～5 136.536[M－H]?233.047 0C12H10O5158 [M－H－C2H4O2－CH3]?, 173 [M－H－C2H4O2]?7-(羧基甲氧基)-4-甲基香豆素[19]或異構(gòu)體2～7 146.578[M－H]?593.150 3C27H30O15269 [M－H－2Glc]?, 431 [M－H－Glc]?, 575 [M－H－H2O]?異肥皂草苷[20]或異構(gòu)體1～3 156.940 [M－H]?193.053 1C10H10O4149 [M－H－CO2]?, 178 [M－H－CH3]?阿魏酸[15]或異構(gòu)體5～7 167.168 [M－H]?233.047 0 C12H10O5158 [M－H－C2H4O2－CH3]?, 173 [M－H－C2H4O2]?未知35～7 177.420[M－H]?681.243 2C32H42O16519 [M－H－Glc]?, 663 [M－H－H2O]?(+)-松脂素-Ο-β-D-吡喃葡萄糖基 (1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷[20]或異構(gòu)體1～5

續(xù)表1

序號tR/min離子模式質(zhì)量數(shù)(m/z)分子式裂解碎片鑒定成分歸屬 187.560[M－H]?193.053 1C10H10O4149 [M－H－CO2]?, 178 [M－H－CH3]?鄰苯二甲酸二甲酯[15]或異構(gòu)體6,7 197.703[M－H]?741.268 0 C34H46O18417 [M－H－2Glc]?, 727 [M－H－CH2]?丁香樹脂醇雙苷[20]或異構(gòu)體1～4 208.630[M－H＋HCOOH]?1 255.556 3 C56H90O28751 [M＋HCOOH－H－H2O－2Glc－Gal]?, 769 [M＋HCOOH－H－2Glc－Gal]?, 931 [M＋HCOOH－H－Glc－Gal]?, 1093 [M＋HCOOH－H－Glc]?26-三醇-3-O-β-石蒜四糖苷[21]或異構(gòu)體1～6 218.750[M－H]?417.154 6C22H26O8399 [M－H－H2O]?, 402 [M－H－CH3]?(+)-丁香脂素[17]或異構(gòu)體4 228.755[M－H]?579.209 8 C28H36O13417 [M－H－Glc]?, 561 [M－H－H2O]?(?)-丁香樹脂酚-O-β-D-葡萄糖苷[20]或異構(gòu)體1～4 238.918[M－H]?1 225.583 4C56H94O28589 [M－H－Xyl－2Glc－Gal－H2O]?, 607 [M－H－Xyl－2Glc－Gal]?, 751 [M－H－Xyl－2Glc－H2O]?, 769 [M－H－Xyl－2Glc]?, 931 [M－H－Xyl－Glc]?, 1093 [M－H－Xyl]?西伯利亞蓼苷A[21]或異構(gòu)體1～4 249.040[M－H]?1 063.500 0 C50H80O24901 [M－H－Gal]?, 1045 [M－H－H2O]?西伯利亞蓼苷B[21]或異構(gòu)體1～4 259.440[M－H＋HCOOH]?1 255.556 3 C56H90O28751 [M＋HCOOH－H－H2O－2Glc－Gal]?, 769 [M＋HCOOH－H－2Glc－Gal]?, 931 [M＋HCOOH－H－Glc－Gal]?, 1093 [M＋HCOOH－H－Glc]?未知45 2610.640[M－H]?282.117 8 C17H17NO3264 [M－H－H2O]?, 268 [M－H－CH2]?N-反式香豆酰酪胺[17]或異構(gòu)體1～7 2710.960[M－H＋ HCOOH]?1 255.561 3 C56H90O28751 [M＋HCOOH－H－H2O－2Glc－Gal]?, 769 [M＋HCOOH－H－2Glc－Gal]?, 931 [M＋HCOOH－H－Glc－Gal]?, 1093 [M＋HCOOH－H－Glc]?未知55 2811.408[M－H]?312.124 6C18H19NO4191 [M－H－C8H9O]?, 297 [M－H－CH3]?N-反式阿魏酸酪酰胺[20]或異構(gòu)體1～7 2911.877[M－H]?299.097 4C17H16O5263 [M－H－2H2O]?, 281 [M－H－H2O]?6-甲基-4',5,7-三羥基-高異黃烷酮[22]或異構(gòu)體4～6 3012.148[M－H]?445.117 3C22H22O10323 [M－H－Glc]?, 427 [M－H－H2O]?4′-去甲基亮氨酸7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷[22]或異構(gòu)體1～3 3112.680[M－H＋ HCOOH]?1 255.561 5 C56H90O28751 [M＋HCOOH－H－H2O－2Glc－Gal]?, 769 [M＋HCOOH－H－2Glc－Gal]?, 931 [M＋HCOOH－H－Glc－Gal]?, 1093 [M＋HCOOH－H－Glc]?未知6 5 3212.855[M－H]?233.047 0 C12H10O5158 [M－H－C2H4O2－CH3]?, 173 [M－H－C2H4O2]?未知7 5～7 3315.405[M－H]?1 241.582 0 C57H94O29755 [M－H－3Glc]?, 917 [M－H－2Glc]?, 1061 [M－H－Glc－H2O]?, 1079 [M－H－Glc]?黃精呋甾醇苷[20]或異構(gòu)體1～3 3415.747[M－H]?301.071 4C16H14O6256 [M－H－CO－H2O]?, 283 [M－H－H2O]?disporopsin[20]或異構(gòu)體1 3519.667[M－H]?1 241.581 9 C57H94O29755 [M－H－3Glc]?, 917 [M－H－2Glc]?, 1061 [M－H－Glc－H2O]?, 1079 [M－H－Glc]?未知8 4,5 3620.444[M－H]?1 061.552 5C52H86O22575 [M－H－2Glc－Man]?, 737 [M－H－2Glc]?, 899 [M－H－Glc]?, 1 043 [M－H－H2O]?甲基原薯蕷皂苷[23]或異構(gòu)體1～5 3720.833[M－H]?329.232 5C18H34O5311 [M－H－H2O]?, 315 [M－H－CH2]?, 284 [M－H－COOH]?天師酸[16]或異構(gòu)體1～7 3821.402[M－H]?299.091 9C17H16O5193 [M－H－CH2－B]?, 281 [M－H－H2O]?5,7-二羥基-8-甲基-3-(4-羥基芐基)-鉻酸鹽-4-酮[22]或異構(gòu)體1～7 3921.594[M－H]?315.087 6C17H16O6279 [M－H－2H2O]?, 297 [M－H－H2O]?玉竹皂苷B[22]或異構(gòu)體1

續(xù)表1

1-黃精生品 2-黃精酒炙品 3-黃精一蒸一曬品 4-黃精三蒸三曬品 5-黃精五蒸五曬品 6-黃精七蒸七曬品 7-黃精九蒸九曬品 “*”與對照品對比鑒定 Glc-葡萄糖 Gal-半乳糖 Xyl-木糖 Man-甘露糖 Ara-阿拉伯糖 B-黃酮B環(huán) E、F-甾體皂苷的E、F

1-crude2-roastedwine 3-one steaming and one drying4-three steaming and three drying5-five steaming and five drying6-seven steaming and seven drying7-nine steaming and nine drying“*” compared with the standard Glc-glucose Gal-galactose Xyl-xylose Man-mannose Ara-arabinose B-flavone B ring E, F-steroidal saponins E,F

3 結(jié)果與討論

根據(jù)圖1可見，無論是酒制還是蒸曬炮制，對黃精化學(xué)成分均具有較大的影響。

而本實驗以負離子模式進行成分檢測，從實驗結(jié)果看，除了峰20、25、27、31以[M－H－HCOOH]?峰存在外，其余各峰主要以[M－H]?峰的形式存在。

A-生品黃精 B-酒黃精 C-一蒸一曬黃精 D-三蒸三曬黃精 E-五蒸五曬黃精 F-七蒸七曬黃精 G-九蒸九曬黃精

3.1 甾體皂苷類成分鑒定

甾體皂苷是黃精屬植物的主要次生代謝產(chǎn)物和活性成分，甾體皂苷類成分作為黃精主要有效成分，具有抗抑郁、抗HIV、抗菌、調(diào)節(jié)血糖、抗癡呆、改善學(xué)習(xí)記憶障礙、抗腫瘤等藥理作用[26]。黃精C-27甾體皂苷分為呋喃甾烷型皂苷（如黃精皂苷A）和螺旋甾烷型皂苷（如黃精皂苷B）2類[26]，而具有環(huán)戊烷駢多氫菲的基本母核甾體皂苷元共有A、B、C、D、E、F 6個環(huán)，E環(huán)和F環(huán)以螺縮酮形式聯(lián)接，稱為螺甾烷型。見圖2。

圖2 黃精C-27甾體皂苷母核

本實驗共鑒定得到16個甾體皂苷類成分。黃精甾體皂苷類成分多樣[27]，質(zhì)譜鑒定一般依據(jù)連接糖基的數(shù)量和種類。而天然甾體皂苷類C-3的羥基易脫去形成失去1個水分子的碎片離子，以峰23為例解釋黃精甾體皂苷類成分的裂解規(guī)律，如圖3所示。峰23的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/1 225.583 4，推測最有可能的分子式為C56H94O28，在其ESI-MS/MS譜中，[M－H]?離子產(chǎn)生碎片離子/1093 [M－H－Xyl]?和1063 [M－H－Glc]?，后續(xù)分別失去1個葡萄糖和1個木糖得到碎片離子/931 [M－H－Xyl－Glc]?，在丟失1個葡萄糖得到碎片離子/769 [M－H－Xyl－2Glc]?，進一步失去1個半乳糖得到碎片離子/607 [M－H－Xyl－2Glc－Gla]?，失去糖基后C-3位的羥基脫水產(chǎn)生碎片/589 [M－H－Xyl－2Glc－Gal－H2O]?，而呋喃甾烷型皂苷C-26位糖基脫去后，F(xiàn)環(huán)羥基脫水形成碎片離子751 [M－H－Xyl－2Glc－H2O]?，表明其在質(zhì)譜中失去1個木糖和2個葡萄糖，由此將峰23鑒定為西伯利亞蓼苷A[28]。

同時，本實驗在保留時間36.300 min時檢測出薯蕷皂苷元，主要存在于三蒸三曬、五蒸去曬、七蒸七曬、九蒸九曬黃精炮制品中，隨著炮制時間的增加含量逐漸升高。質(zhì)譜中峰52的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/413.297 6，推斷最可能的分子式為C27H42O3，在ESI-MS/MS譜中，得到碎片離子峰/395 [M－H－H2O]?、/269 [M－H－EF]?和/251 [M－H－EF－H2O]?，結(jié)合對照品對比和參考文獻，將峰52準(zhǔn)確鑒定為薯蕷皂苷元。

3.2 黃酮類成分鑒定

黃酮類成分是黃精的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化等多種功效[29]，而高異黃酮類是該屬植物中的1個特征性成分，天然高異黃酮裂解過程失去B環(huán)和1個甲基，形成A環(huán)和C環(huán)碎片離子。以峰42解釋黃精高異黃酮裂解規(guī)律（圖4），峰42的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/313.107 7，推測其最有可能的分子式為C18H18O5，在其ESI-MS/MS譜中，[M－H]?離子一方面脫水產(chǎn)生碎片離子/295 [M－H－H2O]?，另一方面脫去1個甲基和B環(huán)形成碎片離子/207 [M－H－CH2－B]??；诖?，推斷峰42為高異黃酮類成分6,8-二甲基-4′,5,7-三羥基高異黃烷酮[22]。

而黃酮苷類成分的推測主要依據(jù)連接糖基的數(shù)量與種類，峰12的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/563.141 6，推測其最有可能的分子式為C26H28O14，在其ESI-MS/MS譜中，分子離子峰[M－H]?產(chǎn)生碎片離子/545 [M－H－H2O]?、/431 [M－H－Xyl]?及/299 [M－H－2Xyl]?，推測其發(fā)生脫水、脫糖基。因此將峰12鑒定為黃酮苷類成分牡荊素- 2″--木糖苷[18]。

3.3 木脂素類成分鑒定

本實驗?zāi)局仡惓煞种饕ㄟ^連接糖基的種類進行鑒別，如峰17的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/681.243 2，推測其最有可能的分子式為C32H42O16，在其ESI-MS/MS譜中，準(zhǔn)分子離子峰生成碎片離子/519 [M－H－Glc]?和/663 [M－H－H2O]?，猜測分別丟失1個葡萄糖和1個水分子。由此鑒定峰34為 (?)-松脂素--β--吡喃葡萄糖基 (1→6)-β--吡喃葡萄糖苷[30]。峰22的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/579.209 8，推測其最可能的分子式為C28H36O13，在其ESI-MS/MS譜中，峰22準(zhǔn)分子離子峰丟失1個水分子產(chǎn)生碎片離子/561 [M－H－H2O]?，脫去1個糖基生成/417 [M－H－Glc]?。由此鑒定該化合物為(?)-丁香樹脂酚--β--葡萄糖苷[30]。

3.4 其他成分的鑒定

其他各類成分以特征性結(jié)構(gòu)進行成分鑒別，如酯類成分中的酯基、有機酸中的羧基。

峰8的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/193.053 1，推測其最有可能的分子式為C10H10O4，在其ESI-MS/MS譜中，[M－H]?離子產(chǎn)生碎片離子/178 [M－H－CH3]?、149 [M－H－CO2]?，提示該化合物中可能存在酯基。推斷為酯類化合物silvaticol[31]。

圖3 西伯利亞蓼苷A的二級質(zhì)譜圖及可能裂解規(guī)律

圖4 6,8-二甲基-4′,5,7-三羥基高異黃烷酮二級質(zhì)譜圖及可能的裂解途徑圖

峰37的準(zhǔn)分子離子峰[M－H]?為/329.232 5，推測其最有可能的分子式為C18H34O5，在其ESI-MS/MS譜中，[M－H]?離子產(chǎn)生碎片離子/311 [M－H－H2O]?、315 [M－H－CH2]?及284 [M－H－COOH]?，提示該化合物存在羥基、羧基等。推斷為有機酸類化合物天師酸[16]。

3.5 成分變化情況分析

由表1可知，黃精九蒸九曬炮制過程中的化學(xué)成分種類存在明顯的變化，其中圖1可見，以甾體皂苷類成分為代表的大分子成分隨著蒸曬次數(shù)的增加不斷減少，甚至消失，而易于人體吸收的小分子成分及異構(gòu)化成分卻不斷增加。

原甲基薯蕷皂苷和薯蕷皂苷隨著蒸曬不斷減少，在第5次蒸曬后消失，而薯蕷皂苷元從第1次蒸曬開始出現(xiàn)，并隨著蒸曬次數(shù)不斷增加，推測因其同母核皂苷在蒸曬過程中產(chǎn)生糖基脫落而形成。同時，以 (?)-丁香樹脂酚--β--葡萄糖苷為代表的木質(zhì)素類成分和以牡荊素-2″--木糖苷為代表的黃酮苷類成分在高溫炮制的過程中脫去糖基，使得黃精炮制品種產(chǎn)生較多的單糖類成分，或許與九制黃精“味甘如飴”有關(guān)。而隨著糖基脫落以薯蕷皂苷元、牡荊素為代表的單體成分亦是逐漸增加，增強了黃精抗感染、抗過敏、抗病毒和抗休克的藥理作用。同時炮制過程中α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸等脂肪酸類成分的變化，或許與九制黃精“質(zhì)地油潤”相關(guān)。

炮制程度的差異造成了成分的巨大變化，-焦谷氨酸甲酯、(?)-丁香樹脂酚、異肥皂草苷、黃精呋甾醇苷、鈴蘭皂苷A、延齡草苷等化學(xué)成分熱穩(wěn)定性差，均在蒸曬后消失。silvaticol、6-甲基-4,5,7-三羥基-高異黃烷酮、薯蕷皂苷元等成分在三蒸三曬或者五蒸五曬后出現(xiàn)，或許與炮制過程中苷元的增加和異構(gòu)體的產(chǎn)生有關(guān)。

4 結(jié)論

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對黃精九蒸九曬炮制過程中的多種成分進行分析檢測，根據(jù)所獲得的精確相對分子質(zhì)量，同時結(jié)合色譜保留行為、質(zhì)譜裂解規(guī)律、特征碎片離子、對照品比對以及相關(guān)文獻報道，共鑒定炮制前后黃精中的61個化學(xué)成分，包括16個甾體皂苷類成分、12個黃酮類成分、5個木脂素類成分、1個香豆素類成分、3個生物堿類成分、4個脂肪酸類成分、3個氨基酸類成分、2個糖類成分、4個酯類成分、1個醛類成分、1個有機酸類成分及9個未知成分。

黃精九蒸九曬炮制過程中化學(xué)成分的種類和含量都發(fā)生一定的變化，可能與黃精炮制過程中高溫加熱造成的苷元增加和異構(gòu)體增加有關(guān)。如黃酮苷類成分牡荊素-2″--木糖苷，隨著蒸曬時間的增加含量逐漸減少，至7次蒸曬成分消失，而其糖基脫落所產(chǎn)生的牡荊素在加熱炮制后出現(xiàn)增量，隨著炮制時間的增加，含量不斷升高。同時，黃精甾體皂苷類成分在不斷的蒸曬過程中大量減少甚至消失，如甲基原薯蕷皂苷、西伯利亞蓼苷C、spiroakyroside等；甾體皂苷元的含量逐漸升高，如薯蕷皂苷元。而受溫度影響較小的熱穩(wěn)定性成分隨著蒸曬次數(shù)的增加變化不大，如脂肪酸類成分α-亞麻酸。

黃精生品會刺激咽喉，九蒸九曬可降低咽喉刺激性，增強補益功效，然而對其炮制機制的探索尚不明確，本實驗系統(tǒng)闡述黃精九蒸九曬炮制過程中的成分變化，并認為黃精蒸曬后的“增效”作用或許與黃精九蒸九曬炮制過程中化學(xué)成分變化有關(guān)，蒸曬過程中大分子成分大量分解形成易于人體吸收的小分子成分，如蒸曬后大量產(chǎn)生的小分子糖類具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，薯蕷皂苷元具有良好的調(diào)血脂作用，牡荊素對缺血性心肌損傷有良好的保護作用。然而，黃精九蒸九曬炮制機制的研究還需要做進一步探索。

中藥有效成分的“質(zhì)”“量”往往伴隨著藥物藥效的變化，本實驗從化學(xué)成分的層面闡述了黃精九蒸九曬炮制過程中化學(xué)成分的變化，為黃精九蒸九曬炮制機制的研究及蒸曬工藝的探索提供科學(xué)依據(jù)，利于黃精進一步的研究與開發(fā)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis on chemical components changes ofin processing of nine times steaming and nine times sunning by UPLC-Q-TOF-MS/MS

LIANG Ze-hua1, PAN Ying-jie1, QIU Li-yuan1, WU Xin-yu1, XU Xiao-qiang2, SHU Yue-wen2, YUAN Qiang1

1. School of Pharmacy, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311400, China 2. Zhejiang Zaochun Tang Agricultural Development Co., Ltd, Longyou 324400, China

To analyze and identify the chemical constituents in the processing of Huangjing () after “nine times steaming and nine times sunning” by solid-phase extraction combined with ultra performance liquid chromatography electrospray ionization time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS).ACQUITY UPLC BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm ) was used as gradient elution with acetonitrile-0.1% formic acid as mobile phase. Volume flow 0.3 mL/min was detected under electrospray ionization mode. The main chromatographic peaks were assigned by four stage time of flight mass spectrometry.According to the obtained accurate molecular weight, combined with the chromatographic retention behavior, mass spectrometry cleavage, characteristic fragment ions, reference comparison, and relevant literature reports, a total of 61 chemical components were identified in aqueous extracts and fermentation both from, including 16 steroidal saponins, 12 flavonoid components, five lignin components, one coumarin components, three alkaloid components, four fatty acid components, three amino acid components, two carbohydrate components, four ester components, one aldehyde components, one organic acid component and nine unknown ingredients.Processing has a great influence on the chemical components of, with the increase of processing time, such as component isomerization, the type and content of primary glycosides decrease, and the content of aglycones increase.The enhancing effect of nine times processing ofmay be related to the change of chemical composition. This study can provide theoretical basis for the study of the processing mechanism of, and provide scientific basis for the further development and utilization of.

; UPLC-Q-TOF-MS; nine times steaming and nine times sunning; processing; ingredients changes; diosgenin; sibiricoside A

R284.1

A

0253 - 2670(2022)16 - 4948 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.004

2022-02-05

梁澤華（1976—），女，漢族，浙江紹興人，副教授，博士，主要從事中藥炮制工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面研究。Tel: 13858042221

袁 強（1965—），男，漢族，浙江紹興人，教授，博士，主要從事中藥分析方面研究。Tel: 13588405258

[責(zé)任編輯 王文倩]