張宏玲, 任 浩, 李凱旋, 田 宇, 張 恒, 李艷艷,李 玲, 龐保平, 譚 瑤,*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原昆蟲研究中心, 呼和浩特010019; 2. 鑲黃旗草原工作站, 內(nèi)蒙古鑲黃旗013250;3. 正鑲白旗草原工作站, 內(nèi)蒙古正鑲白旗 013800)

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica屬鞘翅目(Coleoptera)葉甲科(Chrysomelidae)螢葉甲亞科(Galerucinae)。據(jù)報道該蟲現(xiàn)主要分布于俄羅斯、蒙古國、朝鮮、韓國以及中國的內(nèi)蒙古、新疆、甘肅等地(楊星科等, 2010)，是一種主要以幼蟲取食百合科(Liliaceae)蔥屬Allium植物的典型草地害蟲(昊翔等, 2015)。近年來，沙蔥螢葉甲在內(nèi)蒙古草原大面積暴發(fā)，嚴重影響了當?shù)夭莓a(chǎn)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展、降低了農(nóng)牧民收入，并加劇了草地退化的程度(陳龍等, 2018a)，對北方草原生態(tài)安全和地方經(jīng)濟發(fā)展帶來了嚴重的威脅。內(nèi)蒙古地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候帶，夏季涼爽，冬季嚴寒，抗寒性是保證昆蟲越冬存活的前提條件(Kangetal., 2007)，而抗寒性的強弱決定了昆蟲低溫下存活的概率(Chen and Kang, 2005)。沙蔥螢葉甲以卵在極寒條件下越冬，幼蟲發(fā)育也伴隨著低溫變化，其在短時間內(nèi)對強烈變化的溫度的快速適應保證了種群的迅速增加(馬崇勇等, 2012)，這種抗寒特性是使其維持種群數(shù)量的重要生態(tài)對策(Tanetal., 2018)。前期對沙蔥螢葉甲的抗寒性研究主要集中于低溫脅迫對沙蔥螢葉甲各蟲態(tài)生長發(fā)育的影響(李浩等, 2014, 2015; 高靖淳等, 2015; Zhouetal., 2016)、沙蔥螢葉甲響應低溫脅迫的生理生化機制(周曉榕等, 2016)、低溫脅迫下抗寒相關(guān)基因的挖掘(路標等, 2017; 陳龍等, 2018b)和克隆與表達(譚瑤等, 2017; 陳龍等, 2019; Huoetal., 2019)?？购虻墓δ苎芯坎⑽瓷钊腴_展。

熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類受到外界刺激后在生物體內(nèi)迅速合成或表達量升高的蛋白(King and MacRae, 2015)。根據(jù)分子量及生物學功能不同，HSPs可分為HSP100家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、HSP40家族和小分子HSPs(SHSPs)6個家族。熱激蛋白在進化上具有高度保守性(Sietal., 2016)，涉及蛋白質(zhì)折疊、裝配、跨膜轉(zhuǎn)運、細胞凋亡，充當分子伴侶等功能(Hartl and Hayer-Hartl, 2009; Seddigh, 2019)。依據(jù)誘導表達特性，昆蟲中的熱激蛋白可分為組成型熱激蛋白(cognate heat shock protein)和誘導型熱激蛋白(inducible heat shock protein)，主要負責維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進變性蛋白質(zhì)修復，在機體受逆境脅迫后保護蛋白、多肽(Nollen and Morimoto, 2002)。在許多研究中熱激蛋白基因常作為昆蟲響應高低溫變化的分子指示標記被報道，Dahlgaard等(1998)用高溫處理果蠅，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)Hsp70的表達與果蠅耐熱性呈正相關(guān)；Sonoda等(2006)研究表明：用低溫處理二化螟Chilosuppressalis非滯育幼蟲誘導了Hsp90的高表達；Yu等(2018)采用qPCR方法分析了-11～27℃溫度處理下二化螟幼蟲HSP60家族的Tcp-1基因mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)受到低溫脅迫后該基因的表達上調(diào)；Quan等(2020)通過研究云杉色卷蛾Choristoneurafumiferana中的8個ATP依賴的HSP轉(zhuǎn)錄本(CfHSPs)，發(fā)現(xiàn)1個HSP70基因在幼蟲期受冷脅迫后表達上調(diào)。長期以來，熱激蛋白被認為在昆蟲對外界環(huán)境溫度適應性中發(fā)揮了重要作用，但在不同昆蟲、不同蟲態(tài)中不同熱激蛋白的具體作用種類和機制仍不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)：在越冬蟲態(tài)及低溫馴化下的沙蔥螢葉甲中，編碼Hsp60蛋白(GdHsp60)和誘導型Hsp70蛋白(GdHsp70)的基因顯著高表達(譚瑤等, 2017; Tanetal., 2018)。這是否增強了沙蔥螢葉甲抗寒能力，介導了越冬時期的抗寒性，尚不清楚。

本研究為明確GdHsp60和GdHsp70基因在沙蔥螢葉甲抗寒性中的功能，采用飼喂法和顯微注射法進行RNAi實驗，檢測不同導入方法的沉默效果以及靶標基因被沉默后對沙蔥螢葉甲幼蟲抗寒能力的影響。為深入開展沙蔥螢葉甲幼蟲適應高寒環(huán)境的生態(tài)對策與分子機制奠定基礎(chǔ)，也為沙蔥螢葉甲的監(jiān)測預警及科學防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

將2019年9月采自內(nèi)蒙古錫林郭勒鑲黃旗草原的沙蔥螢葉甲越冬卵在4℃冷藏箱(YC-260L，安徽美菱生物醫(yī)療)中保存，于2020年4月初轉(zhuǎn)放入25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期14L∶10D的人工氣候箱中培養(yǎng)(PRX-350C，寧波海曙賽福實驗儀器廠)，待幼蟲孵化后以室內(nèi)種植的韭菜為食料進行飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑TaKaRa RNAiso Plus，Taq酶預混液Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 Plus Dye)，去gDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser，TA克隆載體pMD19-T Vector Cloning Kit，DNA分子量衡量標準DL2000 DNA Marker，熒光定量試劑盒SYBR Green Real-time PCR Master Mix 均購自大連寶生物工程有限公司；核酸瓊脂糖凝膠回收試劑、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司；dsRNA合成試劑盒T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System試劑盒購自Promega公司；引物合成及序列測定由生工生物工程(北京) 股份有限公司完成。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。普通PCR儀(T100 Thermal Cycler，Bio-Rad，美國)；熒光定量PCR儀(FTC-3000P，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)；超微量分光光度計(Nano Photometer TM P-Class，德國)；智能型人工氣候箱(PRX-350C，寧波海曙賽福實驗儀器廠)；低溫培養(yǎng)箱(LRH-100CB型，上海一恒儀器公司)；醫(yī)用冷藏箱(YC-260L,安徽美菱生物醫(yī)療)和多路溫度自動記錄儀(TP9024U型，深圳市拓普瑞電子有限公司)。

1.3 dsRNA的合成

用TaKaRa RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)提取沙蔥螢葉甲幼蟲總RNA，并通過超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度及質(zhì)量；使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)GdHsp60(GenBank登錄號: KY460463)和GdHsp70(GenBank登錄號: KY460462)的cDNA全長序列，設(shè)計特異性引物進行PCR擴增(表1)。PCR反應體系(25 μL)：cDNA 模板1 μL，上下游引物(10 pmol /L) 各1 μL，Premix TaqTM12.5 μL，RNase-Free ddH2O 9.5 μL。反應程序： 94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 2 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min。

將通過測序驗證的GdHsp60和GdHsp70基因序列輸入在線網(wǎng)站http:∥www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl，設(shè)計5′端含有T7啟動子序列的dsRNA引物(表1)。按照T7 Ribo MAXTMExpress RNAi System 試劑盒說明書合成dsRNA并測定其濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合成的dsRNA分子量大小是否與預期一致，-80℃保存。 根據(jù)預試驗結(jié)果，當dsRNA濃度為1 000 ng/μL時，對GdHsp60和GdHsp70基因表達RNAi效果良好。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 飼喂法RNAi

分別收集新孵化幼蟲(1齡第1天)和2齡幼蟲(蛻皮第1天)，置于干凈的培養(yǎng)皿中，每皿20頭，每個處理10皿。以長度為15 mm在濃度為1 000 ng/μL的dsRNA(dsGdHsp60和dsGdHsp70)中浸泡30 s的韭菜葉片為飼料，分別用以喂飼供試幼蟲。飼喂1 d后提供新鮮的韭菜葉片。每日記錄幼蟲死亡率、觀察生長發(fā)育情況，空白對照飼喂滅菌水處理的韭菜葉片，陰性對照飼喂浸泡過dsGFP的韭菜葉片(賈浩康等, 2019; Mishraetal., 2021)。為明確干擾效果最優(yōu)處理時間，分別在dsRNA處理幼蟲0, 12, 24, 36, 48和72 h后每個處理收集蟲體20頭，在液氮中快速冷凍，-80℃保存用于后續(xù)基因表達檢測。

1.5 顯微注射法RNAi

選取發(fā)育進度一致的2齡幼蟲(蛻皮第1天)，用毛筆小心刷去表皮的土壤和灰塵，用固體膠將其暫時粘在干凈的載玻片中，使用顯微注射器(SHTMADZU，日本)將0.4 μL(1 000 ng/μL)的dsRNA(dsGdHsp60和dsGdHsp70)注射入幼蟲腹部第8節(jié)段，注射后放入帶氣孔的離心管中單獨飼養(yǎng)，并觀察其死亡率(Gurusamyetal., 2020; Youetal., 2020)。以注射滅菌水和注射dsGFP分別作為空白對照和陰性對照，于處理0, 12, 24, 36, 48和72 h時采樣。

1.6 qPCR測定RNAi后GdHsp60和GdHsp70的相對表達量

根據(jù)GdHsp60和GdHsp70的cDNA全長序列，設(shè)計特異性引物用于qPCR檢測(表1)。qPCR反應體系(10 μL)：cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix反應液 5 μL，滅菌水3.6 μL。選用沙蔥螢葉甲琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDHA)基因作為內(nèi)參基因(Tanetal., 2016)，引物見表1。1.4和1.5節(jié)各處理3個重復，每個重復20頭個體。使用q-PCR儀(FTC-3000，F(xiàn)unglyn Biotech，加拿大)進行測定，反應程序： 95℃預變性10 min； 95℃變性15 s， 60℃退火1 min， 72℃延伸30 s， 40個循環(huán)。

1.7 熱電偶法測定GdHsp60和GdHsp70沉默后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲的過冷卻點與結(jié)冰點

為檢測沉默GdHsp60和GdHsp70對沙蔥螢葉甲2齡幼蟲抗寒性的影響，采用熱電偶法測定過冷卻點(super-cooling point, SCP)與結(jié)冰點(freezing point, FP)。使用的儀器有低溫培養(yǎng)箱(LRH-100CB型，上海一恒儀器公司)和多路溫度自動記錄儀(TP9024U型，深圳市拓普瑞電子有限公司)。將試蟲置于塞有少量脫脂棉花的移液槍頭中，插入測溫計熱敏探頭，使熱敏探頭能固定在槍頭內(nèi)并恰好緊貼1.5節(jié)處理24 h后的蟲體，隨后置于低溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置程序使箱內(nèi)溫度從室溫以約1℃/min的速率下降至-40℃，記錄試蟲體溫變化(李浩等, 2015; 史彩華等, 2016)。每個處理3次重復，每次重復20頭幼蟲。

1.8 生物測定GdHsp60和GdHsp70被沉默后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲的致死溫度和-5℃低溫處理的致死時間

為比較靶標基因沉默對沙蔥螢葉甲2齡幼蟲抗寒能力的影響，在室內(nèi)測定半致死溫度(Ltemp50) 和90%致死溫度(Ltemp90)及-5℃處理下的半致死時間(Ltime50)和90%致死時間(Ltime90)。致死溫度測定方法：將1.5節(jié)處理24 h后的幼蟲分別在25, -6, -8, -10, -12和-14±0.5℃的低溫培養(yǎng)箱中處理2 h后，統(tǒng)計死亡率，計算Ltemp50和Ltemp90。致死時間測定方法：1.5節(jié)處理24 h后的幼蟲在溫度為-5℃低溫培養(yǎng)箱中分別處理0, 12, 24, 48, 96, 144及192 h(歐陽芳和戈峰, 2014; 李浩等, 2015)，之后將試蟲轉(zhuǎn)移到25℃人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，觀察存活情況，以能自主爬行作為存活標準，統(tǒng)計死亡率以計算Ltime50和Ltime90。每個處理5組重復，每組重復20頭幼蟲。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。通過SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Kolmogorov-Smirnov檢驗沙蔥螢葉甲過冷卻點和結(jié)冰點數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。同一因素下，不同處理組相對表達量差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA，LSD 法)。回歸分析(logistic regression)擬合出死亡率與時間、溫度的關(guān)系變化曲線，確定半致死時間(Ltime50)及半致死溫度(Ltemp50)(歐陽芳和戈峰, 2014)。

2 結(jié)果

2.1 飼喂法RNAi后沙蔥螢葉甲幼蟲中GdHsp60和GdHsp70的表達水平

與飼喂dsGFP的對照組相比，1齡幼蟲飼喂dsGdHsp60 12 h后GdHsp60的表達量極顯著下降(P<0.01)，48 h下降程度最高，表達水平降低了76.07%(P<0.05)(圖1: A)，72 h時表達量有所恢復(P=0.06)；飼喂dsGdHsp70 24 h后GdHsp70的表達水平降至最低，降低了59.54%(P<0.05)，72 h后恢復至正常水平(P=0.90)(圖1: B)。與飼喂dsGFP的對照組相比，2齡幼蟲飼喂dsGdHsp60 24 h后GdHsp60的表達量顯著下降(P<0.05)，在36 h后表達量最低，降低了34.00%(P<0.05)，之后開始恢復(圖1: C)；飼喂 dsGdHsp70 12 h后，GdHsp70的表達量降至最低，顯著降低了83.49%(P<0.05)，在72 h時完全恢復(圖1: D)。結(jié)果表明，飼喂dsGdHsp60和dsGdHsp70均能夠有效降低沙蔥螢葉甲1、2齡幼蟲體內(nèi)靶標基因的表達水平。

圖1 飼喂dsRNA后沙蔥螢葉甲1(A, B)和2齡(C, D)幼蟲GdHsp60(A, C)和GdHsp70(B, D)的相對表達量Fig. 1 Relative expression levels of GdHsp60 (A, C) and GdHsp70 (B, D) in the 1 st (A, B)and 2nd (C, D) instar larvae of Galeruca daurica fed with dsRNA以滅菌水處理的空白對照組(CK)的基因表達量為基準，以dsGFP處理組為陰性對照組。下同。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=3)，柱上星號和雙星號分別表示差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01, ANOVA, LSD)；圖2同。The expression levels of genes in the blank control group (CK)(treatment with sterile water) were used as the standard, and the dsGFP treatment group was used as the negative control group. The same below. Data in the figure are mean±SE (n=3). The asterisk and double asterisk above bars indicate significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01), respectively, by ANOVA, LSD. The same for Fig. 2.

2.2 顯微注射法RNAi后沙蔥螢葉甲幼蟲中GdHsp60和GdHsp70的表達水平

與顯微注射dsGFP的對照組相比，注射12 h后，沙蔥螢葉甲2齡幼蟲體內(nèi)GdHsp60和GdHsp70的表達量均極顯著降低(P<0.01)，在24 h表達水平均降至最低，分別降低了84.15%和92.38%(P<0.01)；隨著時間延長，兩個基因的表達量逐步上升，其中注射dsGdHsp60 36 h后GdHsp60的表達量雖有所上升，但與對照相比仍存在極顯著差異(P<0.01)；而GdHsp70的表達量在注射48 h后基本恢復到正常水平(P=0.78)(圖2)。結(jié)果表明，注射dsGdhsp60 和dsGdhsp70均能夠顯著降低沙蔥螢葉甲幼蟲體內(nèi)相應靶標基因的表達水平。

圖2 顯微注射dsRNA后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲中GdHsp60(A)和GdHsp70(B)的相對表達量Fig. 2 Relative expression levels of GdHsp60 (A) and GdHsp70 (B) in the 2nd instar larvaeof Galeruca daurica after microinjection with dsRNA

2.3 GdHsp60和GdHsp70沉默對沙蔥螢葉甲2齡幼蟲過冷卻點與結(jié)冰點的影響

沙蔥螢葉甲2齡幼蟲在注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后，其過冷卻點與結(jié)冰點均顯著升高(P<0.05)(圖3: A, B)。 注射dsGFP后蟲體過冷卻點與結(jié)冰點分別為-14.71±0.11℃和-13.94±0.90℃，與空白對照相比均無顯著性變化(P>0.05)。注射dsGdHsp60后蟲體過冷卻點與結(jié)冰點分別為-10.56±0.42℃和-7.66±0.56℃，與對照相比顯著升高(P<0.001) (圖3: A, B)；注射dsGdHsp70后蟲體過冷卻點與結(jié)冰點分別為-9.08±0.23℃和-6.09±0.28℃，與對照相比顯著升高(P<0.001)(圖3: A, B)；同時，注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后過冷卻點和結(jié)冰點也存在顯著差異(P<0.05) (圖3: A, B)。

圖3 通過顯微注射法分別對GdHsp60和GdHsp70進行RNAi 24 h后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲的過冷卻點(A)和結(jié)冰點(B)Fig. 3 Super-cooling points (A) and freezing points (B) of the 2nd instar larvae of Galeruca dauricaafter RNAi of GdHsp60 and GdHsp70 by microinjection for 24 h圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤(n=25)，柱上字母表示不同處理存在顯著性差異(P<0.05, ANOVA, LSD)。圖4同。Data in the figure are mean±SE (n=25). Letters above bars indicate significant differences among different treatments (P<0.05) by ANOVA, LSD. The same for Fig. 4.

2.4 GdHsp60和GdHsp70沉默對沙蔥螢葉甲2齡幼蟲Ltime50和Ltemp50的影響

為驗證分別沉默GdHsp60和GdHsp70后是否降低了沙蔥螢葉甲幼蟲的抗寒能力，室內(nèi)測定了沙蔥螢葉甲2齡幼蟲在注射dsRNA后在不同低溫處理下的存活率。結(jié)果表明(圖4: A)，低溫處理2 h后幼蟲低溫存活率隨處理溫度的降低呈顯著下降趨勢(CK:F5.29=247.98,P<0.001; 注射dsGFP:F5.29=259.08,P<0.001; 注射dsGdHsp60:F5.29=192.02,P<0.001; 注射dsGdHsp70:F5.29=308.91,P<0.001)，除25℃常溫處理外，在各低溫處理下處理組存活率均顯著低于對照組CK和dsGFP(P<0.05)。實驗組與對照組CK和dsGFP致死中溫度Ltemp50分別為：CK: -10.57(-10.98～-10.17)℃; dsGFP: -10.63(-11.03～-10.24)℃; dsGdHsp60: -8.33(-8.73～-7.91)℃和dsGdHsp70: -8.21(-8.62～-7.79)℃(表2)。各組幼蟲在-5℃低溫處理不同時間，存活率存在極顯著差異(CK:F6.34=292.68,P<0.001; 注射dsGFP:F6.34=354.75,P<0.001; 注射dsGdHsp60:F6.34=474.07,P<0.001; 注射dsGdHsp70:F6.34=347.66,P<0.001)。與0 h低溫處理相比，dsGFP注射幼蟲處理12 h后顯著下降(P<0.05)，隨著處理時間的延長，各組存活率均逐漸降低；除低溫處理0 h外，-5℃處理不同時間的實驗組與對照組相比，幼蟲存活率均存在顯著差異(P<0.05)(圖4: B)。SPSS回歸分析(logistic regression)很好地描述了死亡率與處理時間的關(guān)系，經(jīng)計算在-5℃低溫處理下，實驗組與對照組CK和dsGFP半致死時間(Ltime50) 及95%置信區(qū)間分別為：CK: 87.92(79.18～96.87) h; dsGFP: 87.13(78.41～96.07) h; dsGdHsp60: 49.25(41.26～57.31) h; dsGdHsp70: 52.21(44.18～60.22) h(表3)，這說明沉默GdHsp60和GdHsp70均會降低幼蟲在短時間對極端低溫的耐受能力。

表2 通過顯微注射法分別對GdHsp60和GdHsp70進行RNAi 24 h后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲的致死溫度Table 2 Lethal temperature (Ltemp) for the 2nd instar larvae of Galeruca dauricaafter RNAi of GdHsp60 and GdHsp70 by microinjection for 24 h

圖4 通過顯微注射法分別對GdHsp60和GdHsp70進行RNAi 24 h后沙蔥螢葉甲2齡幼蟲在不同低溫下處理2 h(A)和-5℃處理不同時間(B)的存活率Fig. 4 Survival rates of the 2nd instar larvae of Galerucadaurica exposed to different low temperatures for 2 h (A)and -5℃ for different time (B) after RNAi of GdHsp60and GdHsp70 by microinjection for 24 h

3 討論

RNAi常用的導入方法有注射法、浸泡法、飼喂法和轉(zhuǎn)基因法等，其對靶標基因的沉默效率與dsRNA導入方法、靶基因 RNAi作用區(qū)域選擇、dsRNA長度、濃度以及dsRNA溶劑的選擇都密切相關(guān)(Wangetal., 2016; Perkinetal., 2017)。根據(jù)沙蔥螢葉甲的生物學特性，我們選取保守區(qū)域設(shè)計引物并采用飼喂法和顯微注射法進行RNA干擾。飼喂dsGdHsp60和dsGdHsp70均能夠有效降低沙蔥螢葉甲1和2齡幼蟲體內(nèi)靶標基因的表達水平(圖1)， 由于不同個體取食能力的差異， 以及dsRNA通過昆蟲腸道時可能會發(fā)生一定程度的降解等原因，飼喂法干擾效率較注射法低。通過顯微注射法導入dsRNA后，12～48 hGdHsp60和GdHsp70基因沉默現(xiàn)象持續(xù)出現(xiàn)，并呈現(xiàn)出了顯著的時間效應(圖2)。這在其他昆蟲研究中也有類似的現(xiàn)象，史學凱等(2017)通過分析不同RNAi方法對飛蝗Locusta應用SPSS回歸分析擬合出死亡率與時間、溫度的關(guān)系變化曲線。SPSS (logistic regression) was used to fit the curve of mortality with time and temperature, respectively. 表3同The same for Table 3.

表3 通過顯微注射方法分別對GdHsp60和GdHsp70進行RNAi 24 h后-5℃低溫對沙蔥螢葉甲2齡幼蟲的致死時間Table 3 Lethal time (Ltime) of low temperature of -5℃ to the 2nd instar larvae of Galeruca dauricaafter RNAi of GdHsp60 and GdHsp70 by microinjection for 24 h

migratoria觸角高表達基因的沉默效率，發(fā)現(xiàn)飛蝗觸角浸泡法和涂抹法干擾LmCYP3117C1沒有顯著效果，腹部注射法對飛蝗觸角LmCYP3117Cl的沉默效率較低，觸角窩注射法可以高效沉默LmCYP3117C1。賈浩康等(2019)利用RNAi技術(shù)沉默白背飛虱Sogatellafurcifera3齡若蟲的MCO4基因，檢測發(fā)現(xiàn)顯微注射法可以成功沉默白背飛虱的MCO4基因，沉默效率遠高于飼喂法。但在柳藍葉甲Plagioderaversicolora幼蟲RNAi實驗中，飼喂dsSrp54k的非無菌幼蟲比注射dsSrp54k的幼蟲有更高的死亡率和腸道細菌增量，認為dsSrp54k分子被柳藍葉甲取食后可間接引起腸道菌群紊亂，提高了葉甲的死亡率(Xuetal., 2021)。盡管沙蔥螢葉幼蟲取食dsGdHsp60和dsGdHsp70后體內(nèi)的分子機制尚未探明，但基于使用兩種RNAi方法后干擾效率及穩(wěn)定性的比較，對于沙蔥螢葉幼蟲RNAi實驗，注射法較優(yōu)。

熱激蛋白作為高度保守的分子伴侶，有助于提高生物對逆境的耐受性(Lietal., 2018)，增強其在惡劣環(huán)境條件下的生存和適應能力，在生物對各種環(huán)境脅迫的應答中起著關(guān)鍵作用(Luetal., 2017)。前期發(fā)現(xiàn)GdHsp70基因在沙蔥螢葉甲的生長發(fā)育和高低溫脅迫響應中都有重要作用(譚瑤等, 2017)；而冷、熱脅迫均可誘導沙蔥螢葉甲2齡幼蟲GdHsp10和GdHsp60的mRNA表達(Tanetal., 2018)。盡管很多研究報道了昆蟲熱激蛋白響應低溫脅迫或冷馴化，但其介導昆蟲抗寒性功能的深入研究卻鮮有報道。過冷卻是指植物或昆蟲的組織液可以承受0℃以下的低溫而不結(jié)冰的現(xiàn)象(Andreadis and Athanassiou, 2017)，這是昆蟲抵御低溫而存活的方式之一(岳雷等, 2013; Andreadis and Athanassiou, 2017; Niuetal., 2020)，過冷卻點則是衡量昆蟲抗寒性的重要指標。過冷卻現(xiàn)象及過冷卻點的測定在許多昆蟲的諸多蟲態(tài)中都有研究報道(黃聰?shù)? 2014; Fengetal., 2016; Mohammadzadeh and Izadi, 2018; 許向利等, 2020)，我們前期研究表明沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段的過冷卻點均存在顯著差異，過冷卻點由低到高的發(fā)育階段依次是卵、1齡幼蟲、2齡幼蟲、蛹、3齡幼蟲及成蟲(李浩等, 2014)。本研究通過對注射dsGdHsp60和dsGdHsp70后的沙蔥螢葉甲2齡幼蟲測定過冷卻點和結(jié)冰點，結(jié)果顯示均顯著高于對照(圖3)，說明通過干擾GdHsp60和GdHsp70的表達確實可以降低沙蔥螢葉甲2齡幼蟲對寒冷的耐受性。對GdHsp60和GdHsp70基因干擾后的沙蔥螢葉甲2齡幼蟲進行低溫處理，通過計算Ltemp50和Ltime50可以系統(tǒng)量化和表征致死溫度、暴露時間和低溫存活率之間的關(guān)系。結(jié)果顯示RNAi分別干擾兩個基因后實驗組Ltemp50顯著升高(表2)，而Ltime50均顯著低于對照組(表3)，進一步表明分別干擾兩個熱激蛋白基因的表達均可降低沙蔥螢葉甲幼蟲的抗寒性。同時，對比結(jié)果可以看出GdHsp70基因被干擾后可能對沙蔥螢葉甲幼蟲的抗寒性影響更大，注射dsGdHsp60和dsGdHsp70 24 h后過冷卻點、結(jié)冰點存在顯著性差異，但是對2齡幼蟲Ltime50和Ltemp50的影響不存在顯著差異，之后將進一步驗證兩個基因之間抗寒功能的相關(guān)性和差異。

本研究通過不同方法導入靶向dsRNA檢測基因表達量變化，發(fā)現(xiàn)與飼喂法相比，采用顯微注射法將dsRNA導入沙蔥螢葉甲幼蟲體內(nèi)，對GdHsp60和GdHsp70基因表達有更強的干擾效果，可作為開展沙蔥螢葉甲幼蟲RNAi的主要干擾方法。隨后對目標基因沉默后的幼蟲進行了過冷卻點、結(jié)冰點、Ltemp50及Ltime50的測定，發(fā)現(xiàn)分別干擾兩個熱激蛋白基因顯著降低了抗寒能力。本文首次通過RNAi實驗研究沙蔥螢葉甲Hsp相關(guān)基因的抗寒性功能，這對深入探索昆蟲抗寒性的分子機制有重要參考價值，也為采用RNAi進行沙蔥螢葉甲的防控提供潛在的新靶標。