葉林朋 呂 源 楊中華

1黃梅縣人民醫(yī)院泌尿外科 湖北 黃岡 435500；

2武漢大學(xué)中南醫(yī)院泌尿外科 湖北 武漢 430071

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是導(dǎo)致中老年男性排尿障礙的常見泌尿系統(tǒng)疾病［1］，其以尿頻、尿急、夜尿增多等膀胱刺激癥狀以及排尿時間延長、尿線變細、進行性排尿困難等尿路梗阻癥狀為主要臨床表現(xiàn)，并可伴有小腹部墜脹感或腰骶痛等其他表現(xiàn)，嚴重時可引起急性尿潴留或上尿路病變等繼發(fā)癥［2］。前列腺與雄激素之間聯(lián)系非常緊密［3］，雄激素作用是BPH 發(fā)生發(fā)展的必要條件。雄激素與前列腺細胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，通過抑制細胞凋亡及促進細胞增殖作用引起前列腺細胞的增殖凋亡失調(diào)，繼而導(dǎo)致前列腺增生。雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）［4］雖然對前列腺的正常生長發(fā)育起促進作用，但同時也會導(dǎo)致前列腺增生等病理性改變。DHT 通過刺激間質(zhì)組織并引發(fā)其細胞增殖，同時誘發(fā)上皮細胞發(fā)生分裂，促進BPH 的發(fā)生發(fā)展。

醛酮還原酶家族1 成員C1（aldoketo reductase family 1 member C1，AKR1C1）［5］基因?qū)儆谌┩€原酶超家族，該家族共有5 個家族成員，在人類類固醇代謝中有重要作用。AKR1C 家族成員包括AKR1C1、 AKR1C2、 AKR1C3、 AKR1C4 和AKR1D1，這些基因均位于10號染色體p14 上［6］。研究發(fā)現(xiàn)AKR1C 家族成員在不同腫瘤中有重要作用，并與BPH 等良性疾病密切相關(guān)［7］。AKR1C1 是前列腺細胞自身合成睪酮與DHT 的關(guān)鍵酶，AKRIC1 可使DHT 轉(zhuǎn)化為3β?二醇，3β?二醇結(jié)合雄激素受體β 參與細胞的增殖和凋亡。但是關(guān)于AKR1C1 在BPH 中的作用尚不明確。有文獻報道證實AKR1C1 在BPH 組織中異常高表達［8］，因此，本研究旨在明確AKR1C1 在前列腺細胞中的功能。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)人良性前列腺增生上皮細胞系BPH?1（資源編號BNCC339850）、人正常前列腺基質(zhì)永生化細胞系 WPMY?1（資源編號BNCC100291）購于上海中科院細胞庫。BPH?1 細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco，澳大利亞）中培養(yǎng)，WPMY?1 細胞在含5%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，澳大利亞）中培養(yǎng)。所有細胞系均在37 ℃，95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)染siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，小干擾RNA 序列（5'—3'）如下：si?AKR1C1?1：AAGGAGCTTTCCGGACC；si?AKR1C1?2：GGGAACTTAGAGCAAGCC；si?AKR1C1?3：TTAACGAGATTACCGGC；si?con：GGAAGTCCCGATCTATACG。 細胞計數(shù)后接種于6 孔板，每孔密度約為106個。當(dāng)6 孔板里的細胞匯合度達到30%～50%時更換新鮮培養(yǎng)基。根據(jù)試劑制造商提供的說明書配置轉(zhuǎn)染體系后，室溫孵育15～30 min，隨后每孔加入200 μL 復(fù)合物，在37 ℃，95%空氣和5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后，再次更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 流式細胞學(xué)分析用預(yù)冷PBS 離心洗滌，收集106個細胞（含上清液中的細胞）。用雙蒸水稀釋5×Binding Buffer 為1×工作液，取500 μL 1×Bind?ing Buffer 重懸細胞，每管加入5 μL Annexin V?FITC 和10 μL PI（聯(lián)科生物，杭州），輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育5 min，用流式細胞儀進行細胞凋亡分析。用預(yù)冷PBS 離心洗滌，收集106個細胞，加入1 mL DNA Staining solution 和10 μL Permea?bilization solution（聯(lián)科生物，杭州），渦旋振蕩5～10 s 混勻，室溫避光孵育30 min，用流式細胞儀進行細胞周期分析。

1.4 細胞MTT 檢測轉(zhuǎn)染后48 h，收集細胞并計數(shù)，在96 孔板中每孔接種3 000～5 000 個細胞，每孔體積為200 μL。經(jīng)過0、1、2、3 d 的培養(yǎng)后，每孔加入10 μL MTT 溶液/100 μL 培養(yǎng)基，在37 ℃，95%空氣和5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后在微平板閱讀器（Thermo Scientific）上讀取其在450 nm 處的吸光度。

1.5 RNA 提取和實時熒光定量PCR根據(jù)試劑制造商提供的說明書，利用Hipure Total RNA Mini Kit（Cat. R4111?03，Magen）提取細胞中的總RNA。實時定量PCR 采用Bio?Rad（美國）CFX96 體系進行。所有基因的表達水平由GAPDH 進行標準化。所有的樣本均獨立重復(fù)3 次（引物序列見表1）。

表1 用于PCR 的引物序列

1.6 免疫蛋白印跡分析將106個細胞于含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA（Sigma?Aldrich）中超聲處理后，放置于冰上裂解30 min。12 000g離心15 min，收集上清。30 μg 總蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉?聚丙烯酰胺凝膠分離，用Bio?Rad 濕轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（Millipore，Billerica，MA，美國）。用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫孵育2 h，4 ℃條件下一抗孵育過夜（主要抗體見表2）。用TBST 溶液洗滌3 次后，室溫條件下二抗孵育2 h。再次TBST 洗滌3 次，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測所有反應(yīng)抗原。所有蛋白的表達水平由GAPDH 進行標準化。所有的樣本均獨立重復(fù)3 次。

表2 用于Western Blot 的一抗

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)值用均數(shù)±標準差表示。統(tǒng) 計 分 析 使 用SPSS 22.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析。P<0.05 被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 AKR1C1 的敲減減緩了前列腺細胞的增殖水平為了建立AKR1C1 缺失的細胞模型，我們將3種不同的 AKR1C1 靶向特異性 siRNAs（si?AKR1C1s）轉(zhuǎn)染到WPMY?1 和BPH?1 細 胞中，48 h 后RT?PCR（圖1A、1B）結(jié)果分析提示，可以觀察到si?AKR1C1?2 在兩種細胞系中有著近乎80%的敲減效率，于是si?AKR1C1?2 被選擇使用進行后續(xù)實驗，相應(yīng)的蛋白表達水平相一致（圖1C、1D）。MTT 結(jié)果顯示AKR1C1 的敲減在BPH?1 和WP?MY?1 細胞系中表現(xiàn)出時間依賴性的增殖活性下降（圖1E、1F）。

圖1 前列腺細胞系中敲減AKR1C1 的效率驗證及對細胞增殖活性影響

2.2 AKR1C1 的敲減促進了前列腺細胞的凋亡水平，而對細胞周期無明顯影響在細胞凋亡及周期的檢測中我們觀察到，AKR1C1 的敲減對BPH?1 和WPMY?1 細胞系的周期無明顯影響（圖2A、2B、2C），但可使BPH?1 和WPMY?1 細胞的凋亡率上升（圖2D、2E、2F）。相應(yīng)的周期蛋白CDK2 及CDK4在AKR1C1 敲減后無明顯表達差異，反映凋亡水平的表達蛋白BAX 在AKR1C1 敲減后表達上調(diào)，而凋亡負相關(guān)蛋白Bcl?2 在AKR1C1 敲減后表達下調(diào)（圖2G、2H）。

圖2 前列腺細胞系中敲減AKR1C1 對細胞周期及凋亡的影響

2.3 AKR1C1 的過表達上調(diào)了前列腺細胞的增殖水平將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BPH?1 和WPMY?1 細胞中過表 達AKR1C1，連 續(xù) 培 養(yǎng)48 h 后，AKR1C1 在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上均達到上調(diào)效果（圖3A、3B、3C），以進行后續(xù)實驗。 MTT 結(jié)果顯示AKR1C1 的過表達在BPH?1 和WPMY?1 細胞系中表現(xiàn)出時間依賴性的增殖活性上調(diào)（圖3D、3E）。

圖3 前列腺細胞系中過表達AKR1C1 的效率驗證及對細胞增殖活性影響

2.4 AKR1C1 的過表達抑制了前列腺細胞的凋亡水平，而對細胞周期無明顯影響在細胞凋亡及周期的檢測中觀察到，AKR1C1 的過表達對BPH?1 和WPMY?1 細胞系的周期無明顯影響（圖4A、4B、4C），但可抑制BPH?1 和WPMY?1 細胞的凋亡（圖4D、4E、4F）。相應(yīng)的周期蛋白CDK2 及CDK4 在AKR1C1 過表達后無明顯表達差異，反映凋亡水平的表達蛋白BAX 在AKR1C1 過表達后表達下降，而凋亡負相關(guān)蛋白Bcl?2 在AKR1C1 過表達后表達上調(diào)（圖4G、4H）。

圖4 前列腺細胞系中敲減AKR1C1 對細胞周期及凋亡的影響

3 討論

人類前列腺對正常男性生殖是必不可少的，成熟腺體的生長和維持依賴于強效雄激素5α?二氫睪酮（DHT）［9］。雄激素作用是BPH 發(fā)生發(fā)展的必要條件。雄激素與前列腺細胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，通過抑制細胞凋亡及促進細胞增殖作用引起前列腺細胞的增殖凋亡失調(diào)，繼而導(dǎo)致BPH［10］。DHT 作為雄激素的一種，其濃度在BPH 組織中比正常組織中明顯增高，其與前列腺腺體內(nèi)受體的親和力更強。DHT 雖然對前列腺的正常生長發(fā)育起促進作用，但同時也會導(dǎo)致前列腺增生等病理性改變［11］。DHT 通過刺激間質(zhì)組織并引發(fā)其細胞增殖，同時誘發(fā)上皮細胞發(fā)生分裂，促進BPH 的發(fā)生發(fā)展。雄激素的作用在前列腺中由負責(zé)DHT 的形成和消除的酶在預(yù)受體水平上調(diào)控，例如2，5α?還原酶和羥類固醇脫氫酶［9］，這些酶或核受體的失調(diào)可能導(dǎo)致雄激素依賴性疾病的發(fā)生。

本 研 究 對BPH?1 和WPMY?1 細 胞 系 中 的AKR1C1 基因進行敲減和過表達，以進一步驗證AKR1C1 水平的變化對前列腺細胞的功能影響。結(jié)果表明，AKR1C1 的敲減減弱了前列腺細胞的增殖能力，加快了細胞的凋亡水平，而其過表達則對前列腺細胞的增殖水平發(fā)揮促進作用，同時在一定程度上抑制了細胞的凋亡發(fā)生，以上均表明AKR1C1 在前列腺細胞中是一個促進增殖、抑制凋亡的蛋白。但在細胞周期的檢測中我們觀察到，AKR1C1 水平的變化并未對前列腺細胞的細胞周期產(chǎn)生明顯影響，這可能表明AKR1C1 在前列腺細胞中并不是一個周期相關(guān)的蛋白。

綜上所述，良性前列腺增生中AKR1C1 的高水平表達，可促進前列腺細胞的增殖，抑制細胞的凋亡，從而在良性前列腺增生疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。因此，針對AKR1C1 靶點，有可能成為良性前列腺增生的治療新策略。