黃 祎 許國圣 楊浦娟 胡文艷 李 梅 劉華寶

(重慶市中醫(yī)院肝病科，重慶 400021)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一種自身免疫性肝病，臨床癥狀以膽汁淤積為主，病理表現(xiàn)主要為肝內(nèi)小葉間膽管慢性非化膿性炎癥和肉芽腫性破壞，病情逐漸發(fā)展，導(dǎo)致肝硬化，最終可出現(xiàn)肝衰竭等[1]。PBC發(fā)病率為3～15/10萬人，并有逐年上升趨勢[2-3]。PBC的發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前普遍認為是由免疫網(wǎng)絡(luò)失衡而致膽管上皮細胞損傷，最終導(dǎo)致膽汁淤積和肝纖維化[4]，其中輔助性T淋巴細胞17(Th17)及相關(guān)細胞因子的異常免疫反應(yīng)在PBC發(fā)病中的作用也多有研究。前期研究已證實，滋水涵木利膽方治療PBC取得較好的臨床療效[5]。2017年1月至2018年9月，我們采用滋水涵木利膽方聯(lián)合熊去氧膽酸膠囊治療肝腎虧虛型PBC 38例，并與熊去氧膽酸膠囊治療38例對照，觀察對中醫(yī)證候、Th17及相關(guān)細胞因子的影響，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 全部76例均為重慶市中醫(yī)院肝病科門診PBC患者，按照隨機數(shù)字表法分為2組。治療組38例(后脫落1例)，男5例，女32例；年齡35～70歲，平均(58.00±8.18)歲；病程1～13年，平均(5.60±3.03)年。對照組38例(后脫落2例)，男3例，女33例；年齡37～69歲，平均(59.89±7.97)歲；病程1～11年，平均(5.17±2.50)年。2組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。同時納入重慶市中醫(yī)院體檢中心30名健康志愿者為健康組，男2名，女28名；年齡33～70歲，平均(56.87±8.26)歲。入組的2組PBC患者與健康組之間年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 病例選擇

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《原發(fā)性膽汁性肝硬化(又名原發(fā)性膽汁性膽管炎)診斷和治療共識(2015)》[6]：①無其他原因解釋的血清堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)升高，并且免疫學(xué)檢查提示抗線粒體抗體(AMA)(滴度>1∶40)和(或)抗線粒體2型抗體(AMA-M2)陽性的成年患者；②對于免疫學(xué)檢查AMA和AMA-M2陰性，可通過肝穿刺病理活檢確診。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南：西醫(yī)疾病部分》[7]中“膽汁淤積性肝病”的標(biāo)準(zhǔn)，參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[8]辨證為肝腎虧虛型。主癥:皮膚瘙癢，乏力，黃疸，脅痛。次癥:情志抑郁，口干，眼干，大便稀溏，納差，腹脹，失眠。舌脈:舌質(zhì)紅，無苔或少苔，脈細數(shù)。滿足2項主癥，2項或超過2項的次癥，同時符合舌脈，即可確診。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合以上西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);血清ALP≥220 U/L，GGT≥100 U/L；有良好的依從性，能按時服藥，按規(guī)定時間復(fù)查者；年齡18～70歲；患者知情同意，自愿接受該項試驗。健康組志愿者選擇標(biāo)準(zhǔn)如下：年齡18～70歲，否認既往有自身免疫性疾病;近4周沒有接受過免疫抑制劑等治療;未患精神障礙、重度各系統(tǒng)病變、免疫缺陷、惡性腫瘤。本研究得到重慶市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批件號：2017-ky-5。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①排除病毒性、遺傳代謝性、血吸蟲性、藥物酒精性等其他原因所致的肝病;②對所用藥物有過敏或不良反應(yīng)者;③同時在服用與本病有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)劑，如糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤者;④合并有腫瘤、肝硬化失代償期嚴重并發(fā)癥者;⑤有嚴重心臟或腎、腦、肺及造血系統(tǒng)疾病者;⑥妊娠期或哺乳期婦女。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組 予熊去氧膽酸膠囊(Losan Pharma GmbH，國藥準(zhǔn)字H20181059)250 mg，每日3次口服。

1.3.2 治療組 在對照組治療基礎(chǔ)上予滋水涵木利膽方治療。藥物組成：熟地黃、黃精、陳皮各10 g，秦艽、葛根、白芍、雞內(nèi)金各30 g，金錢草、徐長卿、山茱萸各15 g。日1劑，采用北京康仁堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的顆粒劑，每日3次餐后30 min沖服。

1.3.3 療程 2組均治療24周。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 中醫(yī)證候評分 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[8]。主癥:皮膚瘙癢、乏力、黃疸、脅痛，按程度無、輕、中、重度分別記0、2、4、6分。次癥:情志抑郁、口干、眼干、大便稀溏、納差、腹脹、失眠，按程度無、輕、中、重度分別記0、1、2、3分。

1.4.2 Th17檢測 健康組于采血當(dāng)日清晨空腹抽肘靜脈血，治療組、對照組均于治療前后清晨空腹采集肘靜脈血。采用流式細胞術(shù)檢測外周血Th17表達率。使用Accuri C6流式細胞儀(美國BD公司)，嚴格按照說明書進行操作，完成細胞的收集，用0.5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)吹散細胞后上機，采用BD FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)，得出Th17的表達率。

1.4.3 血清細胞因子檢測 健康組于采血當(dāng)日清晨空腹抽肘靜脈血，治療組、對照組均于治療前后清晨空腹采集肘靜脈血。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清白細胞介素(IL)-6、IL-17、IL-21、IL-23、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)水平，試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.4.4 相關(guān)性分析 采用Spearman相關(guān)性分析對治療組和對照組中醫(yī)證候評分、外周血Th17和相關(guān)細胞因子的相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果

2.1 2組治療前后中醫(yī)證候評分比較 治療組治療后除情志抑郁、納差評分外，其余中醫(yī)證候各項評分及總分均較本組治療前降低(P<0.05)，對照組治療后除情志抑郁、腹脹評分外均降低(P<0.05)，且治療組治療后黃疸、脅痛、口干、眼干、腹脹評分及總分均低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 2組治療前后中醫(yī)證候評分比較 分，

2.2 3組Th17表達率比較 與健康組比較，2組PBC患者治療前外周血Th17表達率均升高(P<0.05)。2組治療后Th17表達率均較本組治療前降低(P<0.05)，且治療組治療后低于對照組(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 3組Th17表達率比較

健康組 治療組 對照組

2.3 3組血清IL-17、IL-6、IL-21、IL-23、TGF-β1水平比較 與健康組比較，2組PBC患者治療前IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平均升高(P<0.05)，TGF-β1水平均降低(P<0.05)。2組治療后IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平均較本組治療降低(P<0.05)，TGF-β1水平均升高(P<0.05)，且治療組治療后IL-17、IL-6水平均低于對照組(P<0.05)，2組治療后IL-21、IL-23、TGF-β1水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 3組血清IL-17、IL-6、IL-21、IL-23、TGF-β1水平比較

2.4 相關(guān)性分析

2.4.1 PBC患者Th17表達率與相關(guān)細胞因子間的相關(guān)性 PBC患者Th17表達率與IL-6、IL-17呈正相關(guān)。見圖2。

圖2 PBC患者外周血Th17與IL-6、IL-17相關(guān)性分析散點圖

2.4.2 PBC患者外周血Th17、相關(guān)細胞因子水平與中醫(yī)證候評分間的相關(guān)性 PBC患者Th17外周血表達與中醫(yī)證候評分不存在明顯相關(guān)性。PBC患者血清IL-6、IL-17、IL-21水平與中醫(yī)證候評分呈正相關(guān)。見圖3。

圖3 PBC患者外周血Th17、相關(guān)細胞因子含量與中醫(yī)證候評分相關(guān)性分析散點圖

2.4.3 PBC患者相關(guān)細胞因子之間的相關(guān)性 PBC患者血清IL-6與IL-17、IL-6與IL-21、IL-17與IL-21呈正相關(guān)。見圖4。

圖4 PBC患者外周血Th17相關(guān)細胞因子之間相關(guān)性分析散點圖

3 討論

PBC是一種自身免疫性肝病，臨床癥狀以膽汁淤積為主，病理表現(xiàn)主要為肝內(nèi)小葉間膽管慢性非化膿性炎癥和肉芽腫性破壞，病情逐漸發(fā)展，導(dǎo)致肝硬化，最終可出現(xiàn)肝衰竭等[1]。在復(fù)雜的PBC發(fā)病機制中，“上游”異常免疫反應(yīng)和“下游”炎癥損傷是PBC病情進展的兩大核心環(huán)節(jié)，而Th17與相關(guān)細胞因子表達異常發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。目前PBC臨床用藥為熊去氧膽酸和奧貝膽酸。奧貝膽酸在國內(nèi)尚未上市，而熊去氧膽酸有效延緩疾病進展的比率大約為 60%，仍有約40%的PBC患者病情不能得到有效緩解[2]。因此，發(fā)揮中醫(yī)藥優(yōu)勢治療PBC至關(guān)重要。我們前期通過臨床研究肯定了滋水涵木利膽方聯(lián)合熊去氧膽酸在改善PBC患者癥狀及生化指標(biāo)方面較單用熊去氧膽酸有顯著優(yōu)勢[5]。本研究從Th17及相關(guān)細胞因子角度，探討滋水涵木利膽方治療PBC患者的可能發(fā)病機制。

PBC好發(fā)于圍絕經(jīng)期女性,此年齡段的女性天癸竭，腎精大虧，水不涵木，又因肝之余氣積聚而成膽汁，肝腎陰虛，致肝臟分泌膽汁的能力不足，可兼夾濕、熱、瘀等病邪蘊結(jié)肝膽,肝臟疏泄功能失常，膽道不利，膽汁的排泄受到影響，終致膽汁不循常道,肝膽絡(luò)脈阻滯,而肝腎陰虛，精血不足，不能濡養(yǎng)皮膚，水不涵木則木燥而生風(fēng)，風(fēng)動則癢。治療原則為滋水涵木，利膽祛風(fēng)。滋水涵木利膽方是在PBC的中醫(yī)病機分析基礎(chǔ)上擬定的，方中熟地黃、山茱萸、黃精養(yǎng)陰益腎；白芍平抑肝陽，養(yǎng)血斂陰，葛根生津止渴，升陽止瀉，與白芍配伍，可以制約白芍性寒，防脾胃虛弱者易致泄瀉之弊；陳皮行氣健脾，調(diào)中開胃，防養(yǎng)陰血之藥壅滯脾土；雞內(nèi)金健胃消食利膽，兼顧溫和化瘀；金錢草利膽退黃；徐長卿活血祛風(fēng)止癢；秦艽祛風(fēng)通絡(luò)。全方以補虛治本為主，利膽祛風(fēng)為輔，共奏滋水涵木、利膽祛風(fēng)之功。本研究結(jié)果顯示，2組治療后中醫(yī)證候總分均較本組治療前降低(P<0.05)，且治療組治療后低于對照組(P<0.05)。提示滋水涵木利膽方能改善肝腎虧虛型PBC患者中醫(yī)臨床證候。

Rong G等[9]研究結(jié)果顯示，PBC患者外周血調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)大幅減少，Th17則大幅增多。Qian C等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者血清IL-17水平和肝組織中IL-17陽性細胞表達明顯上調(diào)，IL-17可通過激活肝星狀細胞和骨髓樹突狀細胞促進肝硬化的形成[11]。人IL-6對T0細胞分化為Th17并發(fā)育成熟起促進作用，其所分泌的細胞因子可進一步促進炎癥發(fā)生[12-13]，Th17生成的IL-21對Th17分化具正向刺激效能[14]，而其分泌的IL-23也能維持和擴大Th17的分化[15]。TGF-β1在高濃度下促進Treg分化，同時，在低濃度下是可以誘導(dǎo)Th17的分化，這種濃度的差異使TGF-β1對免疫反應(yīng)具有雙向調(diào)節(jié)作用[16-18]。本研究結(jié)果顯示，2組治療后Th17表達率均較本組治療前降低(P<0.05)，且治療組治療后低于對照組(P<0.05)。2組治療后IL-17、IL-6、IL-21、IL-23水平均較本組治療降低(P<0.05)，TGF-β1水平均升高(P<0.05)，且治療組治療后IL-17、IL-6水平均低于對照組(P<0.05)。經(jīng)相關(guān)性分析可知，PBC患者外周血Th17表達率與IL-17、IL-6呈正相關(guān)，中醫(yī)證候評分與IL-6、IL-17、IL-21呈正相關(guān)，IL-6與IL-17、IL-6與IL-21、IL-17與IL-21呈較強的正相關(guān)性。由此可推測，IL-6協(xié)同TGF-β1打破Th17/Treg細胞平衡，促進Th17分化，其分泌的細胞因子可進一步促進炎性反應(yīng)，結(jié)果與目前大多數(shù)研究結(jié)果[19-21]相似，但國內(nèi)存在一項與之不同的結(jié)果，陳穎等[22]研究認為，Th17表達與IL-17沒有相關(guān)性。這些免疫細胞及細胞因子之間是否存在其他的相關(guān)性仍需要在深入研究中進一步判斷，PBC患者慢性炎癥狀態(tài)中的免疫損傷過程仍需進一步驗證。

綜上所述，滋水涵木利膽方治療肝腎虧虛型PBC能改善患者中醫(yī)臨床證候，降低Th17表達率和相關(guān)細胞因子水平，推測滋水涵木利膽方可能通過下調(diào)IL-6，減少其與TGF-β1的協(xié)同作用，抑制Th17表達，削弱相關(guān)細胞因子(主要為IL-17)的生成，從而達到抑制下游炎性反應(yīng)的目的。