馬福財(cái)，楊德武，王 錚，蓋志剛，朱海宏

泡型包蟲(chóng)病(Alveolar echinococcosis，AE)是一種罕見(jiàn)的、嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)疾病，是由多房棘球絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)(泡球蚴)在中間宿主肝內(nèi)不斷增殖而引起的一種嚴(yán)重肝病，常被誤診為肝癌[1]。棘球絳蟲(chóng)的感染過(guò)程如下：中間宿主通過(guò)攝入終末宿主的糞便中的蟲(chóng)卵感染, 蟲(chóng)卵在中間宿主體內(nèi)孵化為幼蟲(chóng)，幼蟲(chóng)會(huì)因?yàn)榻K末宿主捕食已感染的中間宿主而寄生于其腸道內(nèi)發(fā)育成蟲(chóng)。成蟲(chóng)的卵隨糞便排出又感染中間宿主，形成循環(huán)感染[2]。食肉動(dòng)物是棘球絳蟲(chóng)的終宿主，攝取卵后，這些卵在人類腸道中孵化釋放通過(guò)門靜脈和淋巴管到達(dá)肝臟，發(fā)育成為幼蟲(chóng)，它們也可能到達(dá)肺、腦、骨骼或者其他器官，但相比于肝臟，其他部位發(fā)生的頻率很低[3]，因此肝臟是泡球蚴感染寄生的主要靶器官。泡球蚴進(jìn)入肝臟形成原發(fā)病灶后就開(kāi)始對(duì)肝臟進(jìn)行持續(xù)性不可逆的損傷，最終導(dǎo)致局部肝纖維化[4]。肝臟泡型包蟲(chóng)病病灶成緩慢浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，類似緩慢生長(zhǎng)的肝癌，不斷產(chǎn)生新囊泡而侵犯鄰近組織結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致肝功能障礙[5]。

miRNAs(microRNAs，微小RNA)，是一類長(zhǎng)度在21～22個(gè)核苷酸的小RNA分子，其主要特點(diǎn)是內(nèi)源性單鏈非編碼的單鏈小分子RNA，能夠通過(guò)與靶mRNAs特異性的堿基配對(duì)引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的調(diào)控[6]。大量的研究已經(jīng)表明miRNAs失調(diào)與許多人類疾病有關(guān)，如癌癥、自身免疫性疾病和寄生蟲(chóng)病[7-9]。在各種急慢性肝損傷的進(jìn)程中，miRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)不同的靶基因產(chǎn)生重要的作用[10]。在泡球蚴感染寄主的過(guò)程中，miRNAs也起著至關(guān)重要的作用[11]。miRNAs基因簇是由部分miRNAs基因緊密相連，排列成簇地分布在同一區(qū)域發(fā)揮功能。基因簇的功能往往比單獨(dú)的基因作用更加高效，基因簇的多個(gè)成員之間同時(shí)作用相互協(xié)同，能夠更加高效的發(fā)揮生物學(xué)功能。miR-106b-25基因簇的轉(zhuǎn)錄本定位于人類7號(hào)染色體上，這個(gè)區(qū)域編碼了3種成熟的miRNAs即miR-106b，miR-93和miR-25。本文對(duì)miR-106b-25基因簇在肝泡型包蟲(chóng)病肝組織中的表達(dá)進(jìn)行了初步研究，以期能為肝泡型包蟲(chóng)病的臨床診療和研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2020年7月至2020年10月青海省人民醫(yī)院確診的20例泡型肝包蟲(chóng)病患者，均為來(lái)自青海藏區(qū)的藏族患者，男11例，女9例，年齡20～50歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)術(shù)前血清學(xué)包蟲(chóng)抗體陽(yáng)性， 肝臟三期CT及術(shù)后病理均診斷為肝泡球蚴病；2)首次行肝泡球蚴病灶根治術(shù)；3)術(shù)前未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移；4)未合并肝囊性包蟲(chóng)病及其它原因占位性疾病(寄生蟲(chóng)、良惡性腫瘤、肝膿腫等)；5)無(wú)肝炎、黃疸等慢性肝功能受損史；6)無(wú)上腹部尤其是肝膽系統(tǒng)手術(shù)史及介入治療史。本研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)同意，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑及儀器 miRcute miRNA提取分離試劑盒(離心柱型，目錄號(hào)DP501)、miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第1鏈合成試劑盒(目錄號(hào)：KR211)、miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBRGreen目錄號(hào)：FP411)和內(nèi)參U6均購(gòu)自于天根生化科技有限公司(北京)，PCR引物由北京六合華大基因科技有限公司合成(表1)，石蠟切片機(jī)RM2125RT(德國(guó) LEICA)，BX53光學(xué)顯微鏡(日本 OLYMPUS)，羅氏LC480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，USA)，超微量核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó) Implen NP80 Mobile)，常規(guī)試劑、普通及預(yù)冷離心機(jī)、冰箱等由青海大學(xué)國(guó)家三江源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 病理檢查 根據(jù)病例取材，每個(gè)患者的肝臟標(biāo)本分為病灶旁肝組織(距病灶2 cm內(nèi))、正常肝組織(距病灶2 cm以外正常組織)。肝臟組織樣本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片(2片)后，分別行HE染色和Masson染色。由資深病理科專家讀片，依據(jù)肝纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行肝纖維化分級(jí)[12]。F0：無(wú)明顯肝纖維化；F1：匯管區(qū)有纖維化，但無(wú)纖維間隔，屬輕度纖維化；F2：匯管區(qū)有纖維化伴少量纖維間隔分隔，屬中度纖維化；F3：有大量間隔纖維化但無(wú)肝硬化，屬重度纖維化；F4：肝硬化。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將20例新鮮標(biāo)本取出后速凍于液氮移送至實(shí)驗(yàn)室。液氮中取出標(biāo)本組織，將組織剪碎在液氮中磨碎，每30～50 mg組織中加入1 mL裂解液MZ，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。將上述組織按照miRcute miRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用氯仿、無(wú)水乙醇等試劑進(jìn)行miRNA的提取。RNA定量檢測(cè)使用超微量核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行，純度及完整性采用甲醛變性凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。

按照miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行加尾法逆轉(zhuǎn)錄，將反應(yīng)后合成的20 μL cDNA裝于EP管中置于-20 ℃保存，以備進(jìn)行下游熒光定量檢測(cè)。miRNA前引物見(jiàn)表1，后引物為試劑盒中的通用引物。反應(yīng)體系：2 μL的cDNA模板，0.4 μL前引物和0.4 μL后引物， 10 μL的2×miRcute plus miRNA Premix，7.2 μL雙蒸水。羅氏LC480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀上設(shè)置反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃反應(yīng)15 min，兩步循環(huán)包括“94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s”，共40個(gè)循環(huán)，U6 RNA作為內(nèi)參，反應(yīng)條件同上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。所得數(shù)據(jù)運(yùn)用RQ=2-ΔΔCT計(jì)算，(Ct值為熒光達(dá)到閾值時(shí)所需要的PCR循環(huán)數(shù))，測(cè)定miRNA的相對(duì)表達(dá)量[13]。

2 結(jié) 果

2.1 泡型包蟲(chóng)病肝纖維化病理觀察

2.1.1 HE染色 病灶旁肝組織HE染色，肝小葉結(jié)構(gòu)有不同程度破壞、可見(jiàn)不同程度肝細(xì)胞變性、萎縮、壞死及纖維組織增生，可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。正常肝組織HE染色后，肝臟無(wú)異常病理改變；肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)變性、壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝細(xì)胞大小均勻、形態(tài)正常。

0級(jí) 1級(jí) 2級(jí) 3級(jí)注：*為病灶周圍出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，包括嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、纖維組織增生等圖1 肝組織HE染色病理結(jié)果(200×)Fig.1 Pathological results of HE staining of liver tissue (200×)

2.1.2 Masson染色 病灶旁肝組織染色后可見(jiàn)匯管區(qū)較多纖維結(jié)締組織增生，出現(xiàn)不同程度小葉內(nèi)纖維化；部分病灶旁肝組織染色后可見(jiàn)匯管區(qū)大量纖維結(jié)締組織增生，小葉內(nèi)大量纖維化(圖2)；正常肝組織染色后無(wú)明顯異常病理改變。40例肝泡型包蟲(chóng)病患者肝組織標(biāo)本中，病灶旁肝組織中存在9例1級(jí)纖維化、6例2級(jí)纖維化和5例3級(jí)纖維化；正常組無(wú)纖維化，均為0級(jí)。

0級(jí) 1級(jí) 2級(jí) 3級(jí)圖2 肝組織Masson染色病理結(jié)果(200×)Fig.2 Pathological results of Masson staining of liver tissue (200×)

2.2 miR-106b-25基因簇在肝組織中的表達(dá)水平

經(jīng)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-106b、miR-93和miR-25在病灶旁肝組織中的相對(duì)表達(dá)量均高于正常肝組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。見(jiàn)表2及圖3。

表2 病灶旁肝組織和正常肝組織中miR-106b、miR-93和miR-25的相對(duì)表達(dá)量(n=20)Tab.2 Expression of miR-106b, miR-93 and miR-25 in para-lesion and normal hepatic tissues (n=20)

注：①P<0.001圖3 病灶旁肝組織和正常肝組織中miR-106b、miR-93和miR-25的表達(dá)量(n=20)Fig.3 Expression of miR-106b, miR-93 and miR-25 in para-lesion and normal hepatic tissues (n=20)

2.3 miR-106b-25基因簇與肝纖維化程度分析

2.3.1 miR-106b-25基因簇與肝纖維化程度的相關(guān)性 采用Spearman相關(guān)判斷miR-106b-25基因簇與肝纖維化程度的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-106b(r=0.806,P<0.001)、miR-93(r=0.799,P<0.001)和miR-25(r=0.789,P<0.001)均與肝纖維化程度存在正相關(guān)。見(jiàn)圖4。

圖4 miR-106b-25基因簇與肝纖維化程度相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of miR-106b-25 gene cluster and hepatic fibrosis degree

2.3.2 肝纖維化程度與miR-106b-25基因簇表達(dá)水平的關(guān)系 經(jīng)單因素方差分析不同纖維化程度肝組織中miR-106b-25基因簇表達(dá)水平差異，發(fā)現(xiàn)1級(jí)、2級(jí)和3級(jí)纖維化肝組織中miR-106b-25基因簇表達(dá)水平高于0級(jí)(均P<0.05)，3級(jí)纖維化肝組織中miR-106b-25基因簇表達(dá)水平高于2級(jí)和1級(jí)(P<0.05)；2級(jí)纖維化肝組織中miR-106b和miR-93表達(dá)水平高于1級(jí)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 肝纖維化程度與 miR-106b-25基因簇表達(dá)的分析Tab.3 Analysis of hepatic fibrosis degree and expression of miR-106b-25 gene cluster

2.4 miR-106b-25基因簇各成員之間的相關(guān)性分析 miR-106b與miR-93表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.815，P<0.01)，miR-106b與miR-25表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.605，P<0.01)，miR-93與miR-25表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.747，P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 miR-106b-25基因簇各成員之間相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis among members of miR-106b-25 gene cluster

3 討 論

泡球蚴在中間宿主肝內(nèi)通過(guò)增殖以及強(qiáng)烈的肉芽腫反應(yīng)，并向周圍組織浸潤(rùn)對(duì)肝臟造成嚴(yán)重的病理?yè)p傷。由于泡球蚴的生長(zhǎng)方式與腫瘤類似，往往借助腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制來(lái)研究泡球蚴的發(fā)病機(jī)理，研究結(jié)果顯示免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子、信號(hào)通路、血管新生等同樣在泡球蚴的致病過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用[14]。也有研究顯示泡球蚴感染后可能通過(guò)膠原沉積、細(xì)胞周期改變、介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答、信號(hào)通路激活等因素造成宿主肝細(xì)胞損害，從而影響多房棘球蚴病的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)20例包蟲(chóng)病患者肝組織手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在距離病灶近的部位(2 cm以內(nèi))，miR-106b-25基因簇的表達(dá)量明顯高于距離病灶2 cm以外的正常肝組織，同時(shí)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝纖維化均發(fā)生在距離病灶近的部位(2 cm以內(nèi))，而在距病灶2 cm以外的正常肝組織，無(wú)明顯纖維化。這一結(jié)果與王俊華等[16]對(duì)泡球蚴病致肝纖維化發(fā)生在病灶周圍的結(jié)果一致。

肝纖維化是多種慢性肝病進(jìn)程中共同的關(guān)鍵病理過(guò)程。肝臟受損后,在炎癥和細(xì)胞因子的作用下,處于靜止?fàn)顟B(tài)的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)被激活，進(jìn)而合成和分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)在肝內(nèi)的過(guò)多沉積導(dǎo)致肝纖維化形成[17]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的表觀遺傳調(diào)節(jié)與HSC活化相關(guān)，miRNA通過(guò)改變mRNA降解，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，控制HSC的活化和非活化。當(dāng)寄生蟲(chóng)感染宿主后，miRNA會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)多種靶基因及信號(hào)參與到損傷肝臟的進(jìn)程。miR-21和miR-96可以通過(guò)靶向抑制SMAD7激活SMAD信號(hào)通路并增加膠原蛋白來(lái)促進(jìn)血吸蟲(chóng)病相關(guān)肝纖維化表達(dá)[18-19]。miR-351作為一種抗病毒miRNA與多種肝臟疾病有關(guān)[20]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-351通過(guò)靶向維生素D 受體 (Vit D receptor, VDR) 介導(dǎo)血吸蟲(chóng)誘導(dǎo)的肝纖維化[21]。此外MiR-146a/b通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化為M2型細(xì)胞在肝血吸蟲(chóng)病中發(fā)揮保護(hù)作用，miR146a/b還調(diào)節(jié)乙型肝炎感染患者從肝纖維化到肝硬化的轉(zhuǎn)化[22]并減輕四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)的大鼠的肝纖維化[23]。miR-203-3p可以通過(guò)抑制白細(xì)胞介素-33(IL-33)的分泌抑制血吸蟲(chóng)病相關(guān)肝纖維化過(guò)程。miR-203可能通過(guò)靶向SMAD3[24]和抑制心肌纖維化的功能來(lái)抑制ECM成分的合成和沉積，從而阻止HSC活化[25]。

miR-106b-25基因簇在肝癌[26]、胃癌[27]、乳腺癌[28]等腫瘤性疾病中不同程度的上調(diào)。miR-106b-25基因簇還可以通過(guò)促進(jìn)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(Epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)的形成，加重腎纖維化[29]。在導(dǎo)致肝纖維化方面，目前已經(jīng)有證據(jù)表明miR-93和miR-106b在肝癌導(dǎo)致肝硬化的發(fā)展過(guò)程中持續(xù)上調(diào)[30]。miR-106b在血清中的表達(dá)水平也已被證明可用于預(yù)測(cè)肝硬化，且無(wú)論病因如何，miR-106b和miR-181都被證明可作為肝硬化的生物標(biāo)志物[31]。miR-106b-25基因簇可以抑制同源性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog, PTEN)的蛋白表達(dá)[32-33]。而PTEN的下調(diào)通過(guò)AKT途徑導(dǎo)致過(guò)度增殖和抗凋亡活動(dòng)[34]。PTEN缺陷小鼠表現(xiàn)出肝腫大、脂肪性肝炎、纖維化并最終發(fā)展為肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC)[35]。這表明miR-106b-25基因簇在肝癌中通過(guò)AKT途徑抑制PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化。然而泡球蚴感染人體后是否有miR-106b-25參與到了泡球蚴所致肝纖維化的過(guò)程中，目前未尚見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本次研究結(jié)果表明，靠近泡球蚴肝臟病灶的部位，miR-106b-25基因簇表達(dá)量高，纖維化程度也隨之升高，miR-106b-25基因簇與肝纖維化程度呈正相關(guān)，提示著miR-106b-25基因簇參與了局部肝纖維化的進(jìn)展。對(duì)miR-106b-25基因簇各成員的定量表達(dá)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)miR-106b-25基因簇各成員的表達(dá)存在明顯相關(guān)性，可能存在協(xié)同轉(zhuǎn)錄。然而肝纖維化進(jìn)程受到多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路的影響，miR-106b-25基因簇具體是通過(guò)調(diào)節(jié)哪種靶基因及信號(hào)通路影響泡球蚴感染所致的肝纖維化進(jìn)程，這還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及研究進(jìn)行驗(yàn)證。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：馬福財(cái)，楊德武，王 崢，等. miR-106b-25基因簇在肝泡型包蟲(chóng)病肝組織中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：631-637. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.081