欒秀麗，范雪亭，王瑞歡，李馬超，于晉杰,2，錢程宇，3，曹 斌,2，趙秀芹，劉志廣，劉海燦，李桂蓮，萬康林

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種主要經(jīng)呼吸道傳播結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染導(dǎo)致的全身性慢性傳染病，以肺結(jié)核為主，在世界范圍內(nèi)造成了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。疫苗接種可以降低人類結(jié)核病感染的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，在全世界范圍內(nèi)獲批使用的卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin vaccine,BCG)雖然具有部分保護(hù)作用，但未能充分保護(hù)青少年和成人免受結(jié)核分枝桿菌感染[1]。因此，迫切需要開發(fā)新的更有效的抗結(jié)核疫苗。

培養(yǎng)濾液蛋白-10(Culture filtrate protein-10, CFP-10)和早期分泌抗原靶6kDa蛋白(early secretary antigentic target 6kDa protein, ESAT-6)是結(jié)核分枝桿菌基因組RD1區(qū)基因編碼的早期分泌的蛋白質(zhì)，是與毒力相關(guān)的T細(xì)胞蛋白抗原，其T細(xì)胞表位覆蓋率達(dá)100%。CFP10和ESAT6基因在MTB中同時轉(zhuǎn)錄[2]，CFP10位于ESAT6的上游，兩個基因同屬于一個操縱子，由同一個啟動子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。當(dāng)MTB被巨噬細(xì)胞吞噬時，CFP10和ESAT6形成異質(zhì)二聚體(EsxAB)共同分泌[3], 該復(fù)合物可通過CFP10的c端形成的長柔性臂與巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表面特異性結(jié)合[4]，并且CE復(fù)合物可以抑制吞噬溶酶體融合[5]，利于其在宿主細(xì)胞內(nèi)生存，增強致病性分枝桿菌的毒力。因為CFP10與ESAT6具有相同的免疫學(xué)特性，并且在體內(nèi)能按1∶1緊密連接形成雜二聚體[6]，體外模仿這種結(jié)構(gòu)構(gòu)建的CE融合蛋白比單個蛋白在疫苗和診斷方面更具研究和應(yīng)用價值[7-9]。

以往對于CE融合蛋白的研究多集中于蛋白的抗原性與免疫機制方面的研究，CE融合蛋白可以通過皮試診斷結(jié)核感染[10]或者鑒別致敏機體的不同分枝桿菌[11]，以及通過ELISA實驗對結(jié)核病進(jìn)行血清學(xué)輔助診斷[12-14]，并且有研究發(fā)現(xiàn)CE融合蛋白能夠活化巨噬細(xì)胞[15]，在感染早期可能具有重要的抗結(jié)核保護(hù)作用[16]，上述研究證明了CE融合蛋白具有特異的免疫原性，為CE融合蛋白作為免疫優(yōu)勢抗原在結(jié)核病診斷與參與疫苗研制方面提供了一定參考。與CE抗原基因排列順序相反的EC融合蛋白，同樣在血清學(xué)診斷與皮膚試驗中具有良好的表現(xiàn)[17-18]，除此之外還有研究對EC融合蛋白誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答及其保護(hù)力進(jìn)行了評價，通過檢測EC融合蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ與IL-2以及攻擊感染H37Rv后的脾臟菌落計數(shù)認(rèn)為EC可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答[19]，并且融合表達(dá)ESAT6-CFP10蛋白的重組恥垢分枝桿菌能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,并對感染小鼠有一定保護(hù)力[20]。

佐劑與人體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)程度相關(guān)，對亞單位疫苗的質(zhì)量也有著重要影響。研究發(fā)現(xiàn)鋁佐劑以促進(jìn)抗體介導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答為主[21-22]，但其本身不具備免疫原性，而是作為吸附劑起作用。鋁佐劑在疫苗溶液中能強烈吸附抗原形成沉淀[23]，接種此類疫苗后可在機體內(nèi)形成抗原貯存庫，緩釋抗原以延長疫苗發(fā)揮作用的時間，并促進(jìn)注射部位的巨噬細(xì)胞反應(yīng)以及促炎NLRP3通路的激活。鋁佐劑安全性高[24]，目前已廣泛應(yīng)用于人類疫苗中。本研究擬采用鋁佐劑作為給藥系統(tǒng)，探討CE融合蛋白免疫小鼠引起的免疫應(yīng)答特性。

本研究使用CE融合蛋白混合鋁佐劑免疫小鼠，以BCG免疫組為陽性對照、PBS免疫組作為空白對照、單純鋁佐劑免疫組為陰性對照，結(jié)合體外MGIA及小鼠特異性抗體和9種細(xì)胞因子變化，初步評價CE免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和載體 H37Rv (ATCC 27294)、BCG-China (D2PB302)、含MTB融合蛋白CE對應(yīng)基因的重組pET32a(+)質(zhì)粒與含重組質(zhì)粒的E.coliBL21(DE3)大腸桿菌均由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳代、培養(yǎng)和保存。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鋁佐劑(簡稱鋁佐劑)購自美國賽默飛世爾科技公司，小鼠IFN-γ與IL-4檢測ELISpot預(yù)包被板購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，Luminex多細(xì)胞因子檢測試劑盒購自美國RD-Biotechne公司，小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a抗體購自蘇州博奧龍科技有限公司。

1.1.3 BABL/c小鼠 6～8周齡、雌性、SPF級, 購自維通利華公司，飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心動物中心。

1.2 方 法

1.2.1 CE抗原的誘導(dǎo)與表達(dá)純化 實驗室前期已將CFP10與ESAT6編碼基因串聯(lián)，并經(jīng)EcoR I與Hind III酶切位點連接在pET32a(+)質(zhì)粒上，構(gòu)成重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)大腸桿菌。本實驗挑取LB固體平板生長的新鮮重組菌落加入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床擴菌培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8，向菌液中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-d-galactoside，IPTG，終濃度為1 mmol/L)，繼續(xù)振搖培養(yǎng)誘導(dǎo)4 h。提取重組菌中蛋白并用SDS-PAGE確認(rèn)目的蛋白表達(dá)后，用Ni-NTA層析進(jìn)行純化，使用ToxinEraser內(nèi)毒素清除試劑盒去除重組蛋白中的內(nèi)毒素，然后使用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度后用0.22 μm濾器過濾除菌，用PBS將蛋白稀釋定量至333 μg/mL。

1.2.2 BCG的菌落計數(shù)與全菌蛋白提取

1.2.2.1 BCG-China菌懸液 刮取生長于羅氏培養(yǎng)基的新鮮BCG-China菌落置于PBS中，用超聲分散儀分散菌體：1)調(diào)整其濃度至OD600值為1后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，將不同稀釋度的菌液涂布7H10平板，兩周后獲得各稀釋濃度的細(xì)菌計數(shù)(CFU)，計算出OD600=1的菌液對應(yīng)的菌落個數(shù)，用于推算實驗中使用的菌落數(shù)；2)反復(fù)離心洗滌后用PBS調(diào)整菌液濃度為5×106/mL，用于免疫小鼠。

1.2.2.2 BCG-China全菌蛋白提取 從羅氏培養(yǎng)基上刮取適量新鮮菌體，PBS反復(fù)清洗后，80 ℃水浴滅活，冰上超聲，隨后離心收集上清液，測定上清液中的全菌蛋白濃度后用0.22 μm濾器將蛋白過濾除菌。

1.2.3 小鼠免疫 將BALB/c小鼠隨機分為4組，每組6只。CE組，每只每次免疫采用含25%(體積百分濃度，V/V)鋁佐劑的333 μg/mL CE蛋白/鋁佐劑混合物200 μL；陰性對照組即佐劑組，每只每次免疫采用含25%(V/V)鋁佐劑的0.01 mol/L pH7.2 PBS 200 μL；空白對照組，每只每次免疫采用0.01 mol/L pH7.2 PBS 200 μL；陽性對照即BCG組，免疫采用BCG菌液200 μL (5×106個菌/mL)[19]。 一免前采集小鼠本底血，BCG組小鼠于背部皮下多點注射免疫1次。其余各組小鼠于第1、11和21 d分3次背部皮下多點注射免疫。末次免疫結(jié)束后7 d統(tǒng)一處死所有BALB/c小鼠，采集血液和脾臟標(biāo)本，進(jìn)行免疫學(xué)檢測。

1.2.4 體液免疫水平檢測 采用ELISA法測定小鼠血清中特異性總IgG以及IgGl和IgG2a的抗體滴度。用2 μg/mL的CE融合蛋白或BCG全菌蛋白作為抗原，每孔100 μL包被96孔ELISA板，一抗為PBS倍比稀釋的免疫試驗小鼠血清，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和IgG1、IgG2a抗體。OD600值大于佐劑組或PBS組血清的2.1倍時，即是(蛋白免疫組OD600值-同體本底OD600值)/(佐劑組OD600值-同體本底OD600值)>2.1，結(jié)果判定為陽性，該樣品的稀釋倍數(shù)為對應(yīng)的抗體滴度。每次試驗設(shè)置復(fù)孔，并檢測3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5 ELISpot法檢測IFN-γ與IL-4的分泌情況 小鼠處死后，用淋巴細(xì)胞分離液提取脾臟淋巴細(xì)胞，調(diào)整淋巴細(xì)胞至終濃度為1×106個細(xì)胞/mL。按照ELISpot預(yù)包被板的說明書操作，活化板子后每孔加入100 μL細(xì)胞。CE和佐劑組細(xì)胞均用2 μg CE融合蛋白抗原刺激，BCG組細(xì)胞用2 μg BCG全菌蛋白抗原刺激，PBS組用2 μg CE融合蛋白抗原刺激。每組均設(shè)陽性對照孔和空白對照孔，分別加入500 ng ConA和100 μL培養(yǎng)基。將上述處理后的細(xì)胞置37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)20 h后，加入生物素標(biāo)記的IFN-γ與IL-4抗體以及酶聯(lián)親和素，進(jìn)而檢測分泌特異性IFN-γ與IL-4的細(xì)胞數(shù)。每次試驗設(shè)置復(fù)孔，并檢測3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.6 Luminex細(xì)胞因子檢測 準(zhǔn)備96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL濃度為1×106個細(xì)胞/mL的小鼠脾淋巴細(xì)胞。CE和佐劑組細(xì)胞均用10 μg CE融合蛋白抗原刺激，BCG組用10 μg BCG全菌蛋白抗原刺激，PBS組用10 μg CE融合蛋白抗原刺激。將以上細(xì)胞置37 ℃、5% CO2靜置培養(yǎng)20 h后，收集孔內(nèi)液體與細(xì)胞。按照小鼠多重細(xì)胞因子分析試劑盒的說明書操作，同時檢測IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-12p70、IL-6、IL-10、IL-4和IL-17/IL-17A共9種細(xì)胞因子的表達(dá)水平。簡言之，向96孔檢測板每孔加入50 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品后，各加入50 μL微球混合物，室溫震蕩培養(yǎng)2 h后，分別孵育生物素抗體以及PE標(biāo)記鏈霉親和素，進(jìn)而檢測各孔的細(xì)胞因子濃度。每次試驗設(shè)置復(fù)孔，并檢測3個生物學(xué)重復(fù)。

1.2.7 結(jié)核分枝桿菌體外生長抑制試驗 收集小鼠脾淋巴細(xì)胞，用含1×非必需氨基酸、10 mmol/L Hepes、1 mmol/L丙酮酸鈉和5×10-5M 2-巰基乙醇的完全1640細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個細(xì)胞/mL。從羅氏培養(yǎng)基刮下新鮮的H37Rv，用重懸細(xì)胞的完全1640細(xì)胞培養(yǎng)基梯度稀釋H37Rv，并于1 h內(nèi)將500 μL 100 CFU/mL 的H37Rv添加到含500 μL 2×106個脾細(xì)胞/mL的24孔板中，置37 ℃、5% CO2共培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)第4 d時取出24孔板，收集每孔的培養(yǎng)物離心棄上清。同時向24孔板每孔加入500 μL無菌組織培養(yǎng)級水，室溫孵育至少5 min，然后將水完全移出，加到上述沉淀中，進(jìn)行10倍和100倍稀釋，然后將原液與稀釋后的樣品涂布7H10平板，每組脾細(xì)胞檢測均設(shè)置復(fù)孔，并檢測4個生物學(xué)重復(fù)。約14 d后計算每板CFU (colony-forming unit)數(shù)，最終實驗數(shù)據(jù)以每孔樣品的log10CFU表示并進(jìn)行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白的純化結(jié)果 SDS-PAGE結(jié)果顯示，CE融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達(dá)(圖1)。重組蛋白分子中含有的質(zhì)粒pET-32a上攜帶的融合表達(dá)的His標(biāo)簽、S標(biāo)簽和Trx標(biāo)簽(分子量共約為19 kDa)。包含標(biāo)簽的重組蛋白CE，總分子量約為40 kDa，電泳結(jié)果顯示蛋白分子量與預(yù)期相符且純度較高(圖1)，可用于后續(xù)的免疫實驗。

注：圖中M為蛋白Marker；列1為未誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的pET32a-CE；列2,3分別為誘導(dǎo)后的pET32a-CE經(jīng)超聲離心的包涵體沉淀和上清；列4為純化后的重組蛋白CE。圖1 SDS-PAGE分析重組蛋白CE的表達(dá)純化結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE analysis of the purification and expression of recombinant protein CE

2.2 抗原的特異性體液免疫應(yīng)答 由于佐劑免疫組與PBS組在ELISA檢測中吸光度相近且較低，我們選擇前者作為陰性對照組。CE組誘導(dǎo)的特異性IgG、IgG1和IgG2a滴度均高于陰性對照組；且前者的IgG1與IgG2a水平均高于BCG組(t值分別為19.1和8.7，P值均<0.000 1)，見圖2A，但兩組間IgG水平和IgG1/IgG2a值的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2.1vs.2.0，t=0.87，P>0.05)，見圖2B。

注：(A) CE組和BCG組總IgG、IgG1和IgG2a抗體滴度的比較結(jié)果；(B) CE組和BCG組抗體IgG1/IgG2a的比較結(jié)果。④P<0.000 1。圖2 CE與BCG免疫BALB/c小鼠血清IgG、IgG1和IgG2a的比較Fig.2 Comparisons on the IgG, IgG1 and IgG2a isotypes in the sera between CE and BCG immunized BALB/c mice

2.3 不同免疫組分泌IFN-γ與IL-4的細(xì)胞數(shù)檢測 CE組分泌IFN-γ與IL-4的斑點形成細(xì)胞(Spot Forming Cell，SFC)數(shù)均分別高于PBS組與佐劑組；CE組與BCG組相比，分泌IFN-γ的SFC數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.4，P>0.05)，見圖3A，但CE組分泌IL-4的SFC數(shù)高于BCG組(t=8.0,P<0.000 1)，見圖3B。

注：A. 小鼠脾細(xì)胞經(jīng)體外抗原刺激后產(chǎn)生的IFN-γ的SFC數(shù)；B. 產(chǎn)生的IL-4的SFC數(shù)。CE組和BCG組之間的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異用兩組間線上的數(shù)字表示，CE組與PBS組和佐劑組之間的統(tǒng)計學(xué)差異用PBS組和佐劑組柱上的數(shù)字表示，①P<0.05, ④P<0.000 1。圖3 不同免疫組的BALB/c小鼠分泌IFN-γ與IL-4的細(xì)胞數(shù)差異Fig.3 Difference of IFN-γ- and IL-4-secreting cells between BALB/c mice in different immune groups

2.4 不同免疫組細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測 用LUMINEX檢測不同免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)CE或BCG全菌蛋白刺激后9種細(xì)胞因子表達(dá)水平的組間差異。如圖4所示， CE組刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的9種細(xì)胞因子均高于PBS和佐劑組。CE組刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4高于BCG組(tGM-CSF=8.4，P<0.000 1；tIL-6=8.3，P<0.000 1；tIL-10=2.5，P<0.05；tIL-4=7.0，P<0.000 1)，而IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12 p70、IL-17/IL-17A等細(xì)胞因子未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，然而，CE組的IFN-γ/IL-4值低于BCG組(2.3vs6.1,t=3.4,P<0.05)。

注：小鼠脾細(xì)胞經(jīng)體外抗原刺激后產(chǎn)生的A. IFN-γ濃度；B. TNF-α濃度；C. GM-CSF濃度；D. IL-2濃度；E. IL-12 p70濃度；F. IL-6濃度；G. IL-10濃度；H. IL-4濃度；I. IL-17/IL-17A濃度。CE組與BCG組之間的統(tǒng)計學(xué)差異用兩組間線上的數(shù)字表示，CE組與PBS組和佐劑組之間的差異用PBS組和佐劑組柱上方的數(shù)字表示，①P<0.05, ②P<0.01, ③P<0.001, ④P<0.000 1。圖4 免疫小鼠脾細(xì)胞釋放的抗原特異性細(xì)胞因子水平Fig.4 Antigen specific cytokine levels released from the splenocytes of the immunized mice

2.5 不同免疫組的分枝桿菌體外生長抑制試驗結(jié)果 將不同免疫組的脾細(xì)胞與分枝桿菌共培養(yǎng)4 d后，用水裂解細(xì)胞釋放胞內(nèi)的分枝桿菌并涂板，計算結(jié)核分枝桿菌生長菌落數(shù)，并比較不同組間菌落數(shù)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CE組CFU數(shù)均低于PBS與佐劑組(tPBS=8.2，t佐劑組=7.4，均P<0.000 1)，CE組與BCG組間的CFU數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.8，P>0.05，圖5)。

注：小鼠脾細(xì)胞體外與H37Rv共培養(yǎng)后，各免疫組的分支桿菌生長抑制情況，CE組與PBS組和佐劑組之間的差異用PBS組和佐劑組柱上方的數(shù)字表示，④P<0.000 1。圖5 免疫小鼠體外抑制分枝桿菌生長的結(jié)果Fig.5 Results of in vitro inhibition of Mycobacterium tuberculosis growth in immunized mice

3 討 論

亞單位疫苗的主要缺點之一是單一抗原導(dǎo)致的弱免疫原性，因而將強免疫原性的蛋白融合表達(dá)是提高蛋白疫苗免疫原性和保護(hù)效率的有效策略[24]。ESAT6具有潛在的溶細(xì)胞活性，曾有研究將ESAT6與Ag85B一同構(gòu)建融合蛋白，此舉雖然減弱了ESAT6的細(xì)胞溶解活性，提高了抗原的免疫原性，但是沒有明顯提高免疫保護(hù)作用[25]。CFP10和ESAT6兩個基因位置毗鄰，能夠同時轉(zhuǎn)錄，協(xié)同表達(dá)，并在功能上也以復(fù)合物的形式發(fā)揮作用[4]。CFP10與ESAT6的單個蛋白分子量較小，但兩者串聯(lián)融合后分子量增大，穩(wěn)定性較好，有利于提高蛋白的免疫原性。有研究將CFP10和ESAT6這兩個強T細(xì)胞免疫優(yōu)勢抗原融合表達(dá)，形成保持在結(jié)核分枝桿菌中的天然位置順序的CE融合蛋白，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)具有良好的抗原性[26]，且被證明能夠輔助診斷結(jié)核[14,27]。為系統(tǒng)評價2個蛋白融合后的免疫反應(yīng)表現(xiàn)，本研究使用CE融合蛋白，并結(jié)合傾向誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)的鋁佐劑免疫小鼠，以初步探討CE融合蛋白的免疫效果。

雖然人體對MTB的防御以細(xì)胞免疫為主，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)體液免疫與細(xì)胞免疫相互協(xié)調(diào)，共同參與對MTB的免疫防御：與抗體結(jié)合的MTB復(fù)合物更容易被巨噬細(xì)胞通過結(jié)晶段受體(FcRs)和補體受體吞噬[28]；針對MTB的特異性抗體可促進(jìn)吞噬溶酶體融合；MTB特異性抗體也可通過自然殺傷(NK)細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒性刺激殺傷MTB感染的宿主細(xì)胞，此外，MTB特異性抗體可能具有直接殺滅菌體的能力或中和活性，這種特異性抗體已被證明能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞中的炎性小體激活。我們的研究結(jié)果表明，CE融合蛋白免疫小鼠后可誘導(dǎo)高水平的抗原特異性IgG、IgG1和IgG2a的分泌。IgG2a是CD4+Th1型抗體，而IgG1是CD4+Th2型抗體，當(dāng)IgG1/IgG2a比值大于1時，免疫反應(yīng)傾向于Th2型。本研究雖然CE融合蛋白誘導(dǎo)的IgG1與IgG2a水平均高于BCG組，但CE組與BCG組的IgG1/IgG2a比值均大于1，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義, 表明CE誘導(dǎo)了類似BCG的偏向CD4+Th2型的細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示CE融合蛋白與鋁佐劑混合具有較強誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力。

本研究利用ELISpot和ELISA技術(shù)檢測了與機體免疫防御MTB有關(guān)的9種細(xì)胞因子，包括IFN-γ，TNF-α，GM-CSF，IL-2，IL-12p70，IL-6，IL-10，IL-4和IL-17/IL-17A。目前已知樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞在機體先天免疫和適應(yīng)性免疫之間中具有重要的作用。粒細(xì)胞-巨噬T細(xì)胞分泌的細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的增殖和成熟[29]，成熟的樹突狀細(xì)胞可分泌多種已被證實具有保護(hù)作用的細(xì)胞因子如IL-12、TNF-α和IFN-γ，這些細(xì)胞因子作用于天然CD4+T細(xì)胞(Th0細(xì)胞)使其分化為Th1細(xì)胞。Th1細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ、IL-2和TNF-α能有效激活CD8+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞通過產(chǎn)生穿孔素、顆粒酶、活性氧和活性氮等清除細(xì)胞內(nèi)MTB。成熟的樹突狀細(xì)胞還可以產(chǎn)生IL-4，使Th0細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞，Th2細(xì)胞通過分泌IL-4、IL-5和IL-10等介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，從而影響B(tài)淋巴細(xì)胞的功能[30]。此外，促炎細(xì)胞因子IL-17的產(chǎn)生以及Th17的反應(yīng)性對于控制小鼠MTB感染很重要，IL-17可誘導(dǎo)多種分子的產(chǎn)生[31]，包括與粒細(xì)胞生成、中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞募集和先天免疫反應(yīng)相關(guān)的促炎細(xì)胞因子(如IL-6、TNF-α和IL-1β，這些參與巨噬細(xì)胞向促炎性殺菌Ⅰ型極化的細(xì)胞因子，可將單核細(xì)胞招募到感染損傷部位并激活單核細(xì)胞參與殺死病原體，從而啟動抑制分枝桿菌生長的一系列事件)和一些趨化因子及抗菌分子。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CE組誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-γ無論是檢測SFC數(shù)量還是細(xì)胞因子濃度，與BCG組比較，均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但是CE組IL-4的SFC數(shù)量以及細(xì)胞因子濃度均高于BCG組，且CE組的IFN-γ/IL-4 比值顯著低于BCG組，表明雖然實驗使用了誘導(dǎo)偏向CD4+Th2型細(xì)胞免疫的鋁佐劑，CE抗原經(jīng)細(xì)胞因子檢測仍舊體現(xiàn)出類似BCG免疫的偏向CD4+Th1型的細(xì)胞免疫反應(yīng)，只是程度稍弱，因此CE抗原與鋁佐劑混合免疫引起了Th1與Th2混合型免疫反應(yīng)。此外，CE組誘導(dǎo)產(chǎn)生了與BCG組相同水平的保護(hù)性細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12、IL-17，而且CE組誘導(dǎo)產(chǎn)生的GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4高于BCG組，表明了CE融合蛋白與鋁佐劑混合免疫，具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。

目前尚無明確的可評價肺結(jié)核保護(hù)性免疫的相關(guān)檢測指標(biāo)，因此常采用觀察接種疫苗動物經(jīng)攻毒實驗后，抑制分枝桿菌復(fù)制能力的方法來評價疫苗保護(hù)效果。而且由于MTB的胞內(nèi)生存方式，能夠抑制體內(nèi)分枝桿菌復(fù)制的免疫反應(yīng)從邏輯上可定義為保護(hù)性反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)體外分枝桿菌生長抑制試驗(Mycobacterial growth inhibion assay，MGIA)可將多種體外功能試驗與保護(hù)效果相聯(lián)系，如從BCG免疫小鼠的脾細(xì)胞可觀察到重復(fù)的分枝桿菌生長抑制現(xiàn)象，并且抑制效果與免疫后攻毒實驗的體內(nèi)抑菌效果一致[32]。因此，借助MGIA評價疫苗效果被認(rèn)為是選擇候選疫苗或快速進(jìn)入昂貴的疫苗臨床開發(fā)階段的篩選策略[33]。需要注意的是，盡管MGIA實驗有一定的評價效果，但其還不能取代體內(nèi)攻毒實驗。

采用MGIA觀察疫苗抑制MTB增殖的效果，雖然與免疫-動物攻毒-細(xì)菌載量評價具有一定的差距，但也為抗原的免疫保護(hù)性能預(yù)測提供了一定的依據(jù)。本研究的MGIA結(jié)果顯示，CE組小鼠脾淋巴細(xì)胞與H37Rv共培養(yǎng)后的CFU均顯著低于PBS與佐劑組，表明CE組可以在體外抑制H37Rv的生長，并且CE組的CFU與BCG組未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明這種體外抑制程度與BCG組相當(dāng)，提示CE融合蛋白與鋁佐劑混合免疫具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗MTB感染免疫保護(hù)性的能力。

綜上所述，在對CFP10和ESAT6串聯(lián)融合表達(dá)的CE融合抗原免疫小鼠效果的初步探索中，我們發(fā)現(xiàn)CE融合抗原具有良好的免疫原性，與鋁佐劑混合使用可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類似BCG的Th1與Th2混合型免疫反應(yīng)，并且具有與BCG免疫相當(dāng)?shù)捏w外抑制MTB生長的能力，表明CE具有良好的結(jié)核疫苗研制應(yīng)用價值，可作為研制結(jié)核病新疫苗的候選成分之一，為進(jìn)一步研究結(jié)核病新疫苗提供了科學(xué)基礎(chǔ)。本研究檢測了與機體免疫防御MTB有關(guān)的9種細(xì)胞因子，并使用了鋁佐劑增強免疫效果，但是本研究僅對于各項檢測指標(biāo)在免疫后29 d進(jìn)行了檢測，而且本次研究使用了同一批次的小鼠并在評估CE抑制MTB生長的能力的時候使用了MGIA這一體外實驗，因此在后續(xù)的研究中我們將進(jìn)行不同批次小鼠的免疫，檢測多個時間點，并進(jìn)一步采用體內(nèi)攻毒實驗觀察CE聯(lián)合其他免疫優(yōu)勢抗原接種動物模型后是否使其擁有抑制MTB在體內(nèi)生長的能力，并進(jìn)行免疫效果的評價。

利益沖突：無

引用本文格式：欒秀麗，范雪亭，王瑞歡，等. 結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白免疫小鼠效果初步評價[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(7)：589-596. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.093