周裕貴，孫竹林，宋亞軍，牟 榮，張平平，楊瑞馥，

鼠疫屬于人獸共患的自然疫源性疾病，是《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病，在歷史上曾發(fā)生過(guò)的3次世界性大流行，給人類帶來(lái)深重的災(zāi)難。近些年來(lái)鼠疫病例主要集中于非洲[1]，但現(xiàn)代交通對(duì)傳染病的快速傳播以及我國(guó)自然疫源地的存在，使得鼠疫仍對(duì)我國(guó)人民健康存在巨大的潛在威脅。鼠疫耶爾森菌(Yersiniapestis)是鼠疫的病原體。鼠疫菌的莢膜抗原即F1(fraction 1)抗原的抗原性和特異性較好，因此抗F1抗體是鼠疫疫苗研制和免疫診斷的重要靶標(biāo)。但F1抗原的提取和純化較困難，不利于鼠疫抗體檢測(cè)方法的建立。

基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology based later flow assay, UPT-LF)的檢測(cè)方法，采用上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(up-converting phosphor particles，UCP)作為免疫層析的新型標(biāo)記物[2]，具有靈敏度高和不易受干擾等特點(diǎn)。此前，我們基于雙抗原夾心模式建立了以鼠疫抗體為檢測(cè)靶標(biāo)的UPT-LF方法，即在分析膜和結(jié)合墊上均使用了依照《中國(guó)生物制品規(guī)程》收錄方法制備的F1抗原。由于此F1抗原可能不是該方法的最適抗原，其靈敏度較差。因此，本研究重新收集了另3種來(lái)源的F1抗原，即分別為依據(jù)生物制品規(guī)程優(yōu)化方法制備的F1抗原、依據(jù)文獻(xiàn)提取的F1抗原[3]和重組F1抗原，將其用于優(yōu)化基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)鼠疫抗體的方法，并進(jìn)行優(yōu)化后評(píng)價(jià)。首先用基于間接檢測(cè)模式的酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法評(píng)價(jià)了4種F1抗原的效價(jià)，并將依據(jù)《中國(guó)生物制品規(guī)程》收錄方法改進(jìn)制備的F1抗原免疫家兔制備了相應(yīng)的兔抗F1抗體；然后以該兔抗F1抗體作為質(zhì)控品，將4種F1分別用于分析膜和結(jié)合墊的制備并兩兩組合制備多種試紙，進(jìn)行UPT-LF方法適用抗原的篩選，優(yōu)化了UPT-LF鼠疫抗體檢測(cè)方法；使用F1抗原疫苗接種者血清和各種鼠疫菌株兔免血清進(jìn)行評(píng)價(jià)，并使用全菌免疫獲得的兔多抗和羊多抗將UPT-LF和ELISA方法進(jìn)行了靈敏度比較。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用的F1抗原共有4種，重組F1抗原(簡(jiǎn)稱為“rF1”)、依據(jù)2000年版的《中國(guó)生物制品規(guī)程》收錄的制備方法進(jìn)行制備的天然F1抗原(簡(jiǎn)稱為“F1-1”)、對(duì)《生物制品規(guī)程》收錄的方法進(jìn)行改進(jìn)獲得的天然F1抗原(簡(jiǎn)稱為“F1-2”)(簡(jiǎn)稱為“F1-2”)、軍事醫(yī)學(xué)研究院提取的天然F1抗原(簡(jiǎn)稱為“F1-3”)。本研究中所用的兔抗F1-2多抗、兔抗EV76多抗、羊抗EV76多抗均為軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所未知病原分析微生物研究室制備；兔抗EV76和羊抗EV76多抗是指使用鼠疫菌EV76株分別全程免疫大耳白兔和綿羊后獲得血清，并經(jīng)硫酸銨沉淀初步純化的多抗。 F1抗原亞單位疫苗接種者的血清、F1免疫兔血清來(lái)源于蘭州生物制品所。鼠疫菌EV株(CMCC52006)兔免血清、鼠疫菌O614F株兔免血清、鼠疫菌Tjiusidej(R)株(CMCC52010株)兔免血清、鼠疫菌201株兔免血清來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，以上血清均按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《鼠疫診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS279-2008)中的ELISA方法進(jìn)行了滴定。

1.2 間接ELISA法評(píng)價(jià)不同F(xiàn)1抗原 使用含有1%酪蛋白的0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)，將F1免疫兔血清稀釋為1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶12 800、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800；將3株兔抗EV76多抗、1株羊抗EV76分別稀釋為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6和7.8 μg/L，稀釋完備用。

用碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(0.05 mol/L, pH 9.6)稀釋F1抗原至終濃度1 mg/L，以100 μL/孔加至酶聯(lián)板上，4 ℃過(guò)夜包被，移除液體后拍干；每孔加入200 μL 0.1%干酪素，37 ℃封閉2 h，移除液體后拍干。加入100 μL上述稀釋的血清或抗體，37 ℃孵育30 min。使用含有0.5‰的Tween的0.1 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行清洗后拍干。加入HRP-二抗(羊抗兔; 兔抗羊)，反應(yīng)20 min，清洗拍干。最后加入反應(yīng)底物TMB后顯色，終止反應(yīng)后測(cè)定D值。本研究中ELISA的閾值(即cutoff)統(tǒng)一設(shè)定為0.2。

1.3 兔抗F1-2抗體的制備 將1 mL F1抗原和1 mL佐劑混合乳化后，在大耳白兔的腹股溝皮下(共4處)注射。前3次免疫的間隔時(shí)間為2周，劑量分別為200 μg、400 μg和800 μg；第4次免疫時(shí)無(wú)佐劑，劑量為1 mg。第4次免疫7 d后，使用戊巴比妥安樂(lè)處死大耳白兔。采用頸動(dòng)脈放血法收集的兔血清，并用正辛酸-飽和硫酸銨法提取血清中的多抗。使用終濃度1 mg/L的4種F1抗原包被的酶聯(lián)板，測(cè)試免疫各階段的血清及多抗的效價(jià)。

1.4 UPT試紙的優(yōu)化 以兔抗F1為C帶，以不同的F1抗原作為檢測(cè)帶(T帶)，以UCP-F1抗原為結(jié)合墊，優(yōu)化基于雙抗原夾心的UPT鼠疫抗體檢測(cè)方法。將本研究制備的兔抗F1-2以2 g/L的終濃度包被于硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜作為質(zhì)控(control，C)帶，將2.5 g/L的rF1，F(xiàn)1-1、F1-2和F1-3分別包被于NC膜作為檢測(cè)(test，T)帶，制作4種分析膜。將rF1、F1-1、F1-2和F1-3分別和UCP偶聯(lián)，BSA封閉后，將偶聯(lián)物噴灑于玻璃纖維上，37 ℃烘干制作成四種結(jié)合墊。將以上分析膜和結(jié)合墊分別配對(duì)，組合為16種試紙。從16組試紙中選出9組，使用正常兔血清和健康人血清分別稀釋兔抗F1-2進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試時(shí)，將正常兔血清(或健康人血清)與樣品處理液以1∶9比例混合，取100 μL上樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果作為陰性對(duì)照；將兔抗F1-2多抗使用正常兔血清(或健康人血清)稀釋為10 mg/L和1 mg/L作為陽(yáng)性樣本, 同樣與樣品處理液以1∶9比例混合，取100 μL上樣檢測(cè)。 陽(yáng)性樣本中含抗F1抗體，加樣后首先被UCP-F1抗原捕獲形成UCP-F1抗原-抗F1抗體復(fù)合物，此復(fù)合物和UCP-F1抗原繼續(xù)向吸水墊側(cè)涌動(dòng)，前者被T帶捕獲形成固相F1抗原-抗F1抗體-F1抗原-UCP復(fù)合物，后者被C帶捕獲形成固相兔抗F1抗體-F1抗原-UCP復(fù)合物，T帶和C帶因均含UCP的復(fù)合物的存在而形成信號(hào)；陰性樣本只在C帶形成特異性信號(hào)。T帶和C帶信號(hào)的比值，即T/C值，定義為UPT-LF的檢測(cè)值。計(jì)算每組試紙的陽(yáng)性樣本的T/C值(positive，簡(jiǎn)稱P)與陰性對(duì)照血清T/C值(negative，簡(jiǎn)稱N)的差值再與N的比值，即(P-N)/N，比較試紙的檢測(cè)效果。挑選(P-N)/N 值最優(yōu)組，確定鼠疫抗體檢測(cè)方法的原料，并將該條件建立的UPT檢測(cè)方法稱為YPAb-UPT-LF。

1.6 UPT試紙的覆蓋度評(píng)價(jià) 選用F1抗原亞單位疫苗接種者的血清、鼠疫菌EV株(CMCC52006)兔免血清、鼠疫菌O614F株兔免血清、鼠疫菌Tjiusidej(R株)(CMCC52010)兔免血清和鼠疫菌201株兔免血清，評(píng)價(jià)YPAb-UPT-LF的覆蓋度。所有陽(yáng)性血清樣本均用健康人血清稀釋10倍或100倍后，將樣本與樣品處理液以1∶9比例混合，取100 μL上樣檢測(cè)。

1.7 與ELISA的對(duì)比 將500 μL健康人血清和4.5 mL樣品處理液混合作為樣本稀釋液，將F1免疫兔血清進(jìn)行1∶10、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶12 800、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200、1∶102 400、1∶204 800和1∶409 600倍比稀釋；將兔抗EV76多抗-3稀釋為終濃度為1 000、500、250、125和62.5 μg/L的待測(cè)液體；將羊抗EV76多抗稀釋為終濃度為500、250、125和62.5 μg/L的液體，取100 μL上樣于UPT-LF試紙，進(jìn)行YPAb-UPT-LF檢測(cè)。在實(shí)際應(yīng)用中，樣本需用樣本處理液進(jìn)行10倍稀釋后再進(jìn)行YPAb-UPT-LF檢測(cè)，因此將各血清和多抗的終濃度提高10倍表示各濃度下YPAb-UPT-LF的實(shí)際檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 不同F(xiàn)1抗原的評(píng)價(jià) 將4種F1抗原，即重組F1、生物制品規(guī)程中的方法F1-1、規(guī)程改良方法F1-2和依據(jù)文獻(xiàn)方法提取的F1-3，按照1 mg/L的濃度包被，使用ELISA法評(píng)價(jià)其對(duì)兔血清(含兔抗F1-2多抗)、3株兔抗EV76多抗和1株羊抗EV76多抗。結(jié)果顯示，4種F1抗原包被條件下的ELISA檢測(cè)，均能對(duì)全菌免疫的兔多抗、全菌免疫的羊多抗以及F1免疫的兔血清具有較高檢測(cè)值，表明抗原性良好(圖1和表1)。其中，rF1和F1-3的效果稍好于另兩種F1抗原，這也是接下來(lái)能使UPT-LF檢測(cè)方法靈敏度更優(yōu)的兩種抗原。

A為F1免疫兔血清的檢測(cè)值； B、C、D為3株兔抗EV76多抗的檢測(cè)值；E為1株羊抗EV76的檢測(cè)值。圖1 ELISA法評(píng)價(jià)4種F1抗原Fig.1 Evaluation of four F1 antigen by ELISA method

表1 4種F1抗原包被的ELISA分別測(cè)定F1免疫兔血清和幾種EV76多抗的檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Anti-F1 rabbit serum titers and several anti-EV76 polyclonal antibodies titers determined by ELISA methods coated with four F1 antigen

2.2 兔抗F1抗體的制備 選用《生物制品規(guī)程》收錄的方法制備改進(jìn)獲得的天然F1抗原，即F1-2，免疫大耳白兔制備兔抗F1抗體，4次免疫劑量分別為200、400、800 和1 000 μg。第2次和第3次免疫后的血清效價(jià)分別為1∶51 200和1∶102 400。純化后的兔抗F1-2抗體，使用rF1、F1-1、F1-2、F1-3包被的酶聯(lián)板進(jìn)行測(cè)試，其ELISA效價(jià)分別為62.5、62.5、62.5和31.25 μg/L，表明多抗質(zhì)量良好。此多抗后續(xù)用于UPT試紙質(zhì)控帶的制備，并用做UPT-LF鼠疫抗體檢測(cè)方法的質(zhì)控品。

圖2 本研究制備的兔抗F1-2的ELISA效價(jià)Fig.2 Rabbit anti-F1-2 polyclonal antibody titers determined by ELISA

2.3 UPT試紙的優(yōu)化 以rF1、F1-1、F1-2和F1-3分別作為T(mén)帶包被抗原制備分析膜，同時(shí)這4種抗原分別和UCP顆粒偶聯(lián)制備結(jié)合墊，將這些分析膜和結(jié)合墊進(jìn)行兩兩組合制備16種試紙，使用兔抗F1-2多抗測(cè)試，進(jìn)行UPT適用抗體的初篩。根據(jù)測(cè)試結(jié)果從16組試紙中選出9組，以正常兔血清或健康人血清用樣品處理液稀釋10倍后上樣檢測(cè)的結(jié)果作為陰性對(duì)照。將兔抗F1-2分別用正常兔血清或健康人血清稀釋至終濃度為1 mg/L和10 mg/L后，再用樣品處理液稀釋10倍進(jìn)行測(cè)試，計(jì)算每組試紙的陽(yáng)性T/C值(簡(jiǎn)稱P)與陰性T/C值(簡(jiǎn)稱N)的差值再與N的比值(即(P-N)/N)，其值越大表明陽(yáng)性樣本的T/C值和陰性樣本的T/C值的差異越大，即相應(yīng)試紙的靈敏度越好。結(jié)果表明，當(dāng)結(jié)合墊中為UCP顆粒和rF1的偶聯(lián)物，而分析膜上為F1-3蛋白時(shí)，其靈敏度最好(圖3)。本研究將其作為優(yōu)化后的UPT方法，將其命名為YPAb-UPT-LF。YPAb-UPT-LF可檢出血清樣本中1 mg/L兔抗F1抗體質(zhì)控品。

M代表分析膜，P代表結(jié)合墊。正常兔血清(A)和健康人血清(B)系列稀釋兔抗F1-2多抗的UPT檢測(cè)結(jié)果圖3 4種F1抗原分別作為UPT-LF方法中的包被或標(biāo)記蛋白的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of UPT-LF with four F1 antigens as the coated or labeled antibody for the strips, respective

在圖3中，結(jié)合墊中與UCP顆粒偶聯(lián)的蛋白和分析膜中的蛋白均為F1-1的條件，為未優(yōu)化之前的UPT-LF方法，其對(duì)質(zhì)控品的靈敏度僅為10 mg/L。這表明UPT-LF檢測(cè)方法經(jīng)優(yōu)化后靈敏度提高了10倍。

以健康人血清為樣本，經(jīng)樣品處理液10倍稀釋后，使用YPAb-UPT-LF進(jìn)行10次測(cè)試，將10次測(cè)量的平均值加3倍的標(biāo)準(zhǔn)差，作為試紙的cutoff值。T/C值高于cutoff值的待測(cè)樣本被判定為陽(yáng)性樣本，反之為陰性樣本。經(jīng)計(jì)算，YPAb-UPT-LF的cutoff值為0.25(圖4)。以下研究中所有待測(cè)陽(yáng)性血清樣本均用健康人血清稀釋10倍或100倍，然后再用試劑的樣品處理液稀釋10倍后進(jìn)行YPAb-UPT-LF測(cè)試。對(duì)于系列稀釋的陽(yáng)性樣本，將高于cutoff值的最低濃度值定義為YPAb-UPT-LF的檢測(cè)靈敏度。

2.4 YPAb-UPT-LF覆蓋度評(píng)價(jià) 健康人血清10倍或100倍稀釋F1抗原亞單位疫苗接種者的血清以及多種鼠疫菌菌株[EV株(CMCC52006)、O614F株、Tjiusidej(R)株(CMCC52010)和201株]免疫兔血清，再用樣品處理液稀釋10倍后，使用YPAb-UPT-LF檢測(cè)。YPAb-UPT-LF對(duì)用健康人血清100倍稀釋后的各陽(yáng)性樣本檢測(cè)T/C值均高于cutoff，為弱陽(yáng)性結(jié)果；而對(duì)用健康人血清10倍稀釋后的各陽(yáng)性樣本可獲得強(qiáng)陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果(圖4)。這表明YPAb-UPT-LF方法具有良好的檢測(cè)覆蓋度。

圖4 YPAb-UPT-LF的檢測(cè)覆蓋度Fig.4 The coverage of YPAb-UPT-LF for detection of various serum

2.5 與ELISA比較 挑選已經(jīng)ELISA評(píng)價(jià)的F1免疫兔血清、兔抗EV76多抗-3和羊抗EV76，使用YPAb-UPT-LF方法檢測(cè)，并對(duì)ELISA和YPAb-UPT-LF的靈敏度進(jìn)行比較。結(jié)果表明，YPTAb-UPT-LF對(duì)F1免疫兔血清、兔抗EV76多抗-3和羊抗EV76靈敏度分別為1∶40 960、1.25 mg/L、0.625 mg/L。與表1中的間接ELISA法測(cè)得的效價(jià)相比，YPAb-UPT-LF的靈敏度分別差2～4倍，40倍、2.5～5倍，見(jiàn)圖5。但是因?yàn)閅PAb-UPT-LF對(duì)樣本的處理存在10倍稀釋的操作，而ELISA方法對(duì)樣本的處理未包含10倍稀釋的操作，所以YPAb-UPT-LF和間接ELISA法的實(shí)際檢測(cè)能力基本持平。

系列稀釋的F1免疫兔血清(A)、兔抗EV76多抗-3(B)和羊抗EV76多抗(C)的YPAb-UPT-LF檢測(cè)結(jié)果(即T/C值)。圖5 YPAb-UPT-LF對(duì)F1多抗和全菌抗體的檢測(cè)評(píng)價(jià)Fig.5 Evaluation of YPAb-UPT-LF for detection of antibodies against F1 or the whole cell of Y. pestis

3 討 論

F1抗原是鼠疫菌診斷和亞單位疫苗研究的重點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)早在2003年得以解析[4]。雖然常以多聚體形式存在于鼠疫菌的表面，單個(gè)F1抗原僅有170個(gè)氨基酸組成，且除去21個(gè)前導(dǎo)肽后僅有149個(gè)氨基酸，其分子量為15.5 kDa，等電點(diǎn)為4.3[5]。F1抗原存在于菌體和上清中，其中大部分存在于菌體上，因此純化的F1抗原較難獲得，這給鼠疫抗體檢測(cè)項(xiàng)目帶來(lái)較大的阻礙。因此，盡管基于上轉(zhuǎn)發(fā)光檢測(cè)鼠疫菌抗原的方法已經(jīng)比較成熟[2,6-8]，但基于上轉(zhuǎn)發(fā)光檢測(cè)鼠疫抗體的方法因受限于F1抗原而導(dǎo)致其靈敏度偏差。

本研究從多家單位獲取了多種方法制備的F1抗原，對(duì)基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)鼠疫抗體方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分析膜和結(jié)合墊中分別使用依據(jù)文獻(xiàn)提取的F1抗原和重組F1抗原的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析方法(YPAb-UPT-LF)，其靈敏度10倍優(yōu)于未被優(yōu)化之前的UPT方法(即在分析膜和結(jié)合墊中均使用依據(jù)生物制品規(guī)程提取的F1抗原的UPT方法)。優(yōu)化后的YPAb-UPT-LF檢測(cè)覆蓋度良好，能夠?qū)1抗原亞單位疫苗接種者的血清、多種鼠疫菌菌株免疫的兔血清進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)際上，UPT是一種定量方法，如果有相應(yīng)的鼠疫抗體標(biāo)準(zhǔn)品，可以依據(jù)F1抗體濃度和T/C值的對(duì)應(yīng)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)定量曲線，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠疫抗體的定量檢測(cè)。但目前國(guó)內(nèi)缺少相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品(而國(guó)際的鼠疫相關(guān)產(chǎn)品處于不共享狀態(tài))，且無(wú)已獲審批的定量檢測(cè)試劑作為參照，因此本研究?jī)H僅給出了相應(yīng)濃度的各樣本的T/C值，并選用了能進(jìn)行半定量檢測(cè)的ELISA方法作為對(duì)比。

血清中的成分較復(fù)雜，容易對(duì)檢測(cè)造成比較嚴(yán)重的干擾，所以需要前處理減少干擾。YPAb-UPT-LF只需將待檢血清樣本使用樣品處理液進(jìn)行10倍稀釋，即可對(duì)血清中的F1抗體進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程小于20 min。雖然ELISA方法因操作步驟較復(fù)雜而不適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但因?yàn)榫哂袑?duì)未結(jié)合靶標(biāo)進(jìn)行清洗的步驟，ELISA只需對(duì)血清樣本進(jìn)行對(duì)倍稀釋或不稀釋處理即可進(jìn)行檢測(cè)，因此其靈敏度較高[9-10]。盡管ELISA方法在檢測(cè)下，免疫兔血清、免抗EV76多抗-3和羊抗EV76時(shí)，靈敏度分別為YPAb-UPT-LF檢測(cè)同種物質(zhì)的2～4倍、40倍、2.5～5倍，但是YPAb-UPT-LF含對(duì)樣本進(jìn)行10倍稀釋的操作，因此，YPAb-UPT-LF和ELISA的實(shí)際靈敏度基本持平。

本研究中的兔抗F1抗體質(zhì)控品僅進(jìn)行了硫酸銨沉淀的初步純化，因此YPAb-UPT-LF對(duì)其檢測(cè)靈敏度僅為1 mg/L?？紤]到10倍稀釋和100 μL上樣的操作，YPAb-UPT-LF可以檢測(cè)100 μg/L的兔抗F1抗體(每個(gè)試紙條上的多抗僅為10 ng)，其靈敏度較好。

本研究通過(guò)對(duì)多種來(lái)源的F1抗原進(jìn)行篩選，優(yōu)化了上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)鼠疫抗體方法，并用質(zhì)控品、F1疫苗接種者血清、多種鼠疫菌株的兔免血清進(jìn)行了評(píng)價(jià)，對(duì)其他鼠疫抗體檢測(cè)方法的優(yōu)化和評(píng)價(jià)來(lái)說(shuō)具有一定的參考價(jià)值。本研究針對(duì)鼠疫抗體檢測(cè)的YPAb-UPT-LF進(jìn)行優(yōu)化，為鼠疫的免疫診斷和F1疫苗免疫效果評(píng)估等工作提供了一個(gè)備選的方法。

致謝：感謝中國(guó)食品藥品檢定研究院魏東老師為本研究提供的各種鼠疫菌株兔免血清，感謝蘭州生物制品所王秉翔老師、軍事醫(yī)學(xué)研究院周冬生老師為本研究提供的天然F1抗原和重組F1抗原。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：周裕貴，孫竹林，宋亞軍，等. 基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)鼠疫抗體方法的優(yōu)化與評(píng)價(jià)[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：582-588. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.075