肖建紅，張陽春

（1.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院血液科，廣東深圳 518052；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，湖南衡陽 421001；3.深圳大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科中心，廣東深圳 518101）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（primary immune thrombocytopenia，ITP）是血液科最為常見的一種由自身免疫紊亂而導(dǎo)致的機(jī)體血小板減少，在免疫系統(tǒng)具有器官特異性，由于人體內(nèi)產(chǎn)生抗血小板自身抗體導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞血小板過多，從皮膚、黏膜滲血，進(jìn)而導(dǎo)致多個(gè)器官不同程度出血［1-2］。ITP 的發(fā)病原因及具體機(jī)制仍不完全清楚，在臨床治療上，對(duì)輕中度及急性的ITP 患者采取一般治療方法如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、脾切除等等療效可顯著改善，但對(duì)于復(fù)發(fā)、難治性ITP 患者目前尚無較好的防治方案［3-4］。因此，防治ITP新的有效療法亟待探索。在治療自身免疫性疾病領(lǐng)域，間充質(zhì)干細(xì)胞已在多個(gè)免疫性疾病的治療理念中有了跨越式發(fā)展，目前已成為一種全新的治療策略［5-6］。而在干細(xì)胞來源種類的選擇上，與骨髓等其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，AMSCs）具有更大優(yōu)勢(shì)：供體充足、容易獲取及培養(yǎng)、生物個(gè)體間免疫原性低等，有著廣泛的臨床應(yīng)用前景［7］。AMSCs 能否作為治療自身免疫性疾病ITP 的一種新的手段，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)?；贏MSCs 的低免疫原性特征及臨床應(yīng)用研究服務(wù)，我們采用人來源的AMSCs，探討其對(duì)ITP 小鼠的療效，免疫失衡的改善及特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet∕GATA-3 表達(dá)影響，并闡明AMSCs 在ITP 中的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF 級(jí)BALB∕c 小鼠，體質(zhì)量為18～26 g，6～8 周齡，共30 只，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；脂肪組織供體：篩選在深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院手術(shù)室行抽脂術(shù)患者或和術(shù)中相關(guān)部位需要行多余脂肪組織切除的患者5 例（其中3 例女性，2 例男性），年齡18～45 歲，排除合并自身免疫系統(tǒng)疾病及影響免疫系統(tǒng)的其他疾患，并經(jīng)外科醫(yī)師確定獲取的脂肪組織無進(jìn)一步臨床應(yīng)用價(jià)值，以及術(shù)前術(shù)中無污染。所篩選的患者知曉實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⒅橥?，同時(shí)實(shí)驗(yàn)方案征得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫審［2016］A-002號(hào)）。

1.2 AMSCs分離、培養(yǎng)及檢測(cè)以此為例重新調(diào)整標(biāo)題

手術(shù)室獲取的脂肪組織快速送往實(shí)驗(yàn)室，將其剪為小碎塊并清除夾雜的非脂肪組織，加入膠原酶消化后，采用Ficoll 密度梯度離心棄除浮游顆粒。AMSCs 為貼壁細(xì)胞，加入DMEM 培養(yǎng)液，5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)多次換液，待AMSCs 細(xì)胞生長(zhǎng)到90%，再按比例傳代，并顯微鏡下觀察AMSCs 形態(tài)變化。根據(jù)前期研究經(jīng)驗(yàn)［8］，選取生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖能力強(qiáng)的第4 代傳代細(xì)胞，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)570nm 測(cè)定吸光值（OD 值），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；同時(shí)流式細(xì)胞檢測(cè)AMSCs 表面抗原標(biāo)記CD14、CD29、CD44、CD45及CD105分子表達(dá)。

1.3 AMSCs鑒定

1.3.1 誘導(dǎo)成脂分化 將傳代好的第4 代AMSCs以5×103∕cm2密度接種于6 孔板，待增殖達(dá)90%后，更換DMEM 培養(yǎng)液。成脂誘導(dǎo)組細(xì)胞每孔加入2 mL成脂誘導(dǎo)劑（10%FBS的HG-DMEM 培養(yǎng)液中加 入1 μmol∕L 地塞米松，10 μg∕mL 胰島素，200μmol∕L 吲哚美辛和0.5 mmol∕L IBMX），置5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 天，再用成脂誘導(dǎo)保持液處理，循環(huán)3 次后誘導(dǎo)維持培養(yǎng)液（只含有10 μg∕mL胰島素）處理一周并定期換液。對(duì)照組細(xì)胞加入10% FBS 的HG-DMEM 培養(yǎng)。3 周后行油紅“O”脂肪染色法觀察脂肪顆粒。

1.3.2 油紅“O”脂肪染色 AMSCs成脂誘導(dǎo)達(dá)3周后去除細(xì)胞當(dāng)前使用培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次；27.5%甲醛室溫固定20 min 后PBS 清洗3 次，空氣中干燥；加入0.5%的紅油室溫孵育1 h，60%異丙醇清洗30 s；PBS 清洗3 次后，倒置顯微鏡下觀察并記錄。

1.3.3 誘導(dǎo)成骨分化 將傳代好的第4 代AMSCs以5×103∕cm2密度接種于6 孔板，待增殖達(dá)90%后，更換DMEM 培養(yǎng)液。成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞每孔加入2 mL 成骨誘導(dǎo)劑（10%FBS 的LG-DMEM 培養(yǎng)液中加入50 μmol∕L 抗壞血酸，10 mmol∕L β-磷酸甘油和100 nmol∕L 地塞米松），置5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，維持誘導(dǎo)3 周并定期換液。對(duì)照組細(xì)胞加入含10%FBS 的LG-DMEM 培養(yǎng)液。3 周后行茜素紅染色法觀察鈣質(zhì)顆粒。

1.3.4 茜素紅染色 AMSCs 成骨誘導(dǎo)達(dá)3 周后去除細(xì)胞當(dāng)前使用培養(yǎng)液，使用PBS 清洗三次；使用10%甲醛室溫固定15 min 后PBS 清洗3 次；按照1 mL∕孔加入40 mmol∕L 的茜素紅染色液，室溫孵育20 min 并輕微振蕩；清除掉未完全結(jié)合的染料，用PBS漂洗并振蕩5 min重復(fù)4次；傾斜放置2 min，去除多余的清洗液，倒置顯微鏡下觀察并記錄。

1.4 ITP小鼠建立及處理

將30 只BALB∕c 小鼠編號(hào)并隨機(jī)分成3 組，即正常對(duì)照組（Normal組）、ITP對(duì)照組（ITP∕PBS組）及ITP 實(shí)驗(yàn)組（ITP∕AMSC 組），每組10 只，除正常對(duì)照組外，其余兩組均按我們前期已成功建立ITP 小鼠模型的方法繼續(xù)造模［9］。3 組小鼠分別處理如下，ITP 實(shí)驗(yàn)組：從ITP 小鼠尾靜脈輸注200 μL 1×106∕mL AMSCs；ITP 對(duì)照組：從ITP 小鼠尾靜脈輸注200μL PBS；正常對(duì)照組小鼠不進(jìn)行任何處理。根據(jù)我們既往研究及參考文獻(xiàn)，ITP 模型建立后進(jìn)行1 次AMSCs 注射，處理后的第7 天，斷頸處死小鼠，獲取標(biāo)本并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.1 Th1∕Th2細(xì)胞因子 將獲取的小鼠部分外周血分離血清，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）各組血清IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10細(xì)胞因子表達(dá)。96孔酶標(biāo)板按照次序分別加入100μL 的標(biāo)準(zhǔn)品，100μL樣品，空白對(duì)照加入100μL 的蒸餾水，詳細(xì)步驟按ELISA試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值（OD 值），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品孔OD 值均減除空白孔值后計(jì)算各種細(xì)胞因子含量。

1.4.2 外周血小板水平 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)定期獲取的小鼠尾靜脈血100 μL，將血液和100 μL 1%EDTA-Na2 抗凝劑充分混合后，送檢驗(yàn)科全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)血常規(guī)并記錄外周血小板水平。

1.4.3 免疫磁珠分純Th 細(xì)胞 密度梯度離心法分離獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至Eppendorf 管，離心、棄上清、重懸后加入CD4 Micro-Beads 充分混勻，在4℃孵化15 min；用Buffer 洗滌細(xì)胞，再次離心、重懸。將MS 分離柱放置在MACS分離器的磁場(chǎng)中，以Buffer 漂洗，將細(xì)胞懸液通過分離柱，反復(fù)Buffer沖洗分離柱3次。取出分離柱，用1 mL Buffer 加壓沖洗分離柱，收集含CD4+T 淋巴細(xì)胞流出液，即Th細(xì)胞，已備基因檢測(cè)。

1.4.4 特異性轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)小鼠外周血調(diào)控Th1∕Th2 細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet∕GATA-3 表達(dá)水平，GenBank 上查找目的基因mRNA 序列，在CDS 區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，序列見表1。

表1 Th細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)細(xì)胞因子引物序列Table 1 Th cell specific transcription factors and related cytokines’primer sequences

按常規(guī)方法提取總RNA，加入DEPC 水溶解。取4μL RNA 模板做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)體系如下：5×逆轉(zhuǎn)錄buffer 4.0 μL，下游引物（10 pmol∕μL）0.5 μL，dNTPs（10 mmol∕L）0.5 μL，MMLV（200 U∕μL）0.5 μL，DEPC 水10.5 μL，RNA模板4.0 μL，總體積為20.0 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系如下：5×SYBR Green ⅠPCR buffer 10μL，上游引物F（10 pmol∕μL）1.0μL，下游引物R（10 pmol∕μL）1.0 μL，dNTPs（10 mmol∕L）1.0 μL，Taq 酶（3 U∕μL）1.0 μL，cDNA 5.0 μL，ddH2O 31.0μL，總體積：50.0μL。PCR 條件：93℃，3 min-93℃，15 s-55℃，30 s-72℃，30 s，共40循環(huán)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 AMSCs細(xì)胞形態(tài)觀察

AMSCs 為貼壁細(xì)胞，形態(tài)多呈梭形，隨著細(xì)胞增殖和多次傳代，呈集落式生長(zhǎng)，漩渦狀排列；供輸注ITP小鼠用的P4代細(xì)胞呈不規(guī)則梭形，有單個(gè)細(xì)胞核仁或者雙核，核仁基本居中，呈類圓形（圖1）。

圖1 顯微鏡下P4代AMSCs細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of P4 AMSCs observed under microscope

2.2 AMSCs細(xì)胞免疫表型

P4 代AMSCs 細(xì)胞表面CD29、CD44 和CD105抗原標(biāo)記呈強(qiáng)陽性表達(dá)，分別為97.54%、97.34%和99.61%；低表達(dá)抗原標(biāo)記CD14 及CD45 分子，分別為2.51%和0.26%（圖2），細(xì)胞免疫表型鑒定結(jié)果合格。

2.3 AMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

P4 代細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖呈S 形，第0～3 天時(shí)處于起始期，3 天后增殖加快并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，1 周后進(jìn)入平臺(tái)期。按照生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得細(xì)胞的倍增時(shí)間為26 h，其生長(zhǎng)達(dá)平臺(tái)期平均擴(kuò)增時(shí)間為5 d（圖3）。

圖3 P4代AMSCs細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況Fig.3 Growth and proliferation of P4 AMSCs

2.4 AMSCs分化能力測(cè)定結(jié)果

2.4.1 AMSCs 誘導(dǎo)成脂分化 P4代AMSCs 增殖穩(wěn)定后，通過成脂誘導(dǎo)劑達(dá)3 周后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，27.5%甲醛等處理后行油紅“O”脂肪染色倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞內(nèi)紅色脂肪顆滴，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期（圖4）。

圖4 AMSCs誘導(dǎo)成脂分化Fig.4 Lipogenic induction of AMSCs

2.4.2 AMSCs 誘導(dǎo)成骨分化 P4代AMSCs 增殖穩(wěn)定后，通過成骨誘導(dǎo)劑達(dá)3 周后去除細(xì)胞培養(yǎng)液，10%甲醛室溫固定等處理后，茜素紅染色液染色可見細(xì)胞質(zhì)大量紅色鈣結(jié)節(jié)（圖5）。

圖5 AMSCs誘導(dǎo)成脂分化Fig.5 Osteogenic induction of AMSCs

2.5 小鼠一般狀況

建模后，ITP小鼠一般狀況比正常對(duì)照組較差，進(jìn)食量和活動(dòng)量有所下降；ITP 小鼠經(jīng)過AMSCs 治療1 周，進(jìn)食量和活動(dòng)量均較治療前有所增加，且好于ITP 對(duì)照組。同時(shí)ITP 實(shí)驗(yàn)組經(jīng)AMSCs 治療1周后觀察小鼠皮膚紫癜范圍有所減少。分組前及各組小鼠在干預(yù)前（0 周）、造模后1 周（第1 周）及AMSCs 治療后1 周（第2 周）體質(zhì)量符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析3 組小鼠體質(zhì)量在第1 及2 周組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（統(tǒng)計(jì)值分別為F=4.12，P=0.035 4；F=5.06，P=0.018 6），采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較統(tǒng)計(jì)得出：ITP 小鼠在AMSCs 治療前（第1 周）的平均體質(zhì)量（ITP∕PBS 組及ITP∕AMSC組）均輕于正常小鼠Normal 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P=0.008 5，P=0.007 8），而ITP∕PBS組與ITP∕AMSC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.525 1）；2周后，經(jīng)AMSCs 治療后ITP 小鼠的體質(zhì)量雖未恢復(fù)至正常小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028 1），但比對(duì)照組ITP 小鼠顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 6；表2）。

表2 不同時(shí)間各組小鼠體質(zhì)量情況比較Table 2 Comparison of mice weight in each group at different time g（）

表2 不同時(shí)間各組小鼠體質(zhì)量情況比較Table 2 Comparison of mice weight in each group at different time g（）

Compared with the normal group，1）P＜0.001；2）P＜0.01；compared with the control group，3）P＜0.05.

2.6 外周血小板水平檢測(cè)

通過血細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠外周血小板水平，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，3 組小鼠血小板水平在第3～6 天組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第3 天（F=56.18，P=0.000 0）、第4 天（F=44.35，P=0.000 0）、第5 天（F=41.63，P=0.000 0）、第6天（F=37.35，P=0.000 0）。采用Bonferroni法進(jìn)一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)：與Normal 組小鼠比較，ITP∕PBS 組及ITP∕AMSC 組小鼠血小板水平較低（均P=0.000 0）；經(jīng)AMSCs 治療后，ITP∕AMSC 組血小板水平雖有所升高（與ITP∕PBS 組比較，在第3～6 天，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值依次為0.010 4、0.000 6、0.000 0及0.000 0），但仍未達(dá)到正常水平（與Normal 組比較，仍有顯著性差異，均P=0.000 0；圖6）。通過3組數(shù)據(jù)比較分析得出，AMSCs 可提高ITP 小鼠血小板水平。

圖6 3組小鼠外周血小板水平變化Fig.6 Changes of peripheral blood platelet levels in three groups

2.7 T-bet/GATA-3表達(dá)水平

通過RT-PCR 檢測(cè)特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet∕GATA-3 mRNA 表達(dá)水平，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，3 組小鼠T-bet mRNA 及GATA-3 mRNA 表達(dá)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（統(tǒng)計(jì)值分別為F=29.86，P=0.000 0；F=27.35，P=0.000 0）。采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)ITP∕PBS組小鼠T-bet 表達(dá)明顯高于Normal 組及ITP∕AMSC組小鼠（均P=0.000 0）；經(jīng)AMSCs 治療后，ITP 小鼠T-bet表達(dá)雖有所降低，但仍高于正常小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 0）。而對(duì)于Th2 細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 mRNA 表達(dá)，ITP∕PBS 組小鼠明顯低于Normal 組小鼠表達(dá)（P=0.000 0）；經(jīng)AMSCs 治療后，ITP 小鼠GATA-3 表達(dá)顯著上升，高于ITP∕PBS 組小鼠（P=0.000 0），但仍低于正常小鼠（P=0.012 8；圖7）。

圖7 T-bet/GATA-3 mRNA在3組小鼠中的表達(dá)Fig.7 Expression of T-bet/GATA-3 mRNA in three groups of mice

2.8 小鼠外周血Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)

通過ELISA檢測(cè)小鼠外周血Th1∕Th2相關(guān)細(xì)胞因子，各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，經(jīng)單因素方差分析，3 組小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4 及IL-10 表達(dá)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（統(tǒng)計(jì)值分別為F=29.86，P=0.000 0；F=27.35，P=0.000 0）。采用Bonferroni 法進(jìn)一步作兩兩比較發(fā)現(xiàn)：ITP∕PBS 小鼠血清Th1 細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2 水平高于正常Normal 組（均P=0.000 0），經(jīng)AMSCs 治療后，ITP 小鼠IFN-γ、IL-2與ITP∕PBS 組比較顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P=0.000 6，P=0.000 8），雖然IL-2 水平尚未恢復(fù)正常小鼠水平（P=0.010 5），但I(xiàn)FN-γ因子已接近正常水平，與Normal 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.084 2）；對(duì)于Th2 細(xì)胞因子IL-4 及IL-10，ITP∕PBS 小鼠顯著低于Normal 組（均P=0.000 0），經(jīng)AMSCs 輸注后，ITP 小鼠血清IL-4 及IL-10 水平均上升，雖與Normal 組比較尚未恢復(fù)正常水平（分別為P=0.018 4，P=0.025 1），但較ITP∕PBS組小鼠有非常顯著差異（分別為P=0.000 1，P=0.000 7；圖8）。

圖8 ITP小鼠Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)Fig.8 Expression of Th1/Th2 cytokines in ITP mice

3 討論

ITP 是人體血液系統(tǒng)的常見病，亦與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，是具有器官特異性的自身免疫紊亂性血液?。?0-11］。由于人體內(nèi)產(chǎn)生抗血小板自身抗體導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)破壞血小板過多，從早期的皮膚黏膜滲血，進(jìn)展為多個(gè)重要器官的不同程度出血［11］。在臨床治療上，對(duì)輕中度及急性的ITP 患者采取一般治療方法如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、脾切除等等療效顯著，但對(duì)于復(fù)發(fā)、難治性ITP 患者目前尚無較好的防治方案［3，12-13］。近年來，對(duì)ITP的發(fā)病機(jī)制有了更新的認(rèn)識(shí)：ITP 患者機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)自身自身抗體的淋巴B 細(xì)胞離不開特異性自身反應(yīng)性T 細(xì)胞的輔助即Th 細(xì)胞（輔助性T 淋巴細(xì)胞），分化異常的Th 及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子導(dǎo)致機(jī)體Th 淋巴細(xì)胞免疫失衡，進(jìn)而引起一系列免疫炎性反應(yīng)，產(chǎn)生針對(duì)血小板的自身反應(yīng)性抗體異常增多，最終導(dǎo)致ITP的發(fā)生和發(fā)展［10，14］。

目前認(rèn)為，ITP 機(jī)體Th 淋巴細(xì)胞免疫的失衡，主要是其產(chǎn)生的Th1 細(xì)胞因子和Th2 細(xì)胞因子的比例失衡所致［15］。Th 細(xì)胞的分類是根據(jù)其生物學(xué)特性和產(chǎn)生細(xì)胞因子種類而區(qū)分為4 種不同的類別，除了Th1及Th2細(xì)胞外，還有Th3細(xì)胞即調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）和較晚發(fā)現(xiàn)的Th17 細(xì)胞［16-17］。在ITP免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中產(chǎn)生關(guān)鍵作用的是Th1 及Th2 細(xì)胞［16-17］。Th1 細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-2、IFN-γ 等因子，介導(dǎo)固有免疫等細(xì)胞免疫應(yīng)答［18］。更重要的是在ITP中，Th1 細(xì)胞因子IFN-γ 的異常升高，能直接抑制Th2 細(xì)胞的分化和功能，以及Th2 細(xì)胞因子表達(dá)［18-20］。而Th2 細(xì)胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-10 等因子，介導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答［18］。ITP 患者的Th1 和Th2的免疫失衡，主要是Th1 細(xì)胞因子異常增多導(dǎo)致，是Th1 因子占主導(dǎo)地位的免疫性疾?。?8］。作者通過建立ITP 小鼠模型，并對(duì)外周血對(duì)Th1 及Th2 細(xì)胞因子檢測(cè)，再次探明，ITP 小鼠血清Th1細(xì)胞因子IFN-γ 及IL-2 的表達(dá)水平高于正常小鼠；同時(shí)Th2細(xì)胞因子IL-4及IL-10表達(dá)水平低于正常小鼠。

鑒于ITP 患者的Th1∕Th2 細(xì)胞因子的免疫失衡，新的治療理念有了跨越式發(fā)展，針對(duì)其免疫失衡的新型藥物已在臨床上逐步開始嘗試［18］。Alemtuzumab，是一種抗糖基磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白（CD52）的人源化單克隆抗體，可抑制ITP 患者Th細(xì)胞免疫失調(diào)，雖然具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步闡明，但臨床研究發(fā)現(xiàn)Alemtuzumab 可成功改善難治性ITP 患者血小板水平并能持續(xù)有效，而不足之處是可能由于該藥物的免疫原性等問題，患者治療后多出現(xiàn)的不良反應(yīng)為發(fā)熱，帶狀皰疹等［3］。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是一種僅存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，有文獻(xiàn)報(bào)道慢性難治性ITP 患者經(jīng)過人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療，療效顯著，在兩年的隨訪中，1年的緩解率高達(dá)100%［21］。雖然研究例數(shù)不多及還需大樣本量進(jìn)一步證實(shí)，但人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療后1 年的100%有效緩解率及低副反應(yīng)確實(shí)令人矚目。除了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外，其他如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、AMSCs等間充質(zhì)干細(xì)胞均有著共性，具有生物個(gè)體間低免疫原性，調(diào)控過度的細(xì)胞免疫應(yīng)答，改善機(jī)體免疫失衡［22］。相對(duì)其他來源的間充質(zhì)干細(xì)胞而言，從脂肪獲取的AMSCs，來源廣及易培養(yǎng)增殖是其最大的優(yōu)勢(shì)。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上［23］，作者再次通過分離培養(yǎng)人來源的AMSCs 輸注ITP 小鼠，發(fā)現(xiàn)AMSCs 能改善Th1∕Th2細(xì)胞因子失衡，Th1細(xì)胞代表性因子IFN-γ、IL-2水平下降，Th2 細(xì)胞代表性因子IL-4、IL-10 的水平上升，同時(shí)ITP 小鼠外周血血小板水平提高。除了Th1∕Th2 相關(guān)細(xì)胞因子，外周血小板水平等客觀指標(biāo)改善外，我們也觀察到ITP 小鼠經(jīng)AMSCs 輸注后體質(zhì)量有明顯提高，雖然ITP 小鼠的皮膚黏膜等出血性瘀斑尚無客觀指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［24］，實(shí)驗(yàn)組ITP小鼠經(jīng)治療后表現(xiàn)出紫癜不同程度的減少。更重要是我們進(jìn)一步深層次發(fā)現(xiàn)，ITP 小鼠Th細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 和T-bet 發(fā)生表達(dá)改變，Tbet 水平顯著性高于正常小鼠，同時(shí)GATA-3 表達(dá)低于正常。目前已證實(shí)，在自身免疫性疾病中特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet 和GATA-3 與Th 細(xì)胞的分化和Th1∕Th2 細(xì)胞因子平衡密切相關(guān)［25-27］。通過AMSCs的輸注，ITP 小鼠T-bet 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)GATA-3 表達(dá)增加。據(jù)此，我們得出：AMSCs 可能通過對(duì)TBet∕GATA3 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響Th1∕Th2 細(xì)胞因子失衡，從而改善ITP小鼠血小板水平。

綜上所述，ITP 機(jī)體存在Th1∕Th2 細(xì)胞因子免疫失衡，以Th1 細(xì)胞因子占主導(dǎo)，AMSCs 可能通過對(duì)Th 細(xì)胞的T-bet∕GATA-3 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，減少Th1因子分泌、增加Th2 因子分泌，改善ITP 免疫失衡，恢復(fù)血小板水平。