王亞美，趙 明，馬凌波，馬春艷，朱之發(fā)，史方方，王雪陽，王 偉，蔣科技，張鳳英

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）屬軟甲綱，十足目，梭子蟹科，青蟹屬，常棲于比海水鹽度稍低的泥沼與溝壑中，如入海口、潮間帶和紅樹林等［1］。擬穴青蟹生長迅速、成體規(guī)格大、營養(yǎng)豐富，是我國東南沿海重要的經(jīng)濟蟹類［2］。隨著經(jīng)濟繁榮和生活質(zhì)量的提高，人們對水產(chǎn)品的需求量日益增加，水產(chǎn)品因其低脂肪和高蛋白質(zhì)而備受青睞。由于海洋漁業(yè)資源日益匱乏，水產(chǎn)養(yǎng)殖成為漁業(yè)發(fā)展的重要方向。同時，海水品種的淡化養(yǎng)殖可減輕海水養(yǎng)殖對沿岸海洋環(huán)境的污染，也可促進內(nèi)陸水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，降低養(yǎng)殖成本，成為水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的發(fā)展方向之一。青蟹屬于廣鹽性甲殼動物，滲透調(diào)節(jié)能力較強［1］，使其成為低鹽度水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)選物種。

鹽度是影響甲殼類動物存活和生長的關鍵非生物因素，也是甲殼類水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的重要因素［3-5］。水生動物對鹽度的生理反應涉及到各種組織（如肌肉、肝胰腺）的氨基酸和脂肪酸含量變化，甲殼動物儲存的氨基酸、脂肪酸含量和組成是受外部環(huán)境和內(nèi)部系統(tǒng)綜合調(diào)節(jié)的結果，可在一定條件下反映機體的營養(yǎng)水平、攝食狀況、健康水平及環(huán)境改變時機體的生理生化調(diào)節(jié)。已有研究報道，鹽度可影響甲殼動物生長［6］及氨基酸［7-10］、脂肪酸［9，11-13］的組成和含量。目前，低鹽脅迫對擬穴青蟹幼蟹氨基酸和脂肪酸含量的影響研究尚少見，本文通過對鹽度20、10、0下擬穴青蟹幼蟹肌肉與肝胰腺中氨基酸和脂肪酸含量及組成進行分析，旨在探究低鹽對擬穴青蟹幼蟹肌肉與肝胰腺中氨基酸和脂肪酸含量和組成的影響，為低鹽養(yǎng)殖下青蟹營養(yǎng)成分的變化提供基礎資料，并為低鹽條件下幼蟹營養(yǎng)生理與營養(yǎng)需求研究提供一定的參考，豐富幼蟹營養(yǎng)學的內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設計

實驗用蟹為擬穴青蟹Ⅱ期仔蟹，取自本實驗室福建養(yǎng)殖基地，挑選大小相同、健康、活力強、無殘缺的個體共630只，平均體質(zhì)量為（19.53±0.39）mg。由于青蟹領地意識強且相互蠶食，為排除搶奪食物、相互蠶食對本實驗的干擾，采用單體養(yǎng)殖方式，制作630個可與周圍水體充分交換的白色柱狀塑料瓶（直徑10 cm、高20 cm、水深約15 cm），每個瓶中放一只幼蟹，將瓶放置在水循環(huán)系統(tǒng)的玻璃養(yǎng)殖缸（1.6 m×0.65 m×0.45 m）中，瓶上編號并在底部鋪設洗凈曝曬過的細沙（厚約4 cm）。實驗設置20、10和0鹽度組，每組210只幼蟹。每個鹽度組設置3個養(yǎng)殖缸，每70只幼蟹置于一個養(yǎng)殖缸內(nèi)作為一個平行。

實驗開始前將擬穴青蟹Ⅱ期仔蟹置于養(yǎng)殖缸里的瓶中，暫養(yǎng)7 d適應實驗環(huán)境，暫養(yǎng)水體鹽度為20，用曝氣的淡水與濃縮鹽鹵混合配制鹽水。采用曝氣的淡水將每個養(yǎng)殖缸的鹽度以每12 h降低2的速率調(diào)至實驗所設計的鹽度后開始正式實驗，正式養(yǎng)殖實驗時間為30 d。

1.2 養(yǎng)殖管理

在所有鹽度組降為設置鹽度后，每天觀察記錄擬穴青蟹生長和蛻殼存活狀況，將新鮮縊蟶（Sinonovacula constricta）剝殼去掉腹腔內(nèi)臟、外套膜、鰓后，剪成塊，洗凈，每個瓶中均勻投喂多塊，保持每只蟹所投喂食物營養(yǎng)成分接近，飽食投喂，次日將殘餌撈出。采用循環(huán)水系統(tǒng)將養(yǎng)殖水體進行過濾和凈化處理，每個養(yǎng)殖缸連續(xù)24 h充氧，實驗養(yǎng)殖期間水溫保持在（26±2）℃，pH 8.0～8.3，溶氧量3.1～3.5 mg·L-1。每天測量各試驗組水體鹽度，必要時補充淡水以保持水體鹽度穩(wěn)定。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實驗結束時，禁食24 h后取樣，為排除蛻殼周期對營養(yǎng)成分的影響，取處于同一蛻殼階段（蛻殼后第6天）的擬穴青蟹，將其從水循環(huán)系統(tǒng)轉移到實驗室，置冰上麻醉后解剖，分別取肌肉和肝胰腺。每個平行各取10只，每個鹽度組分別取樣30只，放置于-80℃冰箱中保存。

1.4 氨基酸和脂肪酸測定

氨基酸和脂肪酸含量測定參考國標方法［14］，氨基酸含量采用鹽酸水解法（GB／T 5009.124-2003），經(jīng)氨基酸自動分析儀測定。脂肪酸采用氣相色譜法（GB／T 5009.168-2003）測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實驗結果采用平均值±標準差（mean±SD）表示，用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan多重比較法檢驗不同鹽度組組間差異，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 氨基酸組成與含量

本實驗在擬穴青蟹肌肉和肝胰腺中檢測出17種氨基酸，包括9種必需氨基酸（EAA）和8種非必需氨基酸（NEAA），色氨酸（Tyr）在檢測過程中的酸性水解中結構發(fā)生改變未被檢出（表1，表2）。其中，NEAA中的Asp、Glu、Gly和Ala屬呈味氨基酸（DAA）。

2.1.1 肌肉中氨基酸含量

不同鹽度組肌肉中氨基酸含量見表1。肌肉中總氨基酸（TAA）、EAA、NEAA、DAA含量均隨鹽度的降低而顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度20＞10＞0趨勢。Asp、Ser、Glu、Thr、Gly、Ala、Val、IIe、Leu、Lys、His、Pro和Arg氨基酸含量也呈現(xiàn)此趨勢。與鹽度20組相比，鹽度0組肌肉中氨基酸含量均降低；鹽度10組肌肉中大部分氨基酸含量降低，Met和Tyr含量增加。與鹽度20組相比，鹽度10組TAA、EAA、NEAA含量分別降低6.32%、4.07%、7.54%，鹽度0組分別降低12.92%、9.42%、14.81%。

表1 擬穴青蟹幼蟹肌肉中氨基酸含量（mg·100 g-1，濕重）Tab.1 Muscle amino acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.1.2 肝胰腺中氨基酸含量

不同鹽度組肝胰腺中氨基酸含量見表2。TAA、NEAA含量在鹽度10、0組中比鹽度20組顯著增加（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度10＞0＞20（P＜0.05）趨勢。鹽度10組EAA含量大于 鹽度0和20組，鹽度0、20組EAA含量無顯著差異。Asp、Thr、Ser、Glu、Ala、Val、IIe、His、Lys和Arg氨基酸含量也呈現(xiàn)鹽度10＞0＞20趨勢。與鹽度20組相比，鹽度10組TAA、EAA、NEAA含量分別增加20.16%、10.65%、26.67%，鹽度0組分別增加5.92%、0.66%、9.52%。

表2 擬穴青蟹幼蟹肝胰腺中氨基酸含量（mg· 100 g-1，濕重）Tab.2 Hepatopancreas amino acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.1.3 各鹽度下肌肉和肝胰腺中氨基酸的組成（%TAA）

如表3所示，從組織內(nèi)氨基酸組成來看，所有鹽度下擬穴青蟹的肌肉氨基酸組分中，NEAA比例均高于EAA。兩組織之間相比，肝胰腺中EAA比例高于肌肉，肌肉中NEAA、DAA比例高于肝胰腺。低鹽下，NEAA比例在肌肉中降低，在肝胰腺中增高。綜合兩組織來看，與正常鹽度相比，低鹽下EAA比例增高，NEAA比例降低。

表3 擬穴青蟹組織中不同氨基酸占各組織總氨基酸的比例（%TAA）Tab.3 Ratio of amino acids content to total amino acids content in tissues of Scylla paramamosain（%TAA）

2.2 脂肪酸組成與含量

2.2.1 肌肉脂肪酸含量

本實驗在擬穴青蟹肌肉中檢測出19種脂肪酸，包括10種飽和脂肪酸（SFA），4種單不飽和脂肪酸（MUFA），5種多不飽和脂肪酸（PUFA）（表4）。肌肉中總脂肪酸（TFA）、SFA、MUFA、PUFA含量均隨鹽度的降低而顯著增多（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度0＞10＞20趨勢。肌肉中脂肪酸含量非常低，與鹽度20組相比，鹽度0、10組肌肉中各脂肪酸含量均增多。

表4 擬穴青蟹幼蟹肌肉中脂肪酸含量（mg·100 g-1，濕重）Tab.4 Muscle fatty acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.2.2 肝胰腺中脂肪酸含量

本實驗在擬穴青蟹肝胰腺中檢測出18種脂肪酸，包括9種SFA、4種MUFA和5種PUFA。肝胰腺中TFA、SFA、MUFA、PUFA含量均隨鹽度的降低而顯著減少（P＜0.05），呈現(xiàn)鹽度20＞10＞0趨勢（表5）。與鹽度20組相比，鹽度10組 TFA、SFA、MUFA、PUFA 含量分別降低31.25%、32.35%、32.46%、28.18%，鹽度0組分別降低52.85%、53.44%、46.60%、56.53%。

表5 擬穴青蟹幼蟹肝胰腺中脂肪酸含量（mg· 100 g-1，濕重）Tab.5 Hepatopancreas fatty acids content of juvenile Scylla paramamosain（mg· 100 g-1，wet weight）

2.2.3 各鹽度組織中脂肪酸的組成（%TFA）

如表6所示，各個鹽度下的肝胰腺和肌肉脂肪酸組分中，SFA占各組織總脂肪酸的比例最高，其次為PUFA，MUFA最低。肌肉中的SFA和PUFA比例均高于肝胰腺，而MUFA比例低于肝胰腺。低鹽下SFA比例在肌肉中增加，在肝胰腺中降低。PUFA、n-3PUFA、DHA比例：肌肉中為鹽度0 ＞10＞20，肝胰腺中為鹽度10＞20＞0，肌肉和肝胰腺兩組織總和為鹽度10＞20＞0。

表6 擬穴青蟹組織中不同脂肪酸占各組織總脂肪酸的比例（%TFA）Tab.6 Ratio of fatty acids content to total fatty acids content in tissues of Scylla paramamosain（%TFA）

如表7所示，綜合各鹽度處理組的兩組織中氨基酸／脂肪酸含量總和得出，與鹽度20組相比，鹽度10組兩組織中氨基酸總量增加0.36%，脂肪酸總量降低25.61%，鹽度0組兩組織中氨基酸總量降低8.14%，脂肪酸總量降低42.51%。

表7 不同鹽度下擬穴青蟹肌肉和肝胰腺中TAA和TFA趨勢、含量和變化率Tab.7 Trend，content and change rate of TAA and TFA in muscle and hepatopancreas of Scylla paramamosain in different salinities

3 討論

氨基酸和脂肪酸在鹽度適應中起重要作用［15］，擬穴青蟹機體中積累的氨基酸、脂肪酸含量是吸收／合成與消耗的綜合結果，而其吸收／合成量與消耗量受食物營養(yǎng)、環(huán)境脅迫和脅迫適應能力等影響。

3.1 低鹽脅迫對氨基酸的影響

低鹽脅迫下，蝦蟹中氨基酸含量和組成會發(fā)生變化。本研究中，擬穴青蟹肌肉中TAA、EAA、NEAA含量從大到小的順序為鹽度20＞10＞0。以往對不同鹽度下養(yǎng)殖擬穴青蟹幼蟹的研究發(fā)現(xiàn)，鹽度25組肌肉TAA含量（mg·g-1，干重）高于鹽度5組［16］；中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）成蟹不同鹽度養(yǎng)殖30 d，肌肉TAA含量為鹽度20組高于0［9］；泥蟹（Panopeus herbstii）低鹽下肌肉氨基酸也明顯減少［7］，本研究結果與其一致。原因可能是因為低鹽下氨基酸用于產(chǎn)能以應對低鹽脅迫導致［17-20］，后續(xù)可進一步開展青蟹氨基酸相關代謝途徑研究。

甲殼動物肝胰腺被認為是哺乳動物肝和胰腺的同源器官，是代謝反應的主要場所，其主要功能包括分泌酶、吸收和存儲營養(yǎng)物質(zhì)及卵黃發(fā)生等［21］。肝胰腺對營養(yǎng)物質(zhì)的蓄積可反映機體對營養(yǎng)物質(zhì)的需求。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）低鹽度下（鹽度3）肝胰腺中總可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于中（鹽度17）、高鹽度（鹽度32）（P＜0.05）［8］。本實驗肝胰腺中TAA、NEAA含量呈現(xiàn)鹽度10＞0＞20趨勢（P＜0.05），表明降低鹽度使肝胰腺中氨基酸含量增多，與先前報道中低鹽下肝胰腺中氨基酸含量增多的結果一致［16］，具體機制需進一步探究。本研究肌肉中NEAA降低量、肝胰腺中NEAA增高量均高于EAA，NEAA可能在鹽度脅迫中起重要作用。

3.2 低鹽脅迫對脂肪酸的影響

水生廣鹽動物依靠能量重組來應對環(huán)境鹽度的變化，水生動物的鹽度脅迫是能量-消耗（占總代謝能量的20%～50%）過程［22］。脂類是重要的產(chǎn)能營養(yǎng)物質(zhì)，代謝產(chǎn)生的許多脂肪酸是水生動物正常生長發(fā)育所必需的。

本研究在3種鹽度中養(yǎng)殖擬穴青蟹幼蟹30 d后，所有鹽度下肌肉中脂肪酸含量均極低，TFA隨鹽度下降而增加，呈現(xiàn)鹽度0＞10＞20趨勢。中華絨螯蟹成蟹不同鹽度養(yǎng)殖30 d，肌肉脂肪酸含量為鹽度0＞20［9］，本研究趨勢與其一致，表明低鹽脅迫可使擬穴青蟹肌肉中脂肪酸含量增加。本研究肌肉中n-3-PUFA、DHA的含量和占比隨鹽度的降低而增加，與鋸緣青蟹（Scylla serrata）［11］、凡納濱對蝦［12］研究結果一致。鹽度0組中肌肉SFA占比高于鹽度10組和鹽度20組，與曾霖等［20］研究報道的趨勢一致。

肝胰腺是蟹類能量儲存的重要器官［23］，與肌肉相比，鹽度對肝胰腺中脂肪酸組成影響更大。在本研究中，低鹽下擬穴青蟹幼蟹肝胰腺中TFA含量大幅降低，鹽度0組TFA降低52.85%，鹽度10組TFA降低31.25%，總脂肪酸含量為鹽度20＞10＞0，與不同鹽度養(yǎng)殖30 d后中華絨螯蟹成蟹肝胰腺總脂肪酸變化趨勢（鹽度20＞0）相同［9］。脂肪酸在鹽度適應的能量補充中起重要作用，飽和脂肪酸主要通過氧化提供足夠的能量以滿足額外的能量需求［12，24］。水生動物的多不飽和脂肪酸受鹽度影響較大，是海水水生動物維持細胞結構和機能完整性的重要生理功能物質(zhì)［25］。n-3PUFA可提高水生動物對滲透脅迫的抵抗力，增加細胞膜滲透性和流動性［25-27］，也可增加鰓面積和酶效率，以提高低鹽度滲透調(diào)節(jié)能力，并提高存活率［29-31］。研究發(fā)現(xiàn)低鹽脅迫可顯著增強肝胰腺中脂肪酸生物合成［32］，且低鹽脅迫可促進脂肪動員和脂解能力［12］。本研究低鹽下肝胰腺中脂肪酸含量降低，可能因為低鹽下脂肪酸用于供能和增加膜流動性，且這種消耗量可能大于其食物攝取或自身合成量以致積累減少。

較高的n-3PUFA、DHA水平能提高對鹽脅迫的耐受性和抵抗力，提高存活率，也在蛻皮和生長中發(fā)揮重要作用［26-29，33-34］。本研究鹽度0組肝胰腺中PUFA、n-3-PUFA、DHA的含量和占比最低，可能是由于低鹽度下幼蟹中脂肪酸消耗增加，且食物中沒有足夠的補充或擬穴青蟹低鹽適應能力較低導致肝胰腺中儲存降低。這可能也是本課題組發(fā)現(xiàn)鹽度0組擬穴青蟹存活率很低、生長最慢的原因之一。與鹽度20組相比，鹽度10組肝胰腺中PUFA、n-3PUFA、DHA的含量降低，占比增加（鹽度10＞20＞0）。先前報道鋸緣青蟹幼蟹［11］在不同鹽度下肝胰腺中n-3PUFA占比為鹽度12＞20＞4，兩者趨勢一致，適當降低鹽度可使肝胰腺中n-3PUFA、DHA占比增加。

4 小結

本文研究結果表明，在慢性低鹽條件下，擬穴青蟹肌肉和肝胰腺中氨基酸、脂肪酸均產(chǎn)生了顯著變化。肌肉中氨基酸含量下降，肝胰腺中氨基酸表現(xiàn)出一定積累；脂肪酸含量在肌肉中增多（所有鹽度下肌肉中脂肪酸含量均很低），在肝胰腺中大幅下降。綜合各鹽度組兩組織中氨基酸或脂肪酸含量總和得出，鹽度10組兩組織中總氨基酸含量及n-3PUFA、DHA比例增加，總脂肪酸含量降低；鹽度0組兩組織中總氨基酸、總脂肪酸含量及n-3PUFA、DHA比例均降低。本研究可為低鹽養(yǎng)殖下青蟹營養(yǎng)成分的變化提供基礎數(shù)據(jù)。在今后研究中，還需進一步探究氨基酸、脂肪酸代謝及其在適應環(huán)境鹽度變化中的作用?？山Y合本實驗各營養(yǎng)物質(zhì)變化趨勢，進一步開展低鹽度下擬穴青蟹營養(yǎng)生理和營養(yǎng)需求試驗，提高低鹽度下青蟹的存活率及生長性能。