王利紅，張 偉，2，陳圣源，朱 軍

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300；2.江蘇姜曲海種豬場(chǎng),江蘇泰州 225300)

Sirtuin是一類NAD依賴的去乙?；?，具有Mono-ADP-Ribosyl轉(zhuǎn)移酶活性，廣泛分布于原核生物和真核生物中。真核生物Sirtuin家族基因共有7個(gè)成員，為～，這些成員被劃分為4種類型，其中，、和為Ⅰ型，為Ⅱ型，為Ⅲ型，和為Ⅳ型。具有RNA聚合酶Ⅰ和包含組蛋白在內(nèi)的多種rRNA活性緊密相關(guān)的生物學(xué)功能，如通過(guò)去乙?；M蛋白底物和非組蛋白底物，參與細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)、抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞衰老等過(guò)程。除NAD依賴的去乙?；钚裕€表現(xiàn)出其他的酶活性，如對(duì)H3K122去琥珀?；?、對(duì)H3K36/K37去丁酰化、對(duì)H4K91去戊二?；?、對(duì)SP7/Osterix去丙酰化及具有脫脂?；D(zhuǎn)移酶活性等。Grob A等研究表明，在細(xì)胞的有絲分裂過(guò)程中，通過(guò)的C端區(qū)域被磷酸化，對(duì)rDNA的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮調(diào)控作用；Vakhrusheva等研究證實(shí)，的表達(dá)水平與小鼠細(xì)胞系中腫瘤的發(fā)生緊密相關(guān)，在嚴(yán)重的應(yīng)激情況下抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，保證細(xì)胞能夠盡量維持機(jī)體重要的新陳代謝通路。目前，有關(guān)豬基因表達(dá)研究較少，以蘇姜豬為研究對(duì)象則鮮有報(bào)道。蘇姜豬具有增質(zhì)量快、瘦肉率高、繁殖性能強(qiáng)、肉質(zhì)好等特點(diǎn)。本研究以成年蘇姜豬為研究對(duì)象，檢測(cè)分析()基因在多種臟器組織中的表達(dá)分布規(guī)律，研究結(jié)果可為豐富豬基因功能，深入開(kāi)展該基因在蘇姜豬臟器中的作用及對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

于2020年4月在江蘇姜曲海種豬場(chǎng)隨機(jī)選取同一日齡健康無(wú)病的育成蘇姜豬(約90 kg)3頭；屠宰采集心臟、肺、腎臟、肝臟、脾、胃、大腸、小腸、腹部脂肪、腿肌、背最長(zhǎng)肌共11種組織樣，每種組織樣各采集3個(gè)重復(fù)，存于液氮中，用于組織中基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測(cè)；同時(shí)，再采集各臟器組織樣福爾馬林溶液固定后用于組織中蛋白表達(dá)定位檢測(cè)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)檢測(cè)

由表1可知，根據(jù)GenBank中豬基因序列(登錄號(hào)：NM_001114272.1)和內(nèi)參基因-(登錄號(hào)：KU672525.1)，采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件設(shè)計(jì)RT-PCR引物；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物序列信息

使用TRIsol(Takara)提取所有組織樣品中總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA(按試劑盒說(shuō)明操作)。

RT-PCR反應(yīng)體系為20.0 μL，其組成由表2可見(jiàn)。反應(yīng)條件為：95 ℃1 min；95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s，40 個(gè)循環(huán)。

表2 RT-PCR反應(yīng)體系組成

1.3 酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

取組織樣約1.0 g勻漿后離心取上清液，按照SIRT7 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值(值)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色分析

將石蠟組織樣脫蠟、水化后，采用Tris-EDTA抗原修復(fù)，微波加熱10 min，TBS洗滌，采用HO封閉過(guò)氧化物酶，Sirtuin 7抗體4 ℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗識(shí)別特異性一抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片后鏡檢。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇姜豬組織中SIRT7 mRNA相對(duì)表達(dá)量分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量方法檢測(cè)蘇姜豬11個(gè)組織樣中mRNA的表達(dá)量，采用2-ΔΔ法計(jì)算，以心臟中表達(dá)量定為1，并相對(duì)定量其他組織樣中表達(dá)水平。

由圖1可知，蘇姜豬腸組織(大腸和小腸)中mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織中表達(dá)量(<0.05)；其次，在胃和腎臟組織中有較豐富的表達(dá)，顯著高于其余組織中表達(dá)量(<0.05)；在肌肉組織(背最長(zhǎng)肌和腿肌)中表達(dá)量相對(duì)最低。

2.2 蘇姜豬組織中SIRT7蛋白表達(dá)量分析

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法，對(duì)蘇姜豬11個(gè)組織樣中SIRT7蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，由圖2可知，蘇姜豬腸組織(大腸和小腸)中SIRT7蛋白表達(dá)量相對(duì)最高，顯著高于除胃組織的其他組織樣(<0.05)；其次是在肝臟、肺、脾、腎中有較豐富的表達(dá)；在心臟、腹脂和肌肉組織(背最長(zhǎng)肌和腿肌)中SIRT7蛋白表達(dá)相對(duì)較少。

2.3 蘇姜豬組織中SIRT7 mRNA和蛋白表達(dá)量間相關(guān)性分析

蘇姜豬各組織中mRNA與蛋白表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，Pearson’s相關(guān)系數(shù)為0.810，=0.000，表明蘇姜豬組織中mRNA和蛋白表達(dá)量間存在極顯著相關(guān)(<0.01)。

2.4 蘇姜豬組織中SIRT7蛋白的定位分布

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)蘇姜豬各臟器組織中SIRT7蛋白免疫陽(yáng)性顆粒的表達(dá)定位分布，由圖3可知，在蘇姜豬各臟器組織中，SIRT7蛋白主要分布于肝、腹部脂肪、骨骼肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及脾臟的紅髓區(qū)和紅白髓區(qū)交界處細(xì)胞、腎臟組織近遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞、肺支氣管上皮細(xì)胞和肺泡細(xì)胞。在消化道系統(tǒng)的胃和腸組織的肌層細(xì)胞及黏膜層胃腺和腸腺細(xì)胞中分布有較多的SIRT7免疫陽(yáng)性顆粒。

3 討論與結(jié)論

SIRT7作為沉默蛋白Sirtuin家族成員，除去乙酰化酶活性外，還具有去琥珀?；?、去丁酰化、去豆蔻酰化等酶活性，在動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。Jin等在通城豬的腦、消化系統(tǒng)和脂肪等16種組織中檢測(cè)到mRNA的廣泛表達(dá)。本研究在蘇姜豬的11個(gè)組織樣中檢測(cè)到基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)，這與Jin等的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步證明該基因在豬臟器組織中的表達(dá)具有廣泛性。對(duì)比蘇姜豬組織中表達(dá)量，結(jié)果表明該基因在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平間存在極顯著正相關(guān)性(<0.01)。

沉默蛋白Sirtuin家族的第7個(gè)成員(SIRT7)作為細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白，其表達(dá)水平與細(xì)胞的代謝活動(dòng)過(guò)程緊密相關(guān)，如在嚴(yán)重的應(yīng)激情況下SIRT7可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。在細(xì)胞能量狀態(tài)的調(diào)節(jié)過(guò)程中，SIRT7與RNA Pol I結(jié)合并通過(guò)NAD依賴的方式激活rDNA轉(zhuǎn)錄，過(guò)表達(dá)SIRT7促進(jìn)RNA Pol I介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，干擾SIRT7則起到抑制效果。Ford等研究發(fā)現(xiàn)，SIRT7主要在人體代謝活躍的組織，如肝、脾中有較高表達(dá)，在非增殖性組織，如肌肉、心臟和大腦中，SIRT7表達(dá)水平相對(duì)較低。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，蘇姜豬消化系統(tǒng)如胃、大腸、小腸中有較高的SIRT7表達(dá)量，顯著高于其他組織中表達(dá)量(<0.05)，其次是腎臟、肝臟、脾臟和肺組織，在非增殖性組織如肌肉和心臟組織中表達(dá)量相對(duì)最低。Jin等在通城豬的消化系統(tǒng)中也檢測(cè)到較豐富的mRNA相對(duì)表達(dá)量。SIRT7蛋白主要分布于胃、大腸和小腸組織的消化腺細(xì)胞中，這表明消化腺細(xì)胞在利用其從周圍血液中吸收的原料合成消化液，并分泌及貯存的主動(dòng)活動(dòng)過(guò)程中，基因具有重要的調(diào)控作用，其具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

腎臟組織中沉默蛋白Sirtuin家族的第7個(gè)成員(SIRT7)可以去乙酰化KCC4，以維持腎臟集合管室中酸堿平衡。在蘇姜豬的腎臟組織中，檢測(cè)到僅次于消化系統(tǒng)的相對(duì)較高的SIRT7表達(dá)量，然而，Jin等在通城豬的腎臟組織檢測(cè)相對(duì)較低的SIRT7 mRNA表達(dá)量，這種表達(dá)差異可能與不同品種豬的生理特征差異有關(guān)。經(jīng)免疫組化檢測(cè)，SIRT7蛋白主要表達(dá)分布于蘇姜豬除腎小球外的近遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞中，表明該基因的功能主要與腎臟近遠(yuǎn)曲小管的吸收與分泌功能有關(guān)。SIRT7是葡萄糖代謝的主要傳感器，Sun等發(fā)現(xiàn)，葡萄糖饑餓會(huì)激活A(yù)MPK，使SIRT7 T153發(fā)生磷酸化，繼而通過(guò)REG-蛋白酶途徑降解，從而減少rDNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成以避免細(xì)胞死亡。SIRT7缺失增加肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致肝脂肪變性，進(jìn)而導(dǎo)致血脂異常。Jin等在通城豬的肝臟和3種不同部位的脂肪(腹脂、內(nèi)臟脂肪、皮下脂肪)組織中均檢測(cè)到SIRT7表達(dá)，本研究在蘇姜豬肝臟和腹部脂肪細(xì)胞中也檢測(cè)到SIRT7的表達(dá)，但其表達(dá)量相對(duì)較少。在蘇姜豬肺組織中SIRT7蛋白主要分布于支氣管黏膜層和肺泡細(xì)胞，其表達(dá)量相對(duì)較少，這與通城豬肺組織中相對(duì)較少的Sirtuin 7表達(dá)量結(jié)果相似；在脾臟組織中，SIRT7主要分布于脾紅髓區(qū)和脾紅白髓區(qū)交界處細(xì)胞，表明其主要參與脾臟組織免疫細(xì)胞的吞噬過(guò)程。

總之，SIRT7在蘇姜豬組織中的表達(dá)具有廣泛性，在消化系統(tǒng)中的表達(dá)量相對(duì)最高，顯著高于其他組織中表達(dá)量(<0.05)；蘇姜豬組織中SIRT7轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平間存在極顯著正相關(guān)(<0.01)；SIRT7蛋白主要分布于肌細(xì)胞、胃腺和腸腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、脾臟紅髓區(qū)細(xì)胞、腎臟近遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞、肺支氣管上皮細(xì)胞和肺泡細(xì)胞中，表明基因主要與各臟器組織細(xì)胞的物質(zhì)能量代謝和消化液分泌功能有關(guān)。