李秋暢，閆順昌，蒙亞珍，顧云霞，寧巧明，李娜，王志華

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種具有高病死率的腦卒中亞型，老年患者居多，目前仍缺乏有效治療方法［1］。研究發(fā)現(xiàn)，當ICH發(fā)生時，鐵會在血腫周圍積累，而過量的鐵積累可造成氧化應(yīng)激，損傷細胞膜、蛋白質(zhì)及DNA，從而對細胞功能造成嚴重破壞，導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡［2-3］。降低ICH后鐵積累造成的鐵死亡發(fā)生，對ICH 的治療至關(guān)重要。目前針對該方面的藥物研究十分有限。核因子E2相關(guān)因子2/谷胱甘肽過氧化物酶4（nuclear factor erythroid-2 related factor 2/glutathione peroxidase 4，Nrf2/GPX4）是一個與鐵死亡相關(guān)的抗氧化途徑。研究表明，激活該途徑可減少鐵積累，從而緩解腦損傷后鐵死亡造成的神經(jīng)損傷［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）為臨床實踐中常用麻醉輔助劑，是α2腎上腺素能受體激動劑，具有高度特異性，可作用于藍斑從而產(chǎn)生抗焦慮、鎮(zhèn)靜的作用，在ICH時可以進行神經(jīng)保護［5-6］。但其對ICH 的神經(jīng)保護作用是否與鐵死亡有關(guān)還不清楚。本研究通過構(gòu)建ICH 大鼠模型，基于Nrf2-GPX4 介導(dǎo)的鐵死亡通路探究Dex 對ICH 大鼠的神經(jīng)保護作用，以期為針對ICH鐵死亡相關(guān)新藥的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠100 只，體質(zhì)量190～230 g，40～45日齡，購自中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所。大鼠恒溫飼養(yǎng)7 d，以適應(yīng)環(huán)境（12 h晝夜交替），飼養(yǎng)期間自由進食及飲水，許可證號：SCXK（滇）K2019-0002。

1.2 試劑和儀器 右美托咪定（國藥準字H20133331，1 mL∶0.1 mg，江蘇恩華藥業(yè)）；ML385（CSN22320-5 mg，CSNpharm，Inc.）；丙二醛（malonaldehyde，MDA）、鐵離子、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒（E2019、E1042-100/300、E2015，北京普利萊）；HE 染色試劑盒（DH0006，北京雷根生物）；BCA 試劑盒（LCB004，上海榕柏生物）；兔抗Nrf2、βactin、GPX4、胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白（Cystine/glutamate antiporter system light chain，xCT）抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（SA00001-2、16396-1-AP、60008-1-Ig、14432-1-AP、26864-1-AP、SA00001-2，Proteintech）；Nissl 染色液（KGMP0185，江蘇凱基生物）；普魯士藍染色試劑盒（SOS-939，北京凱詩源生物）；UVP Gelstudio PLUS touch凝膠成像儀（德國耶拿）；JC-1086A酶標儀（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團）；Talos F200C TEM透射電子顯微鏡（北京歐波同光學技術(shù)）。

1.3 研究方法

1.3.1 分組和ICH 模型建立 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分成Sham組、ICH組（模型組）、Dex-L組（Dex 50 μg/kg）、Dex-H組（Dex 100 μg/kg）［7］和Dex-H+ML385組（Nrf2抑制劑ML385 30 mg/kg）［8］，每組20只。除Sham組外，其余組通過自體血注射法進行ICH 模型建立：大鼠腹腔注射3 mL/kg 水合氯醛（10%）進行麻醉后俯臥位固定，消毒后于前囟旁（3 mm）縱向開口（10 mm），切開頭皮暴露前囟，于前囟后方1 mm、側(cè)方3 mm 處鉆孔，于右側(cè)尾狀核處注入50 μL 自體尾靜脈血（10 min 內(nèi)）后留針5 min，退針、縫合開口，Sham 組于相同位置注入生理鹽水（50 μL）［9］，2 h后若Zea Longa 評分為1～3分則造模成功［10］。Dex-L 組、Dex-H 組、Dex-H+ML385 組于術(shù)前30 min腹腔注射相應(yīng)Dex或ML385，Sham組和ICH組則注射等量的生理鹽水。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評分 于術(shù)后2 h 使用Zea Longa 評分法評定大鼠神經(jīng)功能：無神經(jīng)損傷記0分；對側(cè)前爪無法伸直記1分；對側(cè)轉(zhuǎn)圈記2分；對側(cè)傾倒記3分；自發(fā)行走障礙或者意識喪失記4分［9］。

1.3.3 GSH、MDA、鐵離子含量檢測 術(shù)后24 h，每組隨機抽取5只大鼠進行頸椎脫臼處死，斷頭取出腦組織后分離血腫周圍腦組織并置于研缽中進行勻漿、離心。通過比色法對一部分上清液進行GSH、MDA、鐵離子含量的測定，其余部分用于Western blot。

1.3.4 大鼠血腫周圍腦含水量檢測 每組另隨機抽取5只大鼠大腦血腫周圍組織稱質(zhì)量，60 ℃烘烤48 h，于腦質(zhì)量恒定后稱取干質(zhì)量，腦組織含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%，重復(fù)5次。

1.3.5 HE染色對血腫周圍腦組織進行病理學檢測 每組再次隨機抽取5只大鼠，取其腦組織，一部分使用多聚甲醛浸泡將其固定，脫水、石蠟包埋并切片（4 μm），行HE染色后光鏡檢測腦組織病理學；另一部分行Nissl染色。

1.3.6 Nissl 染色觀察大鼠血腫周圍腦組織神經(jīng)細胞損傷情況 將1.3.5所余另一部分腦組織進行冷凍后制作冰凍切片（5 μm），經(jīng)過二甲苯脫蠟后使用無水乙醇脫水，滴加焦油紫溶液（0.1%）染色及鹽酸-乙醇分色后依次進行脫水、透明和封片，于400 倍顯微鏡下隨機讀取血腫周圍大腦皮層5 個視野觀察神經(jīng)細胞數(shù)量（n=5）。

1.3.7 普魯士藍染色檢測血腫周圍腦組織中鐵沉積 取每組剩余的5 只大鼠腦組織制成常規(guī)切片，進行60 s 的蒸餾水沖洗，Perls 染色40 min 后再次沖洗，核固紅試劑核染10 min后脫水透明、封片并風干，于光鏡下觀察藍色鐵沉積。

1.3.8 Western blot 檢測腦組織GPX4、xCT、Nrf2 表達取1.3.3剩余上清液蛋白，BCA法對其定量，蛋白上樣進行SDSPAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后脫脂牛奶（5%）進行封閉，過夜（4 ℃）孵育GPX4、xCT、Nrf2、β-actin抗體（1∶1 000），次日孵育HRP-IgG二抗（1∶2 000），120 min后ECL顯色曝光，Image Lab軟件分析計算GPX4、xCT、Nrf2的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 7 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，多組比較行one-way ANOVA 檢驗，組間多重比較行LSD-t法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 Sham 組、ICH 組、Dex-L 組、Dex-H 組、Dex-H+ML385 組神經(jīng)功能缺損評分分別為（0.00±0.00）、（2.54±0.46）、（1.30±0.29）、（0.44±0.07）、（1.64±0.41）分，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=214.184，P＜0.01）；相較于Sham 組，ICH 組明顯增加；相較于ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組依次明顯降低；相較于Dex-H 組，Dex-H+ML385組明顯增加（均P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦組織GSH、MDA、鐵離子含量比較 相較于Sham組，ICH組MDA、鐵離子含量增加，GSH含量減少；相較于ICH組，Dex-L組與Dex-H組MDA、鐵離子含量依次減少，GSH 含量增加；相較于Dex-H組，Dex-H+ML385組MDA、鐵離子含量增加，GSH含量減少（均P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of iron ion,MDA and GSH content in brain tissue of rats between the five groups表1 各組大鼠腦組織鐵離子、MDA、GSH含量比較 （n=5，±s）

Tab.1 Comparison of iron ion,MDA and GSH content in brain tissue of rats between the five groups表1 各組大鼠腦組織鐵離子、MDA、GSH含量比較 （n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與Sham 組比較，b與ICH 組比較，c與Dex-L 組比較，d與Dex-H組比較，P＜0.05；表2同。

2.3 各組大鼠血腫周圍腦組織含水量比較 Sham組、ICH組、Dex-L組、Dex-H組、Dex-H+ML385組腦含水量分別為（61.82±6.95）%、（87.22±7.83）%、（76.04±6.01）%、（63.10±6.12）%、（81.09±6.94）%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=13.406，P＜0.05）；相比Sham 組，ICH 組的腦含水量明顯增加；相比ICH組，Dex-L組與Dex-H組的腦含水量明顯減少；相比Dex-H 組，Dex-H+ML385 組的腦含水量明顯增加（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織病理情況變化 Sham 組腦組織結(jié)構(gòu)未見異常；ICH組血腫周圍腦組織炎性浸潤、壞死及水腫現(xiàn)象嚴重，神經(jīng)細胞呈疏松且不規(guī)則排列；相比ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組的細胞水腫、壞死及炎性浸潤現(xiàn)象明顯減輕，細胞間隙減小；相比Dex-H 組，Dex-H+ML385組上述損傷現(xiàn)象進一步加重，見圖1。

2.5 各組大鼠腦組織神經(jīng)細胞損傷情況比較 Sham組神經(jīng)細胞形態(tài)正常且結(jié)構(gòu)完整，存在大量尼氏體，未發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象；ICH 組神經(jīng)細胞稀疏、紊亂，壞死嚴重，尼氏體數(shù)量明顯減少；相比ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組的神經(jīng)細胞層次豐富、緊密排列且壞死減少，尼氏體增多；相比Dex-H組，Dex-H+ML385組神經(jīng)細胞損傷明顯加重，見圖2。Sham 組、ICH 組、Dex-L組、Dex-H組、Dex-H+ML385組神經(jīng)細胞數(shù)分別 為（92.46±5.92）、（20.46±4.20）、（38.79±5.05）、（62.35±5.47）、（35.67±4.53）個/視野，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（F=153.491，P＜0.01）；相比Sham 組，腦組織神經(jīng)細胞數(shù)在ICH組明顯減少；相比ICH組，Dex-L 組與Dex-H 組的神經(jīng)細胞數(shù)依次明顯增加；相比Dex-H組，Dex-H+ML385組的神經(jīng)細胞數(shù)明顯減少（均P＜0.05），見圖2。

2.6 各組大鼠腦組織鐵沉積比較 Sham 組腦組織中未觀察到鐵沉積現(xiàn)象；相比Sham 組，ICH 組鐵沉積增多；相比ICH組，Dex-L組與Dex-H組鐵沉積依次減少；相比Dex-H 組，Dex-H+ML385 組鐵沉積增多，見圖3。

2.7 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2 蛋白表達水平比較 相比Sham 組，ICH 組的GPX4、xCT、Nrf2 表達水平降低；相比ICH 組，Dex-L 組與Dex-H 組的GPX4、xCT、Nrf2表達水平依次升高；相比Dex-H組，Dex-H+ML385組GPX4、xCT、Nrf2表達水平降低（均P＜0.05），見表2、圖4。

3 討論

ICH 屬于腦卒中急性亞型，約占出血性卒中的80%；導(dǎo)致ICH 患者預(yù)后不良的是神經(jīng)細胞損傷的復(fù)雜病理過程，而鐵積累則被證明是導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)細胞發(fā)生不可逆損傷的主要原因之一，因此抑制鐵死亡可保護神經(jīng)細胞［11-12］。然而，ICH 后鐵死亡發(fā)生的具體機制尚未闡明。

Fig.1 Pathological changes of brain tissue in each group(HE staining,×400)圖1 各組大鼠腦組織病理情況變化（HE染色，×400）

Fig.2 Comparison of nerve cell damage in brain tissue of rats between the five groups (Nissl staining,×400)圖2 各組大鼠腦組織神經(jīng)細胞損傷情況比較（Nissl染色，×400）

Fig.3 Comparison of iron deposition in brain tissue of rats between the five groups (Prussian blue staining,×400)圖3 各組大鼠腦組織鐵沉積比較（普魯士藍染色，×400）

Tab.2 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups表2 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2表達水平比較 （n=5，±s）

Tab.2 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups表2 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2表達水平比較 （n=5，±s）

Fig.4 Comparison of the expression levels of GPX4,xCT and Nrf2 in brain tissue of rats between the five groups圖4 各組大鼠腦組織GPX4、xCT、Nrf2蛋白表達水平比較

α2 腎上腺素受體激動劑Dex 是一種具有催眠、鎮(zhèn)靜作用的咪唑衍生物，α2腎上腺素受體廣泛分布于周圍神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及自主神經(jīng)節(jié)中。大量證據(jù)表明，Dex可以通過抗氧化、抑制細胞凋亡或影響細胞信號通路等多種機制對神經(jīng)起保護作用，也對ICH、腦缺血再灌注損傷等具有顯著的改善作用［7，13］。Dex 可通過抑制炎癥小體的激活來減輕腦組織炎癥損傷，保護ICH 后血腦屏障［14］。Dex 在ICH小鼠中可通過抑制由線粒體功能障礙造成的氧化應(yīng)激來改善神經(jīng)功能缺損［6］。Dex在SK-N-SH神經(jīng)細胞中可通過抑制叔丁基氫過氧化物誘導(dǎo)的鐵積累來改善細胞氧化損傷［15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，100 μg/kg Dex對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能具有明顯的保護作用［7］。因此，本研究使用50、100 μg/kg Dex 處理ICH大鼠，發(fā)現(xiàn)Dex可顯著降低ICH大鼠神經(jīng)功能缺損評分、MDA、鐵離子含量、腦含水量、腦組織病理損傷、鐵沉積，增加GSH 含量、神經(jīng)細胞數(shù)，其改善程度隨Dex 含量的升高而更為顯著。該結(jié)果表明，Dex 具有抑制ICH 大鼠腦組織氧化損傷及鐵積累，改善神經(jīng)功能的作用。

內(nèi)源性抗氧化酶GPX4 可使脂質(zhì)過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒的脂質(zhì)，以此起到抵抗脂質(zhì)過氧化的作用，從而抑制鐵死亡；GSH作為合成GPX4所必要的底物，起到輔助GPX4 發(fā)揮抗氧化功能的作用，已被認為是調(diào)節(jié)鐵死亡的關(guān)鍵因子［11，16］。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2 可通過促進xCT、GSH 及GPX4 表達來抵抗鐵死亡［17］。在非壓力條件下，Nrf2 主要與Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）相結(jié)合，當氧化應(yīng)激發(fā)生時，Keap1被降解后與Nrf2分離，后者進入胞核中啟動抗氧化基因轉(zhuǎn)錄［17-18］。Nrf2-Keap1蛋白復(fù)合物由于可調(diào)節(jié)細胞抗氧化反應(yīng)并減輕氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和鐵/血紅素代謝，因此可作為鐵死亡抑制劑［17，19］。GPX4 通過介導(dǎo)鐵死亡來促進ICH 后繼發(fā)性腦損傷，而抑制鐵死亡或GPX4 表達可改善ICH 造成的腦損傷［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，Dex 可顯著增加ICH 大鼠GPX4、xCT、Nrf2 表達水平，并在ICH 大鼠中可有效激活Nrf2-GPX4 信號通路。本研究還顯示，Nrf2 抑制劑ML385 可逆轉(zhuǎn)Dex 對ICH 大鼠腦組織氧化損傷及鐵積累的抑制，以及對神經(jīng)功能的改善。因此，本研究不僅為ICH后鐵死亡機制的研究提供參考，對于相應(yīng)藥物的開發(fā)也具有重要意義。但本研究僅限于體內(nèi)，今后尚需進行體外研究以豐富研究內(nèi)容。