石 凱，趙海兵，王 銳

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是新生兒死亡的主要原因，還可引起長期的神經后遺癥，如認知障礙、行為障礙或記憶問題。目前，亞低溫治療HIE有一定療效，但治療時間窗太窄，無法及時啟動[1]。因此，迫切需要探索新的有效的治療方法，以減少HIE的腦損傷和神經后遺癥。許多研究報道稱HIE發(fā)病機制很復雜，如凋亡、自噬、興奮性毒性、氧化應激和炎癥[2]。此外，有研究表明缺血缺氧會引起腦白質損傷，并可能導致脫髓鞘[3]。新生兒腦白質損傷可導致腦癱、運動和認知障礙[4]。白質約占人類大腦體積的60%,它主要由束狀軸突和膠質細胞組成，包括產生髓鞘的少突膠質細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞。髓鞘再生是成人中樞神經系統(tǒng)損傷后脫髓鞘軸突周圍產生新的髓鞘的過程。它是腦損傷后腦白質修復的重要再生機制之一。少突膠質細胞祖細胞(OPCs)分化為成熟的少突膠質細胞在髓鞘再生中起著重要作用。研究已經證實，在缺血性腦卒中中，OPCs向少突膠質細胞譜系分化，但這些細胞大多數(shù)未能發(fā)育為成熟的、有功能的少突膠質細胞[5]，從而導致腦白質恢復沒有改善。因此，促進OPCs分化為成熟少突膠質細胞和增強軸突髓鞘再生后腦白質損傷的恢復是改善HIE預后的一種有前景的治療方案。3,3′二吲哚甲烷(DIM)是一種選擇性芳香烴受體調節(jié)劑，存在于十字花科蔬菜，如西蘭花、抱子甘藍和卷心菜中。研究表明，DIM的神經保護潛能已在帕金森病和腦出血中得到證實[6-7]。但DIM對HIE的影響尚不清楚。本研究的主要目的是DIM是否能夠緩解HIE大鼠模型的腦損傷和神經功能缺損，并探討其機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:DIM購自Sigma-Aldrich公司；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司；引物由生工生物工程上海(股份)有限公司合成；逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM II PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；髓鞘堿性蛋白(MBP)、少突膠質細胞前體細胞血小板源性生長因子-α受體(PDGFR-α)、少突膠質細胞轉錄因子2(Olig2)、成熟少突膠質細胞標記物(APC)、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、p-CaMKⅡ、信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)、p-STAT3一抗均購自美國Stanta Cruz Biotechology公司；HRP標記二抗、Cy3紅色熒光二抗、Dylight 488綠色熒光二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司；激光共聚焦熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；光學顯微鏡購自德國Leica公司；Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)購自北京眾實迪創(chuàng)科技公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物：妊娠14 d的SD孕鼠，來源于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心(SCXK2015-0013)，飼養(yǎng)在溫度為(23±2)℃，濕度為50%～65%，12 h光照/黑暗循環(huán)的動物房中，允許動物自由獲得水和食物。動物實驗均根據美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南的建議進行。所有動物實驗均經我院動物倫理委員會批準。

1.2.2 構建動物模型和分組：將孕SD大鼠隨機分為假手術組和模型組。模型組孕鼠通過結扎在體妊娠足月孕大鼠雙側子宮動脈構建HIE動物模型，在妊娠第20 d麻醉孕鼠。中線剖腹手術后，暴露子宮動脈并結扎雙側子宮動脈，20 min后恢復子宮動脈血供。接下來將子宮放回腹腔，縫合皮膚切口。動物在4～8 h內蘇醒恢復，并可以自由獲得水和食物。假手術組未結扎雙側子宮動脈。孕鼠全部自然分娩，出生后將模型組新生大鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組(腹腔注射尼莫地平0.4 mg/kg)、DIM高劑量組(腹腔注射DIM 20 mg/kg)、DIM低劑量組(腹腔注射DIM 10 mg/kg)。假手術組和模型對照組注射等量的生理鹽水,均連續(xù)注射7 d，然后在麻醉下處死并提取腦組織，一部分置于4%多聚甲醛溶液中固定進行組織切片實驗，另一部分儲存于-80 ℃冰箱中用于RT-qPCR和Western blotting實驗。

1.2.3 Morris水迷宮實驗：各組于大鼠出生后4周進行Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力。迷宮是一個圓形水池(直徑160 cm，深60 cm)，在第二象限有一個可移動的圓柱形平臺，在平臺表面上方1.5 cm處裝滿溫水(23±2)℃。測試分為兩個階段：前5 d進行定向導航實驗，第6 d 進行空間搜索實驗。定向導航實驗：每天在同一時間進行4次訓練，間隔30 min，連續(xù)5 d。每次將大鼠隨機放置一個象限中，使其被迫尋找平臺，記錄大鼠平均逃避潛伏期。如果大鼠在90 s內未能找到平臺，它將被引導至平臺并停留20 s，逃避潛伏期記錄為90 s。第6 d 進行空間搜索試驗，移除平臺，將大鼠從第四象限釋放后允許其游泳90 s。記錄大鼠在90 s內穿過原平臺的次數(shù)。

1.2.4 HE染色：將大鼠麻醉后，解剖心臟，灌注0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛(各100 mL)，之后解剖腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。腦組織石蠟包埋，切片(5 μm)。然后根據說明書使用HE染色試劑盒對腦組織進行染色。最后使用光學顯微鏡觀察腦組織中的病理變化。

1.2.5 RT-qPCR實驗：使用TRIzol試劑從大鼠胼胝體腦組織中提取總RNA。使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR? Premix Ex TaqTM II PCR試劑盒以cDNA為模板進行PCR反應，反應條件為94 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，一共40個循環(huán)。使用2-ΔΔCT確定目標基因的相對表達水平。β-actin為內部對照。引物序列如下：MBP 上游：5′-ACACACGAGAACTACCCATTATCG-3′，下游：5′-AGAAATGGACTACTGGGTTTTCATCT-3′。β-actin 上游：5′-GGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3′，下游：5′-TGTCGTCCCAGTTGGTAACA-3′。

1.2.6 Western blotting：使用蛋白質提取試劑盒從大鼠胼胝體腦組織中提取總蛋白。使用BCA蛋白質測定試劑盒檢測蛋白質濃度。將蛋白質在12% SDS-PAGE凝膠電泳上分離并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜用5%脫脂牛奶溶液封閉，并用CaMKⅡ(1∶500)、p-CaMKⅡ(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、p-STAT3(1∶1 000)抗體在TBST中稀釋于4 ℃過夜。然后清洗膜3次，將膜與二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。用Super Signal West Pico化學發(fā)光底物檢測免疫反應性，并用Image J軟件進行定量。

1.2.7 免疫熒光染色實驗：將大鼠麻醉后，使用0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛連續(xù)灌注大鼠，取鼠腦在4%多聚甲醛中固定48 h，然后在2.5%瓊脂糖中包埋，制作腦切片，用0.5% Triton X-100滲透腦切片，然后在胎牛血清中孵育1 h。將腦切片與一抗(PDGFR-α、Olig2、APC)(1∶500)在4 ℃下孵育過夜，隨后與Cy3紅色熒光二抗、Dylight 488綠色熒光二抗在室溫下孵育2 h。另外，將腦切片與MBP一抗(1∶500)在4 ℃下孵育過夜，然后與Cy3標記的熒光二抗在室溫下孵育1 h，接下來用DAPI在室溫下避光孵育5 min。最后采用激光共聚焦熒光顯微鏡進行觀察并采集具有代表性的圖像。

2 結果

2.1 DIM對HIE新生大鼠學習認知能力的影響:Morris水迷宮實驗結果顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型對照組比較，DIM低、高劑量組和陽性對照組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)；與DIM低劑量組比較，DIM高劑量組和陽性對照組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)；與陽性對照組比較，DIM高劑量組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較

2.2 DIM對HIE新生大鼠腦白質病理學變化的影響:HE染色結果顯示，假手術組胼胝體細胞排列正常，結構清晰。模型組大鼠腦白質區(qū)胼胝體組織結構疏松，細胞水腫。與模型對照組比較，DIM低、高劑量組和陽性對照組劑量組大鼠腦白質區(qū)胼胝體組織結構較整齊，細胞水腫減少。與DIM低劑量組比較，DIM高劑量組和陽性對照組大鼠腦白質區(qū)胼胝體組織結構較完整，細胞輕度水腫，見圖1(封二)。

2.3 DIM對HIE新生大鼠胼胝體中MBP mRNA和蛋白水平的影響:RT-qPCR和Western blotting結果顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠胼胝體中MBP mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05)；與模型對照組比較，DIM低、高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中MBP mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與DIM低劑量組比較，DIM高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中MBP mRNA和蛋白水平升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，DIM高劑量組大鼠胼胝體中MBP mRNA和蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖2(封二)。

2.4 DIM對HIE新生大鼠胼胝體中MBP表達的影響:免疫熒光染色結果顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠胼胝體中MBP表達顯著降低；與模型對照組比較，DIM低、高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中MBP表達顯著升高；與DIM低劑量組比較，DIM高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中MBP表達升高；與陽性對照組比較，DIM高劑量組大鼠胼胝體中MBP表達無差異,見圖3(封二)。

2.5 DIM對HIE新生大鼠胼胝體少突膠質細胞成熟的影響:免疫熒光實驗觀察少突膠質細胞標記物Olig2和少突膠質細胞前體細胞標記物PDGFR-α或成熟少突膠質細胞標志物APC在胼胝體的分布，結果顯示，與假手術組比較，模型對照組胼胝體中PDGFR-α表達顯著升高，APC表達顯著降低；與模型對照組比較，DIM低、高劑量組和陽性對照組胼胝體中PDGFR-α表達顯著降低，APC表達顯著升高； 與DIM低劑量組比較，DIM高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中PDGFR-α表達降低，APC表達升高；與陽性對照組比較，DIM高劑量組大鼠胼胝體中PDGFR-α和APC表達無差異，見圖4(封二)。

2.6 DIM對HIE新生大鼠胼胝體中CaMKII/STAT3信號通路蛋白表達的影響:Western blotting結果顯示，與假手術組比較，模型對照組大鼠胼胝體中p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型對照組比較，DIM低、高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； 與DIM低劑量組比較，DIM高劑量組和陽性對照組大鼠胼胝體中p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平降低(P<0.05)，CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與陽性對照組比較，DIM高劑量組大鼠胼胝體中p-CaMKⅡ、p-STAT3 、CaMKⅡ和STAT3蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5(封二)。

3 討論

胎兒或新生兒期缺氧缺血性腦損傷是新生兒死亡和神經功能缺損的主要因素。目前HIE多采用低溫治療，但效果并不理想。許多患兒會產生永久性的神經系統(tǒng)后遺癥，如運動障礙、智力障礙等。

最近的研究表明，DIM是吲哚-3-甲醇的二聚體，具有抗氧化、抗癌以及神經保護作用[8]。有報道稱，DIM能抑制缺氧誘導的心肌細胞炎癥和細胞凋亡[9]。此外，DIM可以保護神經細胞免受缺血的影響[10]。以上研究說明DIM對缺血缺氧導致?lián)p傷的細胞具有保護作用。本研究通過結扎在體妊娠足月孕大鼠雙側子宮動脈構建HIE動物模型，研究DIM在新生兒神經系統(tǒng)疾病HIE中的作用。通過Morris水迷宮實驗評估空間學習和記憶能力，結果發(fā)現(xiàn)DIM處理后改善了缺血缺氧誘導的新生大鼠空間學習記憶障礙，表明DIM可能對HIE引起的學習記憶障礙有治療作用。

越來越多的研究報道稱白質損傷是多神經系統(tǒng)損傷的主要病理改變之一[11]。此外，隨著對腦白質在學習、記憶、情感等復雜腦功能中的深入研究，減少白質損傷成為進一步促進神經系統(tǒng)損傷后功能恢復的潛在目標[12]。本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)DIM可以減少HIE新生大鼠白質損傷，進一步通過Western blotting、RT-qPCR和免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)DIM可以改善HIE新生大鼠髓鞘損傷，增加髓鞘蛋白MBP的表達，減少脫髓鞘。大量研究表明，減少髓鞘丟失和促進少突膠質細胞成熟是改善脫髓鞘損傷的潛在機制[13]。少突膠質細胞發(fā)育的高峰在出生后2～6周，通過少突膠質前體細胞的增殖和分化，形成成熟的少突膠質細胞，發(fā)揮髓鞘化功能[14]。新生兒HIE的發(fā)病包含少突膠質細胞發(fā)育階段。早期適當?shù)母深A可以從一定程度上減少對少突膠質細胞發(fā)育的損害，從而挽救髓鞘形成過程，減少相關后遺癥的發(fā)生[15]。本研究結果顯示，HIE新生大鼠胼胝體PDGFR-α表達升高，表明HIE阻止了少突膠質細胞的成熟，使其處于不成熟狀態(tài)。此外，對Olig2和成熟少突膠質細胞的標記物APC進行雙染色，以評估HIE后少突膠質細胞的成熟情況。最終結果表明DIM可以促進少突膠質細胞的成熟，這對神經系統(tǒng)功能的恢復提供了很大幫助。

CaMK Ⅱ是突觸發(fā)生、突觸可塑性、學習和記憶的調節(jié)劑。當缺氧缺血發(fā)生時，細胞內游離的Ca2+增加，導致Ca2+/鈣調素復合物結合，進一步激活CaMK Ⅱ[16]。Wei等人證實抑制CaMK Ⅱ能降低缺血性腦卒中大鼠氧化應激水平[17]。STAT3在腦損傷的發(fā)生發(fā)展中也起著關鍵作用，抑制STAT3的磷酸化可具有神經保護作用[18]。研究報道稱，STAT3可被其上游激酶CaMK Ⅱ激活。IL-6通過激活CaMK Ⅱ-STAT3通路參與了缺氧誘導有絲分裂因子引起的心肌肥厚[19]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，在HIE后CaMKⅡ和STAT3蛋白量不變，p-CaMKⅡ、p-STAT3蛋白水平顯著升高，說明HIE處理促進了STAT3/CaMK Ⅱ通路蛋白的活性。而DIM治療顯著逆轉這一結果表明,DIM可能通過抑制STAT3/CaMK Ⅱ通路發(fā)揮神經保護作用。

綜上所述，本研究結果表明DIM對缺氧缺血性腦損傷具有重要的神經保護作用。DIM可通過促進少突膠質細胞成熟和改善髓鞘化，減輕新生大鼠HIE后的腦白質損傷，改善HIE新生大鼠的認知功能，這些保護作用可能與抑制CaMK Ⅱ-STAT3通路有關。