王葉青, 劉 芳, 潘紀(jì)源, 陸秀君*,, 劉文菊, 李博文*,

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

河北省滄州市青縣 ‘羊角脆’ 甜瓜具有口感香甜酥脆、皮薄肉嫩等特點(diǎn)，被認(rèn)定為中國地理標(biāo)志產(chǎn)品，但由于種植模式單一，輪作倒茬困難，甜瓜枯萎病等土傳病害發(fā)生嚴(yán)重，成為制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素[1]。長期連作可能導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成多種植物病原菌富集[2]。甜瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌甜瓜專化型Fusarium oxysporumf. sp.melonis引起的典型土傳病害，同時也是連作障礙產(chǎn)生的主要原因，全生育期均可發(fā)生，尤其在甜瓜伸蔓期到結(jié)瓜期發(fā)病最重，植株發(fā)病后莖基部變褐縊縮猝倒，嚴(yán)重時整株死亡[2]，易造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

目前生產(chǎn)上防治甜瓜枯萎病的主要措施有嫁接育苗和化學(xué)防治。嫁接育苗是緩解甜瓜枯萎病的有效栽培措施之一，常采用抗病南瓜品種作為甜瓜嫁接苗的砧木，以降低甜瓜枯萎病的發(fā)病率，但對于長期連作發(fā)病較重的地塊，嫁接育苗也無法緩解其影響，還可能導(dǎo)致甜瓜品質(zhì)降低。本研究團(tuán)隊(duì)前期在河北省青縣甜瓜連作區(qū)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，農(nóng)民為了保留甜瓜的特有品質(zhì)和降低生產(chǎn)成本，自己培育甜瓜苗的狀況仍有一定比例，即只能單純依賴化學(xué)藥劑防治甜瓜枯萎病。噁霉靈(hymexazol) 是一種高效內(nèi)吸性殺菌劑，同時也是植物生長調(diào)節(jié)劑，持效期長，對鐮刀菌引起的多種病害有一定的治療效果，尤其對甜瓜枯萎菌的抑制效果優(yōu)于其他藥劑[3]。

長期不合理使用所造成的農(nóng)藥殘留及病原菌抗藥性等問題，導(dǎo)致化學(xué)藥劑的應(yīng)用越來越受到限制，利用生防菌劑替代部分化學(xué)藥劑已日益引起科研工作者的關(guān)注[4]。芽孢桿菌屬 (Bacillus) 是一類應(yīng)用廣泛的植物病害生防細(xì)菌[4]，其中，巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium是一種具有解磷、促生長和抑菌、抗逆等多種作用的功能型細(xì)菌，其在土壤修復(fù)及抗逆等方面已得到廣泛研究和應(yīng)用[5]。單因素處理對甜瓜枯萎病等連作病害的治療效果存在一定的局限性，因此，聯(lián)合應(yīng)用殺菌劑和生防菌，發(fā)揮其互補(bǔ)優(yōu)勢防治植物病害的研究受到了廣泛關(guān)注。已有研究表明，枯草芽孢桿菌B. subtilis與噁霉靈混用對番茄根腐病具有很好的防治效果，同時還可促進(jìn)植株生長[6]。王炎峰等[7]將噁霉靈與綠針假單胞菌Pseudomonas chlororaphisG5 菌株發(fā)酵液復(fù)配后施用，對盆栽苦瓜枯萎病的防治效果達(dá)到81.60%。另外，莊敬華等[8]研究發(fā)現(xiàn)，木霉屬 (Trichoderma) 真菌與噁霉靈在一定濃度下具有協(xié)同增效作用，對甜瓜枯萎病的防效可達(dá)到79.27%，效果優(yōu)于單因素處理。目前尚未見關(guān)于將巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用處理連作土壤以防治甜瓜枯萎病的研究報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對基質(zhì)培育南瓜幼苗的生長有促進(jìn)作用，同時還可預(yù)防苗期病害的發(fā)生(未報(bào)道)。本研究于河北省青縣采集連作甜瓜土壤，通過盆栽試驗(yàn)探究了連作土壤對甜瓜及南瓜幼苗生長的影響，分析了土壤微生物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)的變化。在明確連作障礙的基礎(chǔ)上，分離得到甜瓜枯萎菌 T2 菌株，利用連作土壤進(jìn)行盆栽育苗試驗(yàn)，研究了巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜枯萎病的緩解效果以及對甜瓜植株生長的影響，在此基礎(chǔ)上，通過田間試驗(yàn)，分析了巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜枯萎病的緩解效果及對土壤微生物優(yōu)勢屬的影響，以期為甜瓜的安全高效生產(chǎn)和緩解連作障礙提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：甜瓜枯萎菌Fusarium oxysporumT2菌株，于河北省青縣連續(xù)單作11 年甜瓜的土壤中分離得到，經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定[3]，并委托美吉生物進(jìn)行了分子鑒定；巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumb1 菌株，本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存的菌種。

藥劑：99% 噁霉靈 (hymexazol) 原粉，河北賽瑞德化工有限公司。

供試作物：南瓜種子 ‘金媽媽619’ 購自永清縣興晟農(nóng)業(yè)有限公司，甜瓜種子 ‘白蜜玉F1’ 由青縣齊營村根枝葉蔬菜種植專業(yè)合作社提供。

供試土壤：取自河北省滄州市青縣齊營村根枝葉蔬菜種植專業(yè)合作社 (116° 44′ 19′ E；38° 32′ 6′ N) ，多年連續(xù)種植 ‘羊角脆’ 甜瓜，試驗(yàn)地塊均采取一年一大茬模式連續(xù)單作甜瓜：1 月定植，9 月中旬拉秧，之后整地，期間未種植其他作物。2018 年1 月于甜瓜定植前分別采集1 年新土以及連續(xù)單作6 年和11 年的土壤，用于連作障礙分析、微生物數(shù)量和群落優(yōu)勢屬相對豐度分析及連作障礙緩解相關(guān)盆栽試驗(yàn)；田間試驗(yàn)在連續(xù)單作11 年的溫室進(jìn)行，于甜瓜定植10 d 時分別選取各處理土壤樣本進(jìn)行土壤微生物優(yōu)勢屬豐度分析。

試驗(yàn)基質(zhì)：草炭、珍珠巖與蛭石質(zhì)量比為13 :3 : 4，其中含堿解氮942.48 mg/kg、速效磷1.61 mg/kg、速效鉀305.64 mg/kg、有機(jī)質(zhì)440.14 g/kg，pH 值 5.85。

培養(yǎng)基：PDA (馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL)、LB (酵母5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，固體瓊脂12 g，蒸餾水1 000 mL) 和改良高氏一號 (可濕性淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL) 培養(yǎng)基分別用于分離土壤真菌、細(xì)菌和放線菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 連作甜瓜土壤對南瓜及甜瓜幼苗生長的影響測定 參考李青梅等[9]的方法，采用穴盤試驗(yàn)測定連續(xù)單作6 年和11 年的甜瓜土壤對南瓜及甜瓜幼苗長勢的影響，以1 年新土為對照。逐日記錄南瓜及甜瓜出苗情況，統(tǒng)計(jì)出苗率；10 d后取南瓜和甜瓜幼苗，洗凈，測量根長、株高，將地下部根和地上部植株分別裝袋，于105 ℃高溫殺青30 min，75 ℃下烘干至恒重，稱量，計(jì)算根冠比，統(tǒng)計(jì)各處理植株干重。比較各處理根長、株高、干重和根冠比等指標(biāo)的差異，分析連作甜瓜土壤對南瓜和甜瓜幼苗生長的影響。

1.2.2 連作甜瓜對土壤中微生物的影響測定

1.2.2.1 對微生物數(shù)量的影響 參考Zhao 等[10]的方法，分別選用PDA 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基和改良高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行土壤真菌、細(xì)菌和放線菌的分離培養(yǎng)，每處理設(shè)3 次重復(fù)，對不同土壤樣品中可培養(yǎng)放線菌、細(xì)菌和真菌的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比較不同連作時間土壤樣品中微生物數(shù)量的差異。

1.2.2.2 對真菌和細(xì)菌優(yōu)勢屬豐度的影響 參考Zhao 等[10]的方法，試驗(yàn)委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。對不同連作年份的土壤樣品進(jìn)行基因組DNA 提取及質(zhì)量檢測，以土樣中提取的微生物基因組DNA 為模板，對真菌和細(xì)菌16S rDNA 的分子序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)建庫檢測，在Illumina MiSeq 平臺上進(jìn)行高通量測序，對測序所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用R D P classifier 貝葉斯算法與SILVA 和UNITE 數(shù)據(jù)庫，對97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)各樣本在各個水平上的群落組成。選取優(yōu)勢真菌鐮刀菌屬 (Fusarium) 和細(xì)菌芽孢桿菌屬 (Bacillus) 為例，分析連作甜瓜對土壤微生物優(yōu)勢屬相對豐度的影響。

1.2.3 噁霉靈與巨大芽孢桿菌的相容性及對甜瓜枯萎菌的抑制作用測定 參考前文[11]方法進(jìn)行噁霉靈與巨大芽孢桿菌的相容性試驗(yàn)，噁霉靈終濃度分別為質(zhì)量濃度100、50 和25 mg/L ，以滅菌水為對照，每處理4 次重復(fù)。在此基礎(chǔ)上，采用菌絲生長速率法分別測定噁霉靈與巨大芽孢桿菌對甜瓜枯萎菌T2 菌株的抑制作用。將巨大芽孢桿菌b1 菌株懸液用滅菌水逐級稀釋至1 × 103～1 ×107CFU/mL 5 個濃度，打取直徑6 mm 的甜瓜枯萎菌菌碟，接種于PDA 平皿中心，取滅菌濾紙片，浸潤巨大芽孢桿菌懸液后呈品字型放置于平皿邊緣處。按照噁霉靈和培養(yǎng)基體積比1 : 9 的比例制作含藥PDA 平板，噁霉靈系列質(zhì)量濃度分別為62.5、125、250、500 和1 000 mg/L，將6 mm的甜瓜枯萎菌菌碟接種于平皿中心。以無菌水處理為對照，25 ℃培養(yǎng)6 d 后，用十字交叉法測量菌落直徑，每處理重復(fù)3 次，按公式 (1) 計(jì)算抑制率。采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算毒力回歸方程，求出EC50值。

其中，I表示菌絲生長抑制率，%；Dc表示對照菌落直徑，mm；Dt表示處理菌落直徑，mm。

1.2.4 聯(lián)用對連作土壤甜瓜枯萎病的緩解效果測定 分別通過盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)進(jìn)行。

1.2.4.1 盆栽試驗(yàn) 將培養(yǎng)好的b1 菌株懸液用滅菌水稀釋至2 × 105CFU/mL，噁霉靈原粉用滅菌水稀釋至125 和62.5 mg/L。針對連續(xù)單作11 年的甜瓜土壤，分別設(shè)如下處理：b1 菌株，2 × 105CFU/mL；噁霉靈，125 mg/L；b1 菌株 (2 × 105CFU/mL) + 噁霉靈 (62.5 mg/L)；以滅菌水處理為對照。每盆裝土3 kg，播2 粒甜瓜種子，每重復(fù)10 盆，每處理重復(fù)3 次。26 ℃溫室中保濕培養(yǎng)，于開花結(jié)果期調(diào)查并記錄甜瓜枯萎病的發(fā)病情況，病情分級標(biāo)準(zhǔn)采用莊敬華等的[10]方法。按公式 (2) 和 (3) 分別計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。

其中：DI 為病情指數(shù)；DN 為各級發(fā)病株數(shù)；GN 為各級代表值；DT 為調(diào)查總株數(shù)；CE為防治效果，%；DIC 為對照組病情指數(shù)；DIT 為處理組病情指數(shù)。

1.2.4.2 田間試驗(yàn) 于河北省滄州市青縣齊營村根枝葉蔬菜種植專業(yè)合作社基地日光溫室進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組排列，藥劑處理與盆栽試驗(yàn)相同，每處理分別設(shè)3 個重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)面積為33.6 m2。甜瓜苗于2020 年1 月定植，株距30 cm，行距90 cm，采用高壟雙行栽培模式，于定植前7 d 按常規(guī)施肥量施足底肥、旋耕整地起壟。于100 L水中加入12.5 g 噁霉靈原粉和200 mL b1 菌株懸液 (2 × 108CFU/mL)，采用蘸根處理，分別以兩種單劑處理和未處理區(qū)為對照。于開花結(jié)果期調(diào)查死苗情況，統(tǒng)計(jì)甜瓜枯萎病發(fā)病率和防治效果，計(jì)算公式見式(4) 和式(5)，分析巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對甜瓜枯萎病的影響。

式中：D 為發(fā)病率，%；DN 為發(fā)病株數(shù)；DT 為調(diào)查總株數(shù)；CE 為防治效果，%；DC為對照組發(fā)病率，%；DT為處理組發(fā)病率，%。

1.2.5 聯(lián)用對連作土壤甜瓜生長的影響測定 本部分試驗(yàn)與1.2.4 節(jié)的試驗(yàn)同時進(jìn)行。1.2.5.1 盆栽試驗(yàn) 逐日記錄甜瓜出苗率，于苗期及開花結(jié)果期調(diào)查記錄植株地上部分和地下部分干重，按式(6) 計(jì)算根冠比，分析巨大芽孢桿菌b1菌株與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜生長的影響。

式中：RSR 為根冠比；RW 為地下部分干重，g；SW 為地上部分干重，g。

1.2.5.2 田間試驗(yàn) 分別于甜瓜定植10 d 后調(diào)查不同處理組株高；于甜瓜植株拉秧后，每處理隨機(jī)挑選5 株，將根自嫁接口位置切下，每處理分別裝袋，105 ℃高溫殺青30 min，75 ℃下烘干至恒重，統(tǒng)計(jì)不同處理組單株根重；于收獲期調(diào)查甜瓜果實(shí)質(zhì)量，計(jì)算不同處理組甜瓜產(chǎn)量。

1.2.6 聯(lián)用對連作甜瓜土壤中微生物優(yōu)勢屬豐度的影響測定 于甜瓜定植后10 d，分別采集1.2.4節(jié)田間試驗(yàn)各處理組土壤樣品，采用1.2.2.2 節(jié)方法，以其中優(yōu)勢真菌和細(xì)菌為例，比較不同處理組土壤中鐮刀菌屬和芽孢桿菌屬 的相對豐度，分析巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對田間連作甜瓜土壤中微生物優(yōu)勢屬的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作甜瓜土壤對南瓜及甜瓜幼苗生長的影響

采用不同連作年份甜瓜土壤分別穴盤培育南瓜及甜瓜幼苗，結(jié)果表明：1 年連作土壤組南瓜根長、株高、根冠比和干重等指標(biāo)均高于連續(xù)單作6 年和11 年土壤，且與11 年連續(xù)單作土壤間差異顯著；11 年連續(xù)單作土壤組南瓜及甜瓜幼苗全株干重均低于1 年土壤組，其中甜瓜幼苗全株干重比1 年土壤組低23.53%，差異顯著 (表1)。研究表明，11 年連續(xù)單作甜瓜土壤表現(xiàn)出較為明顯的連作障礙。

表1 連作甜瓜土壤對南瓜及甜瓜幼苗生長的影響Table 1 Effects of continuous cropping melon soil on the growth of pumpkin and melon seedlings

2.2 連作甜瓜對土壤中微生物的影響

2.2.1 對土壤中微生物數(shù)量的影響 不同連作年份甜瓜根際土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的變化見表2。從中可看出，甜瓜連作可導(dǎo)致土壤中細(xì)菌數(shù)量減少，真菌數(shù)量增加。其中，甜瓜連續(xù)單作11 年土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量最少，分別比1 年土壤組低1.66 和1.78 倍，且與1 年土壤間差異顯著；而11 年連續(xù)單作土壤中真菌數(shù)量是1 年土壤的10 倍，且與其他各處理組間差異顯著。

表2 不同連作年份甜瓜土壤中微生物種群數(shù)量變化Table 2 Changes in microbial populations in melon soil with different continuous cropping years

2.2.2 對土壤中真菌和細(xì)菌優(yōu)勢屬豐度的影響

鐮刀菌屬包含多種常見植物致病菌，甜瓜枯萎菌即屬于該屬。對不同連作年限土壤中微生物群落的分析(圖1) 表明，隨著甜瓜連作年限的增加，土壤中鐮刀菌屬的相對豐度發(fā)生了明顯變化 。其中，在連續(xù)單作11 年甜瓜的土壤中，鐮刀菌屬成為優(yōu)勢屬，相對豐度 (13.2%) 是1 年土壤的4.27 倍，差異顯著。 芽孢桿菌屬包含多種可用于防治植物病害的生防菌，有利于植物生長。試驗(yàn)表明，隨著甜瓜連作年限增加，土壤微生物中芽孢桿菌屬豐度也發(fā)生了明顯的變化，其中，11 年連續(xù)單作土壤中芽孢桿菌屬的相對豐度最低，1 年土壤中最高，是11 年土壤的2.65 倍，差異顯著。

圖1 屬分類水平下不同連作年限土壤中鐮刀菌屬和芽孢桿菌屬的相對豐度Fig. 1 The relative abundance of Fusarium and Bacillus under different continuous cropping years

2.3 噁霉靈和巨大芽孢桿菌的相容性及對甜瓜枯萎菌的抑制作用

拮抗作用測定結(jié)果表明，當(dāng)噁霉靈終濃度為100、50 和25 mg/L，b1 菌株活菌數(shù)為1.30 × 108、1.26 × 108和1.23 × 108CFU/mL，而空白對照為1.23 × 108CFU/mL，各處理與空白對照間差異均不顯著，表明將質(zhì)量濃度低于100 mg/L 的噁霉靈與巨大芽孢桿菌b1 菌株聯(lián)用是可行的。

噁霉靈與 b1 菌株對甜瓜枯萎菌T2 菌株的抑制活性測定結(jié)果見表3。二者對T2 菌株都具有一定的抑制作用，EC50值分別為10.82 mg/L 和2.02 ×105CFU/mL。

表3 噁霉靈和巨大芽孢桿菌b1 菌株對甜瓜枯萎菌T2 菌株的抑制作用Table 3 Inhibitory effect of hymexazol and B. megaterium b1 on F. oxysporum T2

2.4 巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜枯萎病的緩解效果

開花結(jié)果期是甜瓜枯萎病發(fā)病高峰期。室內(nèi)盆栽試驗(yàn)調(diào)查結(jié)果見表4，其中巨大芽孢桿菌 b1菌株 + 噁霉靈處理組發(fā)病率最低，病情指數(shù)最小，防效達(dá)42.85%，與空白對照間差異顯著。說明將噁霉靈劑量減半后與巨大芽孢桿菌聯(lián)用，優(yōu)于兩種單劑處理，即可用巨大芽孢桿菌替代部分噁霉靈防控甜瓜枯萎病，達(dá)到減施化學(xué)藥劑的目的。

表4 巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜枯萎病的盆栽試驗(yàn)防效Table 4 Effect of B. megaterium b1 and hymexazol on Fusarium wilt of melon in continuous cropping soil in the lab

通過田間試驗(yàn)調(diào)查不同處理組全生育期甜瓜枯萎病發(fā)病情況，結(jié)果見表5。采用巨大芽孢桿菌、噁霉靈單劑以及兩者聯(lián)用處理連作甜瓜土壤后，甜瓜枯萎病發(fā)病率分別比對照降低了24.77%、100%和100%，防效分別為16.62%、100%和100%。說明將巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用可有效防控甜瓜枯萎病，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。

表5 巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜枯萎病的田間防效Table 5 Effects of B. megaterium b1 and hymexazol on Fusarium wilt of melon in continuous cropping soil in the field

2.5 巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤甜瓜生長的影響

室內(nèi)采用連續(xù)單作11 年甜瓜的土壤盆栽培育甜瓜，測定巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對甜瓜生長的影響，結(jié)果見表6。其中，在甜瓜苗期和伸蔓期，兩者聯(lián)用處理組全株干重分別比CK 組增加了100%和205%，且與其他處理組及CK 間差異顯著；在甜瓜開花結(jié)果期，經(jīng)兩者聯(lián)用處理的甜瓜根冠比及全株干重分別比CK 組增加了50%和196.19%。

表6 巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對連作土壤室內(nèi)培育甜瓜植株生長的影響Table 6 Effects of B. megaterium b1 and hymexazol on the growth of melon in continuous cropping soil in the lab

田間試驗(yàn)結(jié)果見表7。于甜瓜定植10 d 后開始調(diào)查，巨大芽孢桿菌b1 菌株、噁霉靈單劑以及兩者聯(lián)用組甜瓜幼苗株高分別比空白對照高11.19%、10.63%和16.03%，其中聯(lián)用處理組與空白對照間差異顯著。于甜瓜收獲期調(diào)查產(chǎn)量，與空白對照相比，各處理組甜瓜增產(chǎn)率分別為20.35%、11.23%和26.15%，但各處理與對照間差異不顯著。于甜瓜拉秧期調(diào)查統(tǒng)計(jì)根系干重，結(jié)果表明，各處理組單株根系平均干重分別比空白對照提高40.63%、34.69%和64.38%，差異顯著。

表7 巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對田間連作甜瓜生長的影響Table 7 Effects of B. megaterium b1 and hymexazol on the growth of melon in continuous cropping soil in the field

綜上可見，巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用可以促進(jìn)甜瓜幼苗生長，對采用連作甜瓜土壤種植的甜瓜根系生長具有促進(jìn)作用，且優(yōu)于單劑處理，同時可促進(jìn)甜瓜開花結(jié)果，增加產(chǎn)量。表明將巨大芽孢桿菌b1 菌株與降低50%質(zhì)量濃度的噁霉靈聯(lián)用，對甜瓜的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用，可有效緩解連作土壤引起的連作障礙。

2.6 巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用對連作甜瓜土壤中微生物的影響

2.6.1 對土壤中微生物數(shù)量的影響 結(jié)果見表8。通過巨大芽孢桿菌、噁霉靈單劑及二者聯(lián)用處理后，甜瓜連作土壤中細(xì)菌數(shù)量顯著提高，分別是空白對照組的5.28、4.75 和6.36 倍，且聯(lián)用與空白對照和各單劑處理間均差異顯著；經(jīng)各單劑及聯(lián)用處理后，土壤中真菌數(shù)量顯著降低，分別比空白對照組降低59.45%、84.62%和86.01%；放線菌數(shù)量升高，各處理分別是空白對照組的2.78、1.19 和2.08 倍，其中，巨大芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌 + 噁霉靈處理與空白對照間差異顯著，但噁霉靈單劑與空白對照間差異不顯著。研究表明，巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用可有效改善連作甜瓜根區(qū)土壤的微生物環(huán)境。

表8 巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用對甜瓜連作土壤中微生物數(shù)量的影響Table 8 Effects of the combined use of B. megaterium b1 strain and hymexazol on the microbial population in continuous cropping melon soil

2.6.2 對土壤中真菌和細(xì)菌優(yōu)勢屬豐度的影響

根據(jù)高通量測序及統(tǒng)計(jì)結(jié)果，不同處理組土壤中真菌優(yōu)勢屬鐮刀菌屬和細(xì)菌優(yōu)勢屬芽孢桿菌屬相對豐度變化如圖2 所示。經(jīng)巨大芽孢桿菌、噁霉靈單劑以及二者聯(lián)用處理后，與空白對照相比，土壤中鐮刀菌屬相對豐度均降低，而芽孢桿菌屬相對豐度均提高。其中，巨大芽孢桿菌、噁霉靈、巨大芽孢桿菌 + 噁霉靈及對照土壤中鐮刀菌屬相對豐度分別為1.14%、0.72%、0.50% 和1.78%，處理組分別比空白對照降低35.96%、59.55%和71.91%，但各處理與對照間差異均不顯著；各處理和對照土壤中芽孢桿菌屬相對豐度分別為4.71%、6.70%、8.04%和4.55%，各處理組分別比空白對照提高47.25%、3.52%和76.70%，但差異均不顯著 (P＞0.05)。表明巨大芽孢桿菌b1 菌株與噁霉靈聯(lián)用可影響土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，減輕連作導(dǎo)致的土壤微生物“真菌化”現(xiàn)象。

圖2 不同處理對連作甜瓜土壤中鐮刀菌屬和芽孢桿菌屬相對豐度的影響Fig. 2 Effects of different treatments on the relative abundance of Fusarium and Bacillus in continuous cropping melon soil

3 結(jié)論與討論

連作障礙可使植物的生長發(fā)育受到抑制，對其生長指標(biāo)產(chǎn)生影響[2]。根冠比和全株干重是評價植株長勢的重要生理指標(biāo)。本研究通過穴盤試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，11 年連續(xù)單作甜瓜土壤組南瓜和甜瓜幼苗根冠比均最低，且與1 年土壤間存在顯著差異，說明甜瓜連作存在明顯的連作障礙。Cui 等[12]的研究表明，土壤微生物群落變化是導(dǎo)致連作障礙的主要原因，本研究也得到了相似的結(jié)論。本研究連作甜瓜土壤中微生物群落變化主要表現(xiàn)為真菌數(shù)量上升，而細(xì)菌數(shù)量下降，且優(yōu)勢菌群發(fā)生了明顯變化，其中包含甜瓜枯萎菌在內(nèi)的鐮刀菌屬逐年富集，而芽孢桿菌屬等有益細(xì)菌逐年減少。本課題組前期對棚室連作黃瓜的研究表明，施用巨大芽孢桿菌可以增加有益細(xì)菌屬的相對豐度，同時顯著抑制致病菌屬的發(fā)生[10]。本研究結(jié)果表明，巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用可使真菌數(shù)量降低，細(xì)菌數(shù)量升高，表明巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用能夠改善土壤微生物組成，修復(fù)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

為了提高對枯萎病的防控效果，減少噁霉靈等化學(xué)藥劑的使用，開發(fā)芽孢桿菌等生防菌劑一直是生防研究領(lǐng)域的重要方向[13]。文獻(xiàn)資料表明，芽孢桿菌代謝過程中能夠產(chǎn)生脂肽類抗生素及抗菌蛋白等多種抑菌物質(zhì)，對多種農(nóng)業(yè)植物病原真菌和細(xì)菌有明顯的抑制作用[13-14]。巨大芽孢桿菌具有解磷功能，是重要的肥用微生物，田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該菌劑在多種蔬菜田間應(yīng)用后增產(chǎn)效果顯著，表現(xiàn)出明顯的促生和抗病效應(yīng)，同時對連作障礙有明顯的緩解效應(yīng)[10]。為了明確其促生和抗病機(jī)制，以及對連作土壤的緩解機(jī)制，本課題組對巨大芽孢桿菌b1 菌株全基因組序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該菌株不僅具有解磷相關(guān)基因，還存在嗜鐵素及多種脂肽類抗生素等相關(guān)基因 (待發(fā)表)。這些發(fā)現(xiàn)為巨大芽孢桿菌的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

之前已有研究者進(jìn)行了噁霉靈與其他成分聯(lián)用對枯萎病防治效果的有益嘗試。丁蕾等[15]研究發(fā)現(xiàn)，將胺鮮酯 (diethyl aminoethyl hexanoate)、蕓苔素 (brassin) 與噁霉靈三者聯(lián)用，對西瓜枯萎病的預(yù)防作用效果顯著，但尚未見有關(guān)噁霉靈與芽孢桿菌聯(lián)用防治甜瓜枯萎病的研究報(bào)道。本研究通過溫室盆栽和田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將巨大芽孢桿菌與噁霉靈聯(lián)用，對甜瓜枯萎病的防治效果優(yōu)于各單劑處理。分析其原因，可能是由于巨大芽孢桿菌與噁霉靈均具有壯苗促生作用，且低劑量的噁霉靈影響了土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)，在抑制土壤或植株內(nèi)病原菌及其他微生物的同時，還可以為生防菌創(chuàng)造一個特殊的生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)其快速穩(wěn)定定殖，使生防菌得以在植物根系形成有效群體，有助于其充分發(fā)揮防治病害的作用。