楊可心, 畢秋艷, 吳 杰, 路 粉, 王文橋, 韓秀英, 趙建江

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 植物保護研究所，河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北 保定 071000)

灰葡萄孢Botrytis cinerea可侵染番茄的莖、葉、花和果實等部位，引起灰霉病?；颐共∈窃O(shè)施番茄生產(chǎn)上的重要病害，一般可造成番茄減產(chǎn)10%～20%，嚴重時達60%以上[1]。目前化學(xué)防治仍是控制該病害的主要手段。然而，灰葡萄孢具有繁殖速度快、遺傳變異大和田間適合度高等特點，已被國際殺菌劑抗性行動委員會 (Fungicide Resistance Action Committee, FRAC) 劃分為具有高抗藥性風(fēng)險的病原菌。目前，多個國家報道了不同作物上的灰葡萄孢已對苯并咪唑類的多菌靈、N-苯氨基甲酸酯類的乙霉威、二甲酰亞胺類的異菌脲和苯氨基嘧啶類的嘧霉胺等多種殺菌劑產(chǎn)生了抗性[2-5]。

氟唑菌酰羥胺是由先正達公司于2018 年研發(fā)上市的新型琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHIs) 殺菌劑，其通過抑制病原菌呼吸作用電子傳遞鏈中琥珀酸脫氫酶的活性阻礙其能量代謝，從而顯示出抑菌活性[6]。氟唑菌酰羥胺對禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum和大豆尾孢菌Cercospora sojina等病原菌均具有良好的抑制作用[7-9]。目前，該藥劑已在中國登記用于防治小麥赤霉病和油菜菌核病[10]。

前期研究表明，氟唑菌酰羥胺對番茄灰霉病具有良好的防治效果[11]。SDHI 類殺菌劑由于其作用位點單一已被FRAC 歸為中度抗性風(fēng)險殺菌劑，而有關(guān)氟唑菌酰羥胺不同敏感型灰葡萄孢菌株的抗性遺傳穩(wěn)定性、產(chǎn)孢量、致病性等生物學(xué)性狀如何尚未見報道。鑒于此，本研究以灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺具有不同敏感性的菌株為研究對象，比較不同水平抗性菌株與敏感菌株之間的生物學(xué)性狀的差異，研究抗氟唑菌酰羥胺灰葡萄孢菌株的適合度，旨在為灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺的抗性治理及氟唑菌酰羥胺的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 供試藥劑 98%氟唑菌酰羥胺 (pydiflumetofen)原藥，先正達 (中國) 投資有限公司。將原藥溶于適量甲醇中，配成104mg/L 母液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水定容至1 L。

WA 培養(yǎng)基：瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1 L。

PA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，瓊脂粉15 g/L，蒸餾水定容至1 L。

1.1.3 供試菌株 從田間發(fā)病的番茄果實上采集分離并經(jīng)敏感性測定后，選取8 個灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株，分別為：敏感菌株BLH5 和WP7，低抗菌株WP8 和WP9，中抗菌株WP3 和WP6，以及高抗菌株WPE8 和WPE9。實驗室馴化高抗菌株BLH5F，由敏感菌株BLH5在含10 mg/L 氟唑菌酰羥胺的PDA 培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，逐步提高藥劑濃度，直至菌株能在含500 mg/L 氟唑菌酰羥胺的PDA 平板上生長而獲得抗性菌株[12]。依據(jù)灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺的敏感基線 ( 0.3717 ± 0.2744 ) mg/L[11]，參照聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)抗藥性劃分標(biāo)準(zhǔn)[13]，即測試菌株的EC50值是敏感基線的5～10 倍即為抗性菌株。本研究中抗藥性水平的劃分依據(jù)抗性倍數(shù) (resistance factor, RF)，劃分標(biāo)準(zhǔn)為[4]： RF＜10 的為敏感菌株(S)；10≤RF＜50 的為低抗菌株 (LR)；50≤RF＜100 為中抗菌株 (MR)；RF≥100 的為高抗菌株 (HR) (RF = 供試菌株EC50/敏感基線)。

1.1.4 供試儀器 BX51 顯微鏡 ，奧林巴斯株式會社；DYY-8C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株抗性遺傳穩(wěn)定性測定 分別將各供試菌株在無藥PDA 平板上以菌絲體繼代培養(yǎng)10 代，每代培養(yǎng)3 d。將第1 代和第10 代菌株接種至含不同質(zhì)量濃度氟唑菌酰羥胺的PDA 平板上 (抗藥性菌株接種的藥劑質(zhì)量濃度為500、100、50、10、5 和1 mg/L；敏感菌株接種的藥劑質(zhì)量濃度為10、5、1、0.5、0.1 和0.05 mg/L)，于24 ℃下培養(yǎng)72 h 后，采用十字交叉法測量各處理菌落直徑 (mm)。每處理重復(fù)3 次，計算藥劑對各菌株的EC50值和各抗性菌株的抗性倍數(shù) (RF = 抗性菌株EC50值/敏感基線)及敏感性變異指數(shù) (FSC = RF第10代/RF第1代)[14]。

1.2.2 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及致病性測定

1.2.2.1 菌絲生長速率的測定 采用菌絲生長速率法[15]分別將各供試菌株 (直徑5 mm) 接種至PDA平板上，于24 ℃ 黑暗培養(yǎng) 72 h 后測量菌落直徑。每個菌株重復(fù)3 次，計算菌絲生長速率。試驗重復(fù)3 次。

1.2.2.2 產(chǎn)孢量的測定 各菌株先在24 ℃下培養(yǎng)72 h 后，再在黑暗條件下培養(yǎng)7 d。向每個平板中加入無菌水10 mL，用涂布器刮下分生孢子，然后用4 層紗布過濾孢子懸浮液，并將孢子懸浮液定容至10 mL，在振蕩器上振蕩 1 min 使孢子充分分散均勻。用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，測定各菌株的產(chǎn)孢量[16]。試驗重復(fù)3 次。

1.2.2.3 孢子萌發(fā)率的測定 將孢子懸浮液用無菌水配制成孢子濃度為105個/mL。取 40 μL 孢子懸浮液均勻涂布在WA 平板上，于 23 ℃、黑暗條件下培養(yǎng) 10 h，調(diào)查分生孢子萌發(fā)情況，計算各菌株分生孢子的萌發(fā)率[16]。試驗重復(fù)3 次。

1.2.2.4 致病性的測定 將各供試菌株 (直徑5 mm) 分別接種至番茄葉片背面中央，葉柄用脫脂棉裹好，置于鋪有濕濾紙的150 mm 的培養(yǎng)皿中，于24 ℃、照度10 000 lx 下培養(yǎng)2 d 后，采用十字交叉法測量各菌株的病斑直徑。每處理重復(fù)5 次，試驗重復(fù)3 次。

三是完善鄉(xiāng)村治理機制。實施鄉(xiāng)村振興，強化鄉(xiāng)村治理，迫切需要一系列制度的跟進。要根據(jù)變化發(fā)展的鄉(xiāng)村實際，加大涉農(nóng)立法修法力度，讓進一步修正完善的各項涉農(nóng)法律法規(guī)規(guī)章更加符合農(nóng)村實際、更加切合農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革需要、更能滿足廣大農(nóng)民追求美好生活的期待。要在不斷完善的涉農(nóng)立法構(gòu)架下建立健全鄉(xiāng)村治理機制。進一步完善鄉(xiāng)村治理的法治體系、責(zé)任體系和各項監(jiān)管制度，讓鄉(xiāng)村治理步入社會化、法治化、智能化、專業(yè)化軌道。

1.2.3 對溫度的敏感性 將各供試菌株 (直徑5 mm) 接種于PDA 平板上，分別置于不同溫度(5、10、15、20、25 和30 ℃) 及黑暗條件下培養(yǎng)72 h，記錄各處理的菌落直徑。每處理重復(fù)3 次。

1.2.4 對pH 值的敏感性 將各供試菌株 (直徑5 mm) 分別接種于pH 值為4、5、6、7、8、9、10 和11 的PDA 平板上，置于24 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)72 h，記錄各處理的菌落直徑。每處理重復(fù)3 次。

1.2.5 對葡萄糖的敏感性 將各供試菌株 (直徑5 mm) 分別接至分別含0、10、20、40、80、160、240 和320 g/L 葡萄糖的PA 培養(yǎng)基上，置于24 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)72 h，記錄各處理的菌落直徑。每處理重復(fù)3 次。

1.2.6 靶標(biāo)基因的克隆與測序 將敏感菌株和抗性菌株分別接種至鋪有玻璃紙的PDA 平板上，黑暗條件下培養(yǎng)3 d 后，刮下菌絲，利用康為世紀(jì)DNA 提取試劑盒提取基因組。

以抗/感灰葡萄孢菌株的DNA 為模板，利用4 對引物 (表1) 擴增琥珀酸脫氫酶SdhA、SdhB、SdhC和SdhD4 個基因的DNA 序列。采用50 μL PCR 反應(yīng)體系：25 μL 2 × Es Taq Master Mix、2 μL DNA 模板(100 μg/mL)，上、下游引物各1 μL (10 μmol/L)，ddH2O 補足至50 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，52～57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化后克隆至 pEASY-T3 載體，送北京華大基因測序。

表1 PCR 擴增所用引物Table 1 Primers used for PCR reactions

2 結(jié)果與分析

2.1 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株抗性遺傳穩(wěn)定性

將灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株在無藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 代，除中抗菌株WP3 外，其他6 個抗性菌株對氟唑菌酰羥胺的抗性倍數(shù)均有不同程度的降低，其中室內(nèi)藥劑馴化獲得的高抗菌株BLH5F 的敏感性變異指數(shù)僅為0.23，說明該高抗菌株對氟唑菌酰羥胺的抗性穩(wěn)定性較差；而從田間檢測獲得的低抗菌株 (WP8 和WP9)、中抗菌株 (WP6) 和高抗菌株 (WPE8 和WPE9) 的敏感性變異指數(shù)在0.60～0.97 之間 (表2)，表明這些田間獲得的抗性菌株對氟唑菌酰羥胺的抗性相對穩(wěn)定。

表2 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株抗性遺傳穩(wěn)定性Table 2 Genetic stability of the resistance of Botrytis cinerea isolates with different sensitivity types to pydiflumetofen

2.2 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株的菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及致病性

結(jié)果 (表3) 顯示，除低抗菌株WP8 的菌絲生長速率顯著低于兩敏感菌株及中抗菌株WP6 和高抗菌株WPE9 的產(chǎn)孢量顯著低于兩敏感菌株外，其他各抗性菌株在菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和致病性方面與敏感菌株并無顯著性差異。

表3 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及致病性Table 3 Mycelial growth, conidial production, conidium germination rate, and pathogenicity of B. cinerea isolates with different sensitivities to pydiflumentofen

2.3 對溫度的敏感性

圖1 溫度對氟唑菌酰羥胺不同敏感型灰葡萄孢菌株菌絲生長的影響Fig. 1 The effect of temperature on mycelial growth of B. cinerea isolates with different sensitivity types to pydiflumentofen

2.4 對pH 值的敏感性

由圖2 可以看出：各抗性菌株和敏感菌株在pH 4～11 的PDA 培養(yǎng)基上均能生長。當(dāng)pH 值為5～6 時，各菌株生長速率最快，當(dāng)pH 值大于7 時，隨著pH 值的升高，各菌株的生長速率逐漸降低。在相同的pH 值下，抗性菌株與敏感菌株的菌落直徑存在顯著差異。pH 值為5 時，高抗菌株BLH5F的菌落直徑顯著大于兩敏感菌株，而低抗菌株WP9和中抗菌株 (WP3 和WP6) 的菌落直徑顯著小于兩敏感菌株；pH 值為11 時，高抗菌株WPE8 和BLH5F 的菌落直徑顯著大于兩敏感菌株，而低抗菌株WP8 和WP9 的菌落直徑顯著小于兩敏感菌株。

圖2 pH 值對氟唑菌酰羥胺不同敏感型灰葡萄孢菌株菌絲生長的影響Fig. 2 The effect of pH values on mycelial growth of B. cinerea isolates with different sensitivity types to pydiflumentofen

2.5 對葡萄糖的敏感性

結(jié)果 (圖3) 顯示：隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，各抗性菌株和敏感菌株的菌絲生長速率逐漸加快，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L 時，各菌株的生長速率達到最大，而當(dāng)質(zhì)量濃度超過80 g/L 后，各菌株的生長速率隨葡萄糖質(zhì)量濃度的升高而降低。在葡萄糖質(zhì)量濃度相同時，抗性菌株與敏感菌株的菌落直徑存在顯著差異。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L時，低抗菌株WP9 和中抗菌株 (WP3 和WP6) 的菌落直徑與兩敏感菌株無顯著差異，而高抗菌株BLH5F 和WPE9 的菌落直徑顯著小于兩敏感菌株；當(dāng)濃度為320 g/L 時，高抗菌株WPE8 的菌落直徑顯著大于敏感菌株BLH5，而顯著小于敏感菌株WP7。

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度對氟唑菌酰羥胺不同敏感型灰葡萄孢菌株菌絲生長的影響Fig. 3 The effect of different concentrations of glucose on mycelial growth of B. cinerea isolates with different sensitivity types to pydiflumentofen

2.6 靶標(biāo)基因序列的比對分析

分別對氟唑菌酰羥胺不同敏感型灰葡萄孢菌株的靶標(biāo)基因 (SdhA、SdhB、SdhC和SdhD) 進行克隆與測序分析，結(jié)果顯示 (圖4 和表4)，對氟唑菌酰羥胺不同抗性水平的菌株僅在SdhB基因上發(fā)生了點突變，而在SdhA、SdhC和SdhD等3 個基因上未檢測到點突變。在SdhB基因上，只有室內(nèi)藥劑馴化獲得的高抗菌株BLH5F 編碼272 位氨基酸的堿基發(fā)生了點突變 (由CAC 變?yōu)镃GC)，氨基酸由組氨酸 (His) 變?yōu)榱司彼?(Arg) (H272R)；而其他田間獲得的低抗、中抗和高抗6 個抗性菌株均在編碼225 位氨基酸的堿基發(fā)生了點突變(由CCC 變?yōu)镃TC)，氨基酸由脯氨酸(Pro)變?yōu)榱肆涟彼?(Leu) (P225L)。

圖4 SdhB 基因氨基酸序列的多重對比Fig. 4 Multiple alignments of deduced amino acid sequences of SdhB genes

表4 灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株中SdhA, SdhB, SdhC 和SdhD 基因點突變類型Table 4 Point mutation types of SdhA, SdhB, SdhC, and SdhD genes detected in B. cinerea isolates with different sensitivity types to pydiflumentofen

3 結(jié)論與討論

氟唑菌酰羥胺是由先正達公司開發(fā)的新型琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑，對灰霉病具有良好的防治效果。雖然氟唑菌酰羥胺尚未廣泛用于灰霉病的防治，但在田間已經(jīng)檢測到了該藥劑的抗性菌株[18]。研究灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株的生物學(xué)特性，對推斷田間抗性菌株的形成及發(fā)展，制定有效的抗藥性治理策略具有重要意義。

琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑包括啶酰菌胺、吡噻菌胺、吡唑萘菌胺、氟唑菌酰胺和氟吡菌酰胺等品種，是目前防治灰霉病的主要藥劑。研究表明，灰霉病菌對該類藥劑的抗性主要是由琥珀酸脫氫酶基因發(fā)生點突變引起的[19-23]。在SdhB基因上共檢測到7 種突變類型：分別為225位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼帷⑻K氨酸、亮氨酸(P225F/T/L)、230 位天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?N230I)、272 位組氨酸突變?yōu)槔野彼帷⒕彼?、亮氨?(H272Y/R/L)；在SdhD基因上檢測到132 位組氨酸突變?yōu)榫彼?(H132R)；在SdhC基因上檢測到了G85A、I93V、M158V 和V168I 共4 種突變，但這些點突變與灰霉病菌對啶酰菌胺的抗性無關(guān)[24]。本研究在氟唑菌酰羥胺抗性菌株SdhA、SdhC和SdhD3 個基因上均未檢測到點突變，僅在SdhB基因上檢測到了H272R 和P225L兩種突變。有學(xué)者在抗氟唑菌酰羥胺的灰葡萄孢菌株的SdhB基因上檢測到了P225F、N230I 和H272Y/R 4 種突變類型，其中產(chǎn)生P225F 和H272Y突變類型的菌株對氟唑菌酰羥胺具有低到中等水平抗性，而產(chǎn)生H272R 和N230I 突變類型的菌株對氟唑菌酰羥胺具有低水平抗性[18]，本研究中，具有H272R 突變的灰葡萄孢菌株對氟唑菌酰羥胺具有高水平抗性，產(chǎn)生P225L 突變類型的菌株對氟唑菌酰羥胺也表現(xiàn)出不同的抗性水平。因此，推測灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺的抗性機制除靶標(biāo)基因產(chǎn)生點突變以外還存在其他抗性機制。

有研究表明，灰葡萄孢對琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑啶酰菌胺[12]和氟吡菌酰胺[17]的抗性可以穩(wěn)定遺傳，西瓜蔓枯病菌對氟唑菌酰羥胺的抗性也可穩(wěn)定遺傳[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，從田間獲得的6 個氟唑菌酰羥胺抗性菌株經(jīng)無藥培養(yǎng)10 代后，對氟唑菌酰羥胺的抗性相對穩(wěn)定，而從室內(nèi)馴化獲得的抗性突變體對氟唑菌酰羥胺的抗性穩(wěn)定性較差。然而，灰葡萄孢具有遺傳變異大的特點，抗性菌株在經(jīng)過數(shù)十代甚至上百代以后，能否變?yōu)槊舾芯赀€有待于進一步研究。

本研究從菌絲生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、致病性、溫度敏感性和pH 值敏感性等方面綜合分析了灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株的生物學(xué)特性。結(jié)果顯示，大部分的抗藥性菌株在菌絲生長速率和產(chǎn)孢量方面與敏感菌株無顯著差異；7 個供試抗性菌株在分生孢子萌發(fā)和致病性方面與敏感菌株均無顯著差異；在對溫度、pH 值和葡萄糖濃度的敏感性方面，9 個灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺不同敏感型菌株之間存在差異，但在特定的溫度、pH 值或葡萄糖濃度下，有時部分抗性菌株的菌落直徑顯著大于敏感菌株，有時顯著小于敏感性菌株，說明抗氟唑菌酰羥胺的灰葡萄孢菌株在不同環(huán)境條件下的生存能力和抗逆性與敏感菌株相當(dāng)。本研究結(jié)果表明，抗氟唑菌酰羥胺的灰葡萄孢菌株與敏感菌株具有相似的適合度。因此，在藥劑的選擇壓下，田間較容易形成抗氟唑菌酰羥胺的灰葡萄孢優(yōu)勢種群。然而，本研究僅通過室內(nèi)試驗測定了抗氟唑菌酰羥胺的灰葡萄孢菌株的適合度及對溫度、pH 值和葡萄糖的敏感性，尚需對灰葡萄孢進行長期田間抗性檢測，以掌握抗性菌株的發(fā)展動態(tài)。

有研究發(fā)現(xiàn)，氟唑菌酰羥胺與琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑啶酰菌胺和氟吡菌酰胺之間存在交互抗性[11,18-19]。早在2016 年，本研究團隊已在河北省設(shè)施番茄主產(chǎn)區(qū)檢測到了灰葡萄孢對啶酰菌胺的抗性菌株，抗性頻率最高可達50.8%[1]，也有報道稱在山東省和河南省也檢測到抗啶酰菌胺的灰葡萄孢菌株[24,26]。綜合以上結(jié)果可以推測，灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺具有中到高水平的抗性風(fēng)險。為延緩灰葡萄孢對氟唑菌酰羥胺抗性的產(chǎn)生和發(fā)展，該藥劑在施用過程中，應(yīng)嚴格控制每個生長季節(jié)的使用次數(shù)，建議與啶菌噁唑、咯菌腈等不同作用機制的殺菌劑交替或復(fù)配施用，避免與啶酰菌胺、氟吡菌酰胺等相同作用機制的殺菌劑桶混或連續(xù)施用。