唐文浩 張養(yǎng)東 鄭 楠 王加啟

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點實驗室(北京)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室(北京)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(北京)，北京 100193)

隨著畜牧業(yè)生產(chǎn)集約化水平和養(yǎng)殖水平的不斷提高，人們對優(yōu)質(zhì)牧草的需求日益增加。富含蛋白質(zhì)、常量和微量礦物質(zhì)元素的苜蓿被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)[1]。苜蓿的粗蛋白質(zhì)含量較高，是在相同生長環(huán)境條件下的禾本科牧草粗蛋白質(zhì)含量的2.5倍，礦物質(zhì)含量是相同生長環(huán)境條件下的禾本科牧草的6倍；苜蓿的干物質(zhì)含量約18.5%，并且氨基酸組成平衡，葉酸含量達4.36 mg/kg、β-胡蘿卜素含量達94.60 mg/kg，且消化率可達70%～80%，是世界公認的牧草之王[2-3]。將苜蓿進行青貯處理制作成苜蓿青貯供動物飼用不僅能有效地保存其營養(yǎng)物質(zhì)并延長其保存時間，還可以提高其適口性和消化率[4]。苜蓿青貯是奶牛飼養(yǎng)中必不可少的優(yōu)質(zhì)粗飼料，因此科學地評價苜蓿青貯的飼料品質(zhì)，找到適合飼喂奶牛的苜蓿青貯飼料對奶牛的健康生長具有非常重要的意義。

1 苜蓿青貯品質(zhì)的評價方法

根據(jù)青貯飼料品質(zhì)評定通用方法，苜蓿青貯品質(zhì)評價方式大體上可以分為物理學評價、化學評價和生物學評價3種方法[5]，每種評價方法都有其特點和優(yōu)勢，但僅僅從單一的某一方面來評價苜蓿青貯的品質(zhì)是不科學的，需要通過綜合評價所得出的結(jié)論才更準確，也更具有說服力。

1.1 物理學評價方法

苜蓿青貯的物理學評價主要是對苜蓿青貯進行感官鑒定，在苜蓿青貯的品質(zhì)評價中，具有簡便易行的特點，是評價苜蓿青貯最常用的一種評價方式[6]。感官觀察法是依靠評價人的視覺、嗅覺和觸覺對苜蓿的顏色、氣味、水分含量、雜草比例和刈割時期等性狀進行綜合評價[7]。品質(zhì)較好的苜蓿青貯顏色與青貯前苜蓿原色相近呈現(xiàn)青綠色或者黃綠色；品質(zhì)中等的苜蓿青貯顏色呈現(xiàn)暗褐色；顏色呈現(xiàn)黑色或者褐色的苜蓿青貯與青貯前苜蓿原料差異較大，品質(zhì)較差，不適宜進行飼喂。對苜蓿青貯的氣味進行辨別評價，良好的苜蓿青貯氣味較柔，具有酸香味；品質(zhì)中等的苜蓿青貯酸香味道不明顯并出現(xiàn)酒精味；較差品質(zhì)的苜蓿青貯氣味難聞刺鼻，多呈腐敗味，該類型苜蓿青貯多已腐敗變質(zhì)，不能飼喂動物。制作良好的苜蓿青貯，拿在手中質(zhì)地柔軟，葉片莖花皆保持青貯前的狀態(tài)，能清晰地看出莖葉的葉脈，葉片結(jié)構(gòu)保持良好；質(zhì)量較差的苜蓿青貯，用手握緊多呈現(xiàn)凝集成團或過分松散干燥，凝集狀態(tài)越明顯表示其腐敗的可能性越大，造成這種現(xiàn)象的原因多是因水分過多或過少造成，這種苜蓿青貯不能進行利用。

在國際上，德國農(nóng)業(yè)協(xié)會對青貯的氣味、結(jié)構(gòu)和色澤3項指標進行評分，制定的DLG評分法[8]，將青貯分為優(yōu)良、尚好、中等和腐敗4個級別(表1)。

表1 德國農(nóng)業(yè)協(xié)會青貯飼料感官評定標準

目前我國還未對苜蓿青貯的感官評價制定統(tǒng)一的標準，現(xiàn)行多為地方標準，各地執(zhí)行標準不同，如需對苜蓿青貯進行進一步的評價，還應(yīng)針對苜蓿青貯進行化學性評價。

1.2 化學評價方法

苜蓿青貯的化學評價是指運用化學分析方法對苜蓿青貯進行分析，通過其所含營養(yǎng)物質(zhì)含量的不同，對苜蓿青貯品質(zhì)進行評價。

1.2.1 概略養(yǎng)分分析法

目前國內(nèi)外對飼料的化學成分分析方法，主要都是對苜蓿青貯飼料進行概略養(yǎng)分分析，測定出六大概略養(yǎng)分(水分、粗蛋白質(zhì)、粗纖維、粗脂肪、粗灰分和無氮浸出物)，在根據(jù)其含量，對苜蓿青貯品質(zhì)進行分級。用概略養(yǎng)分分析法對苜蓿青貯的評價過于單一，后來Van Soest對粗纖維的測定進行了改進，提出了中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的概念[9]，這克服了傳統(tǒng)方法測得的粗纖維含量低于實際含量的弊端，進一步提升了概略養(yǎng)分分析法對苜蓿青貯品質(zhì)評定的準確性。但對于復(fù)雜的反芻動物，只通過評判苜蓿青貯的常規(guī)營養(yǎng)成分來對其進行評價是不夠全面的，因此只考慮苜蓿青貯的概略養(yǎng)分來評價苜蓿青貯是不準確的。

我國苜蓿青貯品質(zhì)主要依靠2018年頒布的內(nèi)蒙古地方標準——《苜蓿青貯飼料質(zhì)量分級》(DB15/T 1455—2018，表2)和2019年頒布的河南省地方標準——《苜蓿青貯料質(zhì)量分級》(DB41/T 1906—2019，表3)來評價。

1.2.2 康奈爾凈碳水化合物-凈蛋白質(zhì)體系(CNCPS)分析法

20世紀90年代，美國康奈爾大學提出一種基于反芻動物瘤胃降解特征的動態(tài)評價體系，稱CNCPS，現(xiàn)廣泛用于對飼料品質(zhì)的評價，在美國和加拿大應(yīng)用較多[10]。CNCPS分析法將飼料的化學成分與反芻動物的消化相結(jié)合，并對飼料的成分進行更詳細的分類，精確地反映出反芻動物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的利用。該方法對評定苜蓿青貯的品質(zhì)有著指導(dǎo)作用，為合理利用苜蓿青貯提供了依據(jù)。

1.2.3 近紅外反射光譜(NIRS)分析法

NIRS技術(shù)最早用于谷物的干物質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量的測定，由美國農(nóng)業(yè)部的Norris開發(fā)[11]。隨著NIRS技術(shù)的成熟與發(fā)展，我國在20世紀80年代也對NIRS技術(shù)有了初步研究，并在我國農(nóng)業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[12]。NIRS的原理是根據(jù)每種飼料的成分及含量差異對近紅外光線的吸收波長不同，從而預(yù)測飼料中有機成分的含量，對飼料營養(yǎng)價值進行評價[13-14]。NIRS技術(shù)有著快速、精準和簡便等優(yōu)點，可以實現(xiàn)飼料營養(yǎng)指標檢測快速化[15]。目前，NIRS技術(shù)在青貯飼料的品質(zhì)評價上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，并且建立了苜蓿青貯飼料的纖維消化數(shù)學模型。Nousiainen等[16]運用NIRS技術(shù)，對青貯飼料中難消化中性洗滌纖維(INDF)和可消化中性洗滌纖維(DNDF)含量進行預(yù)測，將青貯飼料的品質(zhì)進行分級。S?rensen[17]還通過NIRS技術(shù)預(yù)測青貯飼料中乳酸、乙酸和氨態(tài)氮含量以及pH。NIRS技術(shù)有很大的前景，但在測定青貯飼料實際操作過程中，還需要建立可靠的樣本模型庫，并建立穩(wěn)定準確的校正模型。

表2 苜蓿青貯飼料質(zhì)量分級

表3 苜蓿青貯料質(zhì)量分級

1.2.4 乙酸丁酸含量評價法

Kaiser等[18]認為，青貯過程中產(chǎn)生的乙酸含量的高低，表示青貯飼料有氧穩(wěn)定性的好壞以及青貯飼料的保存情況；丁酸的含量代表青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，將兩者綜合評分，提出用乙酸和丁酸作為指標對青貯飼料進行評價。該方法適用于包含苜蓿青貯在內(nèi)的所有青貯飼料的品質(zhì)評定(表4)，我國曾經(jīng)制定的青貯飼料質(zhì)量評定標準(試行)也將乙酸和丁酸含量作為評價指標[19]。

表4 乙酸丁酸含量評價法

1.2.5 安全性指標評價

對于青貯飼料的安全性評價，主要是對青貯飼料原料本身和在青貯過程中產(chǎn)生的有害毒素進行評價。目前我國的飼料衛(wèi)生評價標準(GB 13078—2017)僅僅對部分飼料原料和飼料產(chǎn)品中的有害毒素進行規(guī)定，并沒有對苜蓿青貯類飼料中的有害毒素進行限制規(guī)定。

苜蓿在青貯過程中可能產(chǎn)生影響其安全使用的霉菌毒素，種類主要有黃曲霉毒素、毛霉烯、赭曲霉毒素A、伏馬菌素和玉米赤霉烯酮[20]。Ogunade等[21]研究發(fā)現(xiàn)，若制作青貯過程緩慢，裝填壓實不充分，密封不良等多種原因，出現(xiàn)非厭氧條件，會創(chuàng)造有利于霉菌和霉菌毒素產(chǎn)生的微環(huán)境。當反芻動物與霉菌毒素長期接觸時，會對接觸動物的健康產(chǎn)生嚴重的影響，如食欲不振、共濟失調(diào)和免疫抑制等，還會降低其生產(chǎn)性能，造成經(jīng)濟損失。霉菌毒素也會影響動物副產(chǎn)品，受污染的畜產(chǎn)品被人食用后也會對人造成危害。我國為保證食品安全對于乳及乳制品中的黃曲霉毒素限定小于0.5 μg/kg[《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)]。

苜蓿青貯是反芻動物飼糧的一種重要組成成分，其安全性關(guān)系著反芻動物的健康、畜產(chǎn)品的安全以及人類的健康，所以我們亟需對苜蓿青貯的安全指標評價作出限定。

1.3 生物學評價方法

苜蓿青貯的營養(yǎng)價值評定除了上述的物理學評價和化學評價外，還需對其的消化利用效果進行評價。苜蓿青貯消化效率的高低可以直接反映動物對其養(yǎng)分的吸收利用，從而對苜蓿青貯自身的營養(yǎng)價值進行評價，因此苜蓿青貯的消化率評價對苜蓿青貯的品質(zhì)評定有十分重要的指導(dǎo)意義。常用的苜蓿青貯消化率的評價方法有體內(nèi)飼養(yǎng)試驗法、半體內(nèi)尼龍袋法和體外法3種。

1.3.1 飼養(yǎng)試驗法

飼養(yǎng)試驗是在動物營養(yǎng)研究中評價飼料最常用、最直觀的評價方法，是指在相同條件下因某一不同因素影響，產(chǎn)生不相同的結(jié)果，即不同結(jié)果的產(chǎn)生是由于某一因素的變化所引起的。通過對比不同組間在生產(chǎn)性能方面的差異，進而評定苜蓿青貯飼料的營養(yǎng)價值及對其他飼料的相對價值。常用的動物飼養(yǎng)消化試驗有全收糞法，即通過比較苜蓿青貯中營養(yǎng)物質(zhì)的攝入量與排出量的差值，來評價苜蓿青貯在動物體內(nèi)的吸收轉(zhuǎn)化效率。該試驗需要準確測得試驗動物食入的營養(yǎng)物質(zhì)量，還需要準確采集試驗動物排出的糞便，并測得糞便中的剩余營養(yǎng)物質(zhì)量，根據(jù)公式苜蓿青貯養(yǎng)分表觀消化率=100×[(食入苜蓿青貯中養(yǎng)分含量-糞中養(yǎng)分含量)/食入苜蓿青貯中養(yǎng)分含量]，計算苜蓿青貯的表觀消化率。

1.3.2 半體內(nèi)尼龍袋法

半體內(nèi)尼龍袋法是一種借助活體瘺管動物，將苜蓿青貯飼料裝入特定的尼龍袋中，放入瘺管動物瘤胃內(nèi)消化，定時從瘤胃內(nèi)取出，清洗烘干后，對尼龍袋中樣品進行化學分析，最后計算出苜蓿青貯的營養(yǎng)成分消化率[22]。20世紀30年代，Quin等[23]在測定飼料消化情況時，把飼料裝入天然絲袋中，放入羊的瘤胃中，進行試驗。后經(jīng)過?rskov等[24-25]的不斷摸索和改良，最終逐漸推廣應(yīng)用，成為反芻動物評價飼料營養(yǎng)價值的常用方法之一[26]。半體內(nèi)尼龍袋法的優(yōu)點是將苜蓿青貯的營養(yǎng)價值評定與反芻動物瘤胃內(nèi)的微生物進行動態(tài)結(jié)合，能夠反映飼料在動物瘤胃內(nèi)的消化情況，更真實可靠，更接近飼養(yǎng)試驗法。但尼龍袋法受試驗動物、試驗飼糧和技術(shù)操作等不確定因素的影響，造成其結(jié)果的差異性較大,應(yīng)盡早完善制定統(tǒng)一的標準[27]。

1.3.3 體外法

對于評價苜蓿青貯品質(zhì)的體外研究方法主要可分為批次培養(yǎng)法和連續(xù)培養(yǎng)法。

批次培養(yǎng)法是將飼料樣品與瘤胃液相結(jié)合，在體外模擬瘤胃消化飼料過程，最后對底物進行分析或收集產(chǎn)氣量，主要包括兩步法和產(chǎn)氣法[28-29]。兩步法模擬反芻動物消化方式，首先將苜蓿青貯與采集的新鮮瘤胃液進行混合進行體外消化，然后再向其加入胃蛋白酶和鹽酸對飼料樣品進一步消化，最后對飼料殘渣進行分析，測定體外消化后苜蓿青貯中營養(yǎng)成分含量和消化率評定其品質(zhì)[30]。Murphy等[31]研究發(fā)現(xiàn)，用兩步法與尼龍袋法測得結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.81。兩步法更全面地模擬了動物消化飼料的過程，包含動物的瘤胃消化、真胃與部分小腸的消化，對苜蓿青貯消化率的預(yù)測準確性更高，應(yīng)用更廣，但兩步法不能反映苜蓿青貯在反芻動物中的動態(tài)降解信息，還存在一些弊端。

體外產(chǎn)氣法是由Menke等[32]建立的一種通過測定飼料樣品在體外與瘤胃液混合消化后所產(chǎn)生的氣體的多少及計算產(chǎn)生氣體(二氧化碳和甲烷)的比例，來評估飼料品質(zhì)的快速方法。另有大量研究表明，體外產(chǎn)氣法不僅用于飼料的營養(yǎng)價值評定，還可利用此法評價飼草間的組合效應(yīng)[33]，預(yù)測動物采食量和甲烷排放量[34]。體外產(chǎn)氣法根據(jù)測定產(chǎn)氣方式的不同，分為注射器式產(chǎn)氣記錄方法和壓力傳感器轉(zhuǎn)換產(chǎn)氣量測定方法[35]。德國霍恩海姆(Hohenheim)大學的研究人員將飼料樣品與瘤胃液裝入100 mL的注射器中進行發(fā)酵，通過測量注射器活塞被推動的情況，記錄產(chǎn)氣量，取得了良好效果；后經(jīng)過不斷的發(fā)展進步，并隨著計算機程序的融合，產(chǎn)氣法逐漸由手動記錄到半自動記錄再到全自動記錄的發(fā)展[36-38]。我國應(yīng)用產(chǎn)氣法也進行了大量的試驗研究，自1990年以來，取得了巨大的發(fā)展，由中國農(nóng)業(yè)大學楊紅建教授自主研發(fā)的AGRS-Ⅲ型體外發(fā)酵自動記錄裝置(國家發(fā)明專利授權(quán)號：ZL200610011301.X)對我國應(yīng)用產(chǎn)氣法評價苜蓿青貯品質(zhì)提供了良好的試驗條件[39]。

體外產(chǎn)氣法操作簡單，重復(fù)性好，也能較真實地模擬瘤胃環(huán)境，但此方法和兩步法都屬于靜態(tài)發(fā)酵，試驗過程中底物與產(chǎn)物不能分離，可能會引起試驗條件下微生物環(huán)境的改變，造成產(chǎn)物抑制，而且此方法也不能反映瘤胃的動態(tài)降解信息，造成對苜蓿青貯的品質(zhì)評價不準確[40]。有研究發(fā)現(xiàn)，在用體外法評價青貯飼料時，對青貯飼料進行烘干前處理會造成發(fā)酵產(chǎn)物的損失，低估青貯的營養(yǎng)品質(zhì)[41]。此外，飼料的碳水化合物與體外產(chǎn)氣關(guān)系密切，但與飼料粗蛋白質(zhì)含量關(guān)系小，故在評價蛋白質(zhì)含量高的青貯時，不能只注重產(chǎn)氣量來評價青貯品質(zhì)，還需要結(jié)合揮發(fā)性脂肪酸等指標綜合判定，才能更準確地評價青貯品質(zhì)。

連續(xù)培養(yǎng)法是一種將飼料樣品連續(xù)的與瘤胃液、人工唾液相混合，使其保持一種持續(xù)發(fā)酵狀態(tài)，在體外模擬瘤胃環(huán)境的裝置。我國對于連續(xù)培養(yǎng)法的研究探索最早是20世紀80年代，施學仕[42]設(shè)計的一種半自動人工瘤胃系統(tǒng)，用來進行體外試驗的初步探索，在此方法出現(xiàn)之前國內(nèi)的研究多是使用批次培養(yǎng)法[43]。1995年，連續(xù)培養(yǎng)法進一步發(fā)展，由王加啟等[44]設(shè)計了一種可同時進行6組試驗的連續(xù)培養(yǎng)人工模擬瘤胃裝置(RSI系統(tǒng))。1999年，孟慶翔[45]總結(jié)前人經(jīng)驗，設(shè)計了DFCCS-Ⅱ型雙外流連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)將發(fā)酵罐增加到了12個，提高了試驗結(jié)果的準確性。2012年，沈維軍等[46]在前人的基礎(chǔ)上設(shè)計了雙外流連續(xù)培養(yǎng)裝置，該裝置克服了連續(xù)培養(yǎng)法在發(fā)酵罐的溫度控制和產(chǎn)物外流過程容易堵塞等問題，能準確地模擬瘤胃內(nèi)環(huán)境，穩(wěn)定性更好[47]。但各個實驗室在連續(xù)培養(yǎng)法操作過程中的運行參數(shù)不一，設(shè)計也存在較大差異，這限制了連續(xù)培養(yǎng)法在苜蓿青貯評價上的推廣應(yīng)用。在實際應(yīng)用中，應(yīng)統(tǒng)一優(yōu)化人工瘤胃模擬技術(shù)，使其能更好地運用在苜蓿青貯的營養(yǎng)價值評價上。

2 苜蓿青貯品質(zhì)評定綜合指標

苜蓿青貯品質(zhì)評定綜合指標，已經(jīng)成為確定苜蓿青貯品質(zhì)的另一大關(guān)鍵因素。我國尚未有只針對于苜蓿青貯品質(zhì)評定的綜合評判指標，目前多應(yīng)用粗飼料的綜合評定指標粗飼料相對質(zhì)量(relative feed quality，RFQ)[48]和粗飼料分級指數(shù)(grading index，GI)[49]來評價苜蓿青貯品質(zhì)。

RFQ指標是根據(jù)飼料相對價值(relative feed value，RFV)[50]的基礎(chǔ)上建立的通過可消化營養(yǎng)物質(zhì)預(yù)測粗飼料的可利用能來對牧草品質(zhì)進行劃分，其計算公式為：

RFQ=DMI(% BW)×TDN(% DM)/1.23。

式中：DMI為干物質(zhì)隨意采食量(% BW)；TDN為總可消化營養(yǎng)物質(zhì)含量(% DM)；除數(shù)1.23是根據(jù)Moore等[51]測得的29種牧草的數(shù)據(jù)得出，將RFV除數(shù)1.29乘以0.95得到RFQ除數(shù)1.23。

GI是根據(jù)我國粗飼料現(xiàn)狀由紅敏等[52]提出的一個全新的品質(zhì)評價綜合指數(shù)，其計算公式為：

GI(MJ/d)=NEL×DMI×DCP/(1-pef)×NDF。

式中：NEL為產(chǎn)奶凈能；DMI為干物質(zhì)隨意采食量(kg/d)；DCP為可消化粗蛋白質(zhì)含量(% DM)；pef為物理有效因子；NDF為中性洗滌纖維含量(% DM)。

GI法的優(yōu)點是在評價飼料時綜合考慮能量和可消化粗蛋白質(zhì)，并考慮物理有效中性洗滌纖維含量，使其評定更合理準確，更符合實際情況。

3 小結(jié)與展望

隨著我國畜牧業(yè)對苜蓿青貯的使用越來越廣泛，對苜蓿青貯品質(zhì)評定的準確與否成為其合理利用的關(guān)鍵性限制因素。運用單一指標難以準確真實的對苜蓿青貯進行品質(zhì)評定，不但應(yīng)將苜蓿青貯的營養(yǎng)成分、消化率和發(fā)酵指標等綜合考慮，還應(yīng)該考慮苜蓿青貯飼喂動物后對動物健康的影響。動物的健康是苜蓿青貯品質(zhì)評價的基礎(chǔ)，因此建立起一套適合我國的苜蓿青貯品質(zhì)綜合評定標準，對我國草業(yè)和畜牧業(yè)的高速高質(zhì)發(fā)展至關(guān)重要。