◎ 白亞敏，陳世奇，唐韻熙，江 生，蘭玉坤

（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶 401121；2.國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（調(diào)味品監(jiān)管技術(shù)），重慶 401121）

氨基脲是呋喃西林在動(dòng)物體內(nèi)的代謝物，同時(shí)也是甲殼類水產(chǎn)品中的內(nèi)源性物質(zhì)及發(fā)泡劑偶氮二甲酰胺的高溫分解產(chǎn)物[1-4]。大量研究結(jié)果表明，氨基脲對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有多效性影響和改變，具有致畸性、致突變性和致癌性。氨基脲可通過食物鏈進(jìn)入人體，影響人體健康，造成嚴(yán)重后果。因此，歐盟、美國、加拿大和日本等國家和組織均將呋喃西林列為動(dòng)物食品中的禁用藥物[5]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用獸藥及其他化合物清單》也規(guī)定動(dòng)物性食品中不得檢出呋喃西林[6]。

毛肚、鴨腸、黃喉等水發(fā)食品在我國西南地區(qū)深受消費(fèi)者喜愛，是火鍋食品中消費(fèi)量較大的幾個(gè)品種，但其中檢出氨基脲的事件時(shí)有發(fā)生。部分養(yǎng)殖戶反映，動(dòng)物食品養(yǎng)殖過程中并未使用呋喃西林藥物，氨基脲還可能來源于水發(fā)產(chǎn)品的加工過程[7-8]。次氯酸鹽廣泛用于水發(fā)產(chǎn)品衛(wèi)生處理和消毒，使用含次氯酸鹽的消毒液處理毛肚等水發(fā)產(chǎn)品后，富含蛋白質(zhì)的水發(fā)產(chǎn)品會(huì)分解出游離的氨基酸，部分氨基酸自身能分解產(chǎn)生氨基脲；氨基酸經(jīng)次氯酸鹽處理后易水解成脲基并游離出氨，氨與次氯酸鹽可生成氯胺，氯胺與尿素反應(yīng)生成氨基脲；氯胺與氨還能作用生成聯(lián)氨，同時(shí)帶酰胺基團(tuán)物質(zhì)與次氯酸鹽作用能生成異氰酸鹽，聯(lián)胺與異氰酸鹽反應(yīng)也能產(chǎn)生氨基脲[9]。

近年來，氨基脲的檢測方法多運(yùn)用于動(dòng)物食品，對生產(chǎn)加工中導(dǎo)致的污染關(guān)注較少，本文通過建立水發(fā)產(chǎn)品中氨基脲的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，為監(jiān)控并掌握水發(fā)產(chǎn)品養(yǎng)殖及加工過程中氨基脲污染情況，保障食品質(zhì)量安全提供了分析方法和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

1290超高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AB5500三重四極桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；ML-886漩渦混合器（海門市其林貝爾公司）；TD16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)（長沙湘儀公司）；Millipore超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 材料與試劑

毛肚、鴨腸及黃喉樣品購于重慶超市及農(nóng)貿(mào)市場；氨基脲標(biāo)準(zhǔn)品（德國Dr. Ehrenstorfer公司，純度：99.80%，批號(hào)：G151417）；氨基脲-13C-15N2標(biāo)準(zhǔn)品（WITEGA公司，純度：99.9%，批號(hào)：31223603）；水為經(jīng)處理過的超純水；鄰硝基苯甲醛（日本TGI公司，含量：＞99%）；二甲基亞砜（Sigma公司，純 度：≥99.5%）；乙腈、甲酸為色譜純；乙酸銨、乙酸乙酯、正己烷和磷酸氫二鉀均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity BEH C18（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）；流 動(dòng) 相：A 乙 腈（含0.1%甲 酸）， B 10 mmol·L-1乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～0.6 min，15%A，0.6～3.0 min，15%→85%A，3.0～4.5 min，85%A，4.5～4.6 min， 85%→15%A，4.6～6.1 min，15%A；流速：0.3 mL·min-1，柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；噴霧電壓：5 000 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：270 kPa；GAS1：380 kPa，GAS2：380 kPa；質(zhì)譜參數(shù)見表1。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的質(zhì)量色譜圖見圖1、圖2。

表1 氨基脲衍生物和同位素內(nèi)標(biāo)衍生物的質(zhì)譜參數(shù)表

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量色譜圖

圖2 樣品質(zhì)量色譜圖

1.3.3 溶液的制備

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備。精密稱取氨基脲約10 mg，置入100 mL容量瓶，乙腈定容，搖勻，制成100 μg·mL-1的氨基脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取200 μL氨基脲儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，制成 200 ng·mL-1的氨基脲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（2）內(nèi)標(biāo)溶液的制備。精密稱取氨基脲-13C-15N2標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，置入100 mL容量瓶，乙腈定容，搖勻，配制成100 μg·mL-1的氨基脲內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取100 μL氨基脲內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液于100 mL容量瓶中，乙腈定容，搖勻，制成100 ng·mL-1的氨基脲內(nèi)標(biāo)溶液。

（3）供試品溶液的制備。將毛肚、鴨腸及黃喉樣品分別均質(zhì)制樣備用。稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，分別用10 mL水洗滌兩次，加入100 μL氨基脲內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合50 s，再加入1 moL·L-1鹽酸溶液20 mL和0.3 mL鄰硝基苯甲醛衍生溶液，振蕩渦旋1 min，37 ℃條件下置于恒溫水浴中避光振蕩反應(yīng)。16 h后取出樣品，冷卻至室溫，用1.0 moL·L-1磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，再加入5 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋2 min，移取上清液至離心管中，殘留液中再加入5 mL乙酸乙酯，振蕩渦旋后取上清液，合并上清液，40 ℃氮吹近干。準(zhǔn)確加入1.0 mL水和2 mL正己烷，振蕩渦旋溶解殘余物， 6 000 r·min-1離心8 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，待HPLC-MS/MS檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

毛肚等水發(fā)產(chǎn)品中通常含有偏磷酸鹽、焦磷酸鹽等磷酸鹽類保水劑，樣品溶解于水后會(huì)形成一種緩沖鹽體系，影響樣品溶液的pH值調(diào)節(jié)，因此先將樣品用水洗滌兩次以除去其中的部分磷酸鹽，但仍有部分磷酸鹽不能完全去除。動(dòng)物源性樣品通常用0.2 moL·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)樣品溶液的pH值，在酸性環(huán)境中水解蛋白質(zhì)，提取其中呈結(jié)合態(tài)的氨基脲，用0.2 moL·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)水發(fā)產(chǎn)品樣品溶液時(shí)，pH值并無太大變化。因此，將鹽酸溶液的濃度調(diào)整為1 moL·L-1， 可使樣品溶液的pH值調(diào)節(jié)至0～0.5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用1 moL·L-1鹽酸能達(dá)到水解需要的酸性環(huán)境，檢測結(jié)果較好。

2.2 色譜條件及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

氨基脲分子量較小，用鄰硝基苯甲醛與氨基脲進(jìn)行衍生反應(yīng)，將待測物分子量增加至209，可大幅提升檢測靈敏度。氨基脲衍生物為氨基脲縮對醛基苯甲酸，呈弱堿性，適用于正離子監(jiān)測模式。流動(dòng)相采用含0.1%甲酸的乙腈-乙酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫，甲酸和乙酸銨有助于形成待測物分子離子，提高離子化效率，增強(qiáng)質(zhì)譜的靈敏度，同時(shí)還可改善質(zhì)量色譜圖峰形。由于大多數(shù)色譜柱不耐受強(qiáng)酸，流動(dòng)相選擇0.1%甲酸濃度。流動(dòng)相中的離子也會(huì)抑制待測物在離子源內(nèi)形成分子離子，降低氨基脲衍生物的響應(yīng)，因此只采用10 mmoL·L-1乙酸銨濃度。

采用50 ng·mL-1的氨基脲衍生物進(jìn)行母離子掃描，確定質(zhì)荷比209.2的氨基脲衍生物分子離子，再進(jìn)行子離子全掃描，選出響應(yīng)強(qiáng)度最高的兩個(gè)子離子m/z192.1和m/z166.2，其中m/z166.2作為定量離子。最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式對碰撞電壓和去簇電壓進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 檢出限及線性關(guān)系

為減少樣品基質(zhì)對質(zhì)譜靈敏度的影響，選用與樣品相同基質(zhì)的陰性樣品提取液作為溶劑，準(zhǔn)確配制氨基脲衍生物系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稱取不同基質(zhì)陰性樣品6份，每份約2.0 g，分別置于50 mL離心管中，均加入適量1 moL·L-1鹽酸溶液，渦旋30 s后，分別加入氨基脲標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5 μL、10 μL、20 μL、 50 μL、100 μL和200 μL，添加濃度分別為0.5 μg·kg-1、 1.0 μg·kg-1、2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1，再加入氨基脲內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL（即內(nèi)標(biāo)含量為5.0 μg·kg-1），渦旋混合50 s，余下操作同1.3.2。以氨基脲衍生物的定量離子對的峰面積對濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)實(shí)際加標(biāo)確定方法檢出限，結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系、回歸方程和檢出限表

2.3.2 回收率

均質(zhì)后的毛肚、鴨腸、黃喉陰性樣品，分別稱取18份，高、中、低3個(gè)濃度各6份，添加不同濃度的氨基脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法處理樣品并測定，進(jìn)行回收率試驗(yàn)，3種基質(zhì)氨基脲的回收率為73.9%～88.0%，RSD為3.2%～8.6%，見表3。

表3 水發(fā)產(chǎn)品中氨基脲的回收率表

2.4 樣品測定

利用本文建立的方法，對市場上100余批毛肚、鴨腸和黃喉等水發(fā)產(chǎn)品進(jìn)行了測定。其中有13批為陽性樣品，氨基脲檢出含量為2.35～18.41 μg·kg-1。

3 結(jié)論

本文利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了快速、準(zhǔn)確的水發(fā)食品中氨基脲的檢測方法，其準(zhǔn)確度和重復(fù)性均滿足痕量分析的需求。毛肚等水發(fā)食品中的氨基脲殘留不僅是養(yǎng)殖過程中使用了呋喃西林，還與生產(chǎn)加工過程中使用的次氯酸鹽消毒有關(guān)。水發(fā)產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)需加強(qiáng)原料進(jìn)貨查驗(yàn)和生產(chǎn)過程控制，盡量減少氨基脲污染給人體健康帶來的安全隱患。