馮睿，葉冠

(上海醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司中央研究院，上海 201203)

女性在妊娠和分娩前后，子宮將發(fā)生巨大的變化。分娩后，子宮將開始重塑，逐漸恢復(fù)正常的生理周期以及未孕時的大小，該過程則稱為子宮復(fù)舊?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，通過止血、補(bǔ)血、增強(qiáng)子宮收縮力等途徑可以有效促進(jìn)子宮復(fù)舊[1]，但大多數(shù)治療手段只集中于某一方面。近年來，中藥因其多成分、多靶點(diǎn)、多通路、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于各種現(xiàn)代疾病的治療中。抗衰老口服液為一種中藥復(fù)方制劑，源于明代益壽永真膏，由紅參、生地黃、天冬、麥冬、地骨皮、茯苓等單味藥組合而成，具有益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)血安神的作用。作為一款應(yīng)用廣泛的非處方藥品，抗衰老口服液常用于產(chǎn)后虛弱，更年期綜合征，中、老年體弱者因氣陰兩虛所致的神疲乏力、煩躁失眠、心悸氣短等癥。上市銷售四十年來的臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，抗衰老口服液具有改善產(chǎn)婦產(chǎn)后虛弱，促進(jìn)子宮恢復(fù)，預(yù)防產(chǎn)后并發(fā)癥發(fā)生的功效。本研究通過觀察產(chǎn)后小鼠體能變化，出凝血情況，補(bǔ)血情況，離體子宮功能，子宮內(nèi)膜和子宮肌層組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，從自噬和凋亡的角度考察抗衰老口服液對子宮復(fù)舊過程的影響并探討其可能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物 健康未孕雌性ICR小鼠10只，清潔級，體重18～23 g，分娩后第1天的產(chǎn)后ICR小鼠100只，清潔級，體重37～45 g，購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2016-0010，使用許可證：SYXK(蘇)2017-0040。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動物獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)，室溫(23±2)℃，濕度50%±5%，正常晝夜交替，自由飲食。動物實(shí)驗(yàn)遵循動物倫理委員會規(guī)定，倫理審查編號為OGKQSPF/SQ-11。

1.2 藥物 抗衰老口服液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：1909002)，規(guī)格：10 mL/支，人用量20 mL·d-1?？s宮素注射液(安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號：181203)，規(guī)格：5 U·mL-1。

1.3 主要儀器 紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司，型號：UV-5100)；光學(xué)顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司，型號：XD-202)。MD3000-C生物信號采集處理系統(tǒng)、離體組織灌流系統(tǒng)、張力換能器、多道生理記錄儀、相關(guān)數(shù)據(jù)分析軟件(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；垂直電泳裝置(北京市六一儀器廠，型號：DYCZ-24DN)。

1.4 試劑及耗材 苯甲酸雌二醇(上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10042617)；蔗糖、NaCl、KCl、MgSO4、NaH2PO4·2H2O、葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20190326、20190926、20180110、20200220、F20100519、F20100722)；NaHCO3(上海久億化學(xué)試劑有限公司，批號：20100901)；CaCl2(南京化學(xué)試劑有限公司，批號：10041420263)；苯甲酸鈉(食品級，江蘇凱瑞生物科技有限公司)；Hb檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200713)；Bax、caspase-3(cleaved)、MCL1、mTOR、Phospho-mTOR、Phospho-p53、p53、LC3-I、LC3-II、GAPDH一抗、山羊抗兔IgG(南京恩晶生物科技有限公司，貨號分別為E2511550、E11-0104L、E2612226、E2510675、E2530094、E8ET1606-24、E11-10276C、E2613707、E2620270、E20-53445、E0L3012-2)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑制備 臺氏液采用去離子水配制，1 000 mL臺氏液含NaCl 8.0 g、10% KCl 2.0 mL(0.2 g)、10% MgSO4·7H2O 2.6 mL(0.26 g)、5% NaH2PO4·2H2O 1.3 mL(0.065 g)、NaHCO31.0 g、1 mol·L-1CaCl21.8 mL(0.2 g)、葡萄糖 1.0 g。

2.2 分組與給藥 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：將50只產(chǎn)后小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對照組(等量生理鹽水)，輔料對照組(蔗糖390 mg·kg-1；苯甲酸鈉3.25 mg·kg-1)，低劑量組(抗衰老口服液1.3 mL·kg-1，相當(dāng)于1/2臨床等效劑量)，中劑量組(抗衰老口服液2.6 mL·kg-1，相當(dāng)于臨床等效劑量)，高劑量組(抗衰老口服液5.2 mL·kg-1，相當(dāng)于臨床等效劑量的2倍)，每組10只，連續(xù)灌胃給藥14 d。離體子宮實(shí)驗(yàn)：將小鼠分為6組，每組10只，其中正常對照組為健康未孕雌性小鼠，其余5組為產(chǎn)后小鼠。脫頸椎處死后剖取子宮，正常對照組和產(chǎn)后空白組僅給予臺式液，產(chǎn)后低、中、高劑量組分別給予0.125、0.25、0.5 mL口服液/mL臺氏液，催產(chǎn)素組給予0.013 U縮宮素/mL臺氏液。

2.3 體重檢測 用電子天平稱量生理鹽水對照組、輔料對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠給藥前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的體重，記錄數(shù)據(jù)。

2.4 游泳時間檢測 末次給藥1 h后，在生理鹽水對照組、輔料對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠尾根部1 cm處負(fù)荷小鼠10%體重的鉛絲，置于水箱中游泳，箱內(nèi)水深40 cm，水溫(20±3)℃。記錄小鼠從游泳開始至頭部沉入水中8 s不能浮出水面且翻正反射消失的時間為游泳時間，計算各組小鼠與對照組相比的時間延長率。

2.5 出血時間檢測 末次給藥1 h后，用手術(shù)剪將生理鹽水對照組、輔料對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠尾尖5 mm處剪斷，待血液自行流出，開始以秒表計時，每30 s用濾紙吸去血滴1次，直到血液停止流出為止，記錄出血時間。

2.6 凝血時間檢測 末次給藥1 h后，用內(nèi)徑約為1 mm的熔點(diǎn)毛細(xì)管測定生理鹽水對照組、輔料對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠從毛細(xì)管內(nèi)眥采血到管內(nèi)出現(xiàn)血凝絲的凝血時間。

2.7 補(bǔ)血作用檢測 連續(xù)灌胃給藥7 d或14 d，通過眼眶靜脈采血，用試劑盒檢測生理鹽水對照組、輔料對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠灌胃給藥前、給藥7 d和給藥14 d各組的血紅蛋白量、紅細(xì)胞數(shù)。

2.8 離體子宮功能檢測 實(shí)驗(yàn)前1天，正常對照組小鼠肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg·kg-1)以造成動情期，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天同產(chǎn)后空白組、產(chǎn)后低劑量組、產(chǎn)后中劑量組、產(chǎn)后高劑量組以及催產(chǎn)素組小鼠一同脫頸椎處死，剖取子宮置于盛有臺氏液的玻璃皿內(nèi)，取離體子宮中間段約3～4 cm，一端固定于盛有15 mL臺氏液的浴槽通氣鉤，一端連接張力換能器，浴槽中溫度維持在(37.0±0.5)℃，同時通氣，給予一定的前負(fù)荷力。在浴槽中加入不同劑量的抗衰老口服液及縮宮素，采用MD3000-C生物信號采集處理系統(tǒng)采集相關(guān)數(shù)據(jù)，采樣頻率4 kHz，掃描速度5.0 s/div，連續(xù)描計5 min正常收縮曲線，計算5 min內(nèi)收縮張力最大值、平均值以及收縮頻率。

2.9 Western blot法檢測離體子宮組織凋亡、自噬信號通路相關(guān)蛋白 取小鼠離體子宮組織用組織勻漿器于冰上充分研磨，用低溫離心機(jī)離心后取上清，得到小鼠子宮組織蛋白樣品，并用BCA法進(jìn)行蛋白定量。通過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育相應(yīng)一抗和二抗，而后用ECL試劑盒顯影，采用Image J分析蛋白條帶灰度值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對產(chǎn)后小鼠的抗疲勞作用 與生理鹽水對照組比，服用抗衰老口服液明顯延長產(chǎn)后小鼠的游泳時間。中、高劑量組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，游泳時間延長率呈劑量依賴性增長(見表1)。

表1 抗衰老口服液對產(chǎn)后小鼠游泳時間的影響

3.2 對產(chǎn)后小鼠出、凝血時間的影響 抗衰老口服液各劑量組產(chǎn)后小鼠出血時間和凝血時間較生理鹽水對照組明顯縮短(P<0.05)，并且高劑量組的出血時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表2)。

表2 抗衰老口服液對產(chǎn)后小鼠出、凝血時間的影響

3.3 對產(chǎn)后小鼠的補(bǔ)血作用

3.3.1 給藥7 d對產(chǎn)后小鼠血紅蛋白Hb及紅細(xì)胞數(shù)RBC的影響 連續(xù)給藥7 d后，與生理鹽水對照組相比，抗衰老口服液各劑量組小鼠Hb顯著升高，且高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。此外，抗衰老口服液各劑量組RBC顯著升高，且低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。

表3 抗衰老口服液給藥7 d對產(chǎn)后小鼠Hb、RBC的影響

3.3.2 給藥14 d對產(chǎn)后小鼠血紅蛋白Hb及紅細(xì)胞數(shù)RBC的影響 給藥14 d后，與生理鹽水對照組相比，產(chǎn)后小鼠Hb、RBC未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05)(見表4)。

表4 抗衰老口服液給藥14天對產(chǎn)后小鼠Hb、RBC的影響

3.4 對小鼠離體子宮功能的影響

3.4.1 對小鼠離體子宮收縮張力的影響 與正常對照組即未孕小鼠相比，產(chǎn)后小鼠子宮收縮張力最大值、平均值均增大(P<0.01)。與產(chǎn)后空白組相比，給予相應(yīng)藥物后，小鼠離體子宮收縮張力最大值和平均值均有所增大，其中產(chǎn)后中、高劑量組、催產(chǎn)素組的平均張力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表5)。

表5 抗衰老口服液對小鼠離體子宮收縮張力最大值和平均值的影響

3.4.2 對小鼠離體子宮收縮頻率的影響 產(chǎn)后小鼠離體子宮收縮頻率較正常對照組顯著上升(P<0.01)。與產(chǎn)后空白組相比，給藥后的產(chǎn)后高劑量組、催產(chǎn)素組離體子宮收縮頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表6)。

表6 抗衰老口服液對小鼠離體子宮收縮頻率的影響

3.4.3 對小鼠離體子宮活動力的影響 產(chǎn)后小鼠離體子宮活動力較正常對照組顯著上升(P<0.01)。與產(chǎn)后空白組相比，產(chǎn)后高劑量組和催產(chǎn)素組小鼠離體子宮活動力均明顯提高(P<0.01)(見表7)。

表7 抗衰老口服液對小鼠離體子宮活動力的影響

3.4.4 對小鼠離體子宮內(nèi)膜組織凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對照組相比，產(chǎn)后小鼠子宮內(nèi)膜促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)。與產(chǎn)后空白組相比，抗衰老口服液中、高劑量顯著降低Bax和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，催產(chǎn)素組Bax和cleaved caspase-3水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而抗凋亡蛋白MCL1的蛋白表達(dá)無明顯差異(P> 0.05)(見表8、圖1)。

表8 小鼠離體子宮內(nèi)膜組織的凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

A.正常對照組；B.產(chǎn)后空白組；C.產(chǎn)后低劑量組；D.產(chǎn)后中劑量組；E.產(chǎn)后高劑量組；F.催產(chǎn)素組圖1 各組子宮內(nèi)膜組織凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3.5 對小鼠離體子宮肌層組織自噬信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與正常對照組相比，小鼠子宮肌層MCL1、p-mTOR的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而p-P53、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ水平明顯升高(P<0.01)。產(chǎn)后中、高劑量組和催產(chǎn)素組MCL1、p-mTOR水平較產(chǎn)后空白組顯著升高(P<0.05,P<0.01)，尤以產(chǎn)后高劑量組和催產(chǎn)素組更為明顯，而p-P53、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)則呈劑量依賴性顯著降低(P<0.05,P<0.01)(見表9、圖2)。

表9 小鼠離體子宮肌層組織的自噬信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

A.正常對照組；B.產(chǎn)后空白組；C.產(chǎn)后低劑量組；D.產(chǎn)后中劑量組；E.產(chǎn)后高劑量組；F.催產(chǎn)素組圖2 各組子宮肌層組織自噬信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

4 討論

正常情況下，女性分娩后需要6～8周時間使子宮恢復(fù)到孕前狀態(tài)[2]，該過程中易出現(xiàn)宮縮乏力、惡露不盡、產(chǎn)后腹痛的現(xiàn)象，若不及時治療則可能引起月經(jīng)失調(diào)、子宮內(nèi)膜炎、繼發(fā)性貧血甚至失血性休克等并發(fā)癥，對產(chǎn)婦的身心健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響[3]，因此促進(jìn)子宮復(fù)舊以避免產(chǎn)后并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義。目前，臨床上常采用催產(chǎn)素等藥物加強(qiáng)子宮收縮，減少出血風(fēng)險以促進(jìn)產(chǎn)后恢復(fù)[4]。催產(chǎn)素雖然具有價格低廉，起效快等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著維持時間短，需持續(xù)注射等弊端[5]。如今，研究者對于中醫(yī)藥促進(jìn)產(chǎn)后復(fù)舊的關(guān)注度越來越高，相關(guān)的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)了中藥具有良好的臨床療效[6]，這表明中醫(yī)藥或能在促進(jìn)產(chǎn)后復(fù)舊方面發(fā)揮其卓越的作用。

本研究中，給予抗衰老口服液后，產(chǎn)后小鼠游泳時間明顯提升，提示可能與抗衰老口服液提高機(jī)體活力、促進(jìn)產(chǎn)后機(jī)體恢復(fù)有關(guān)。目前，我國孕產(chǎn)死亡的因素中，產(chǎn)后出血仍處于第1位[7]，抗衰老口服液顯著降低產(chǎn)后小鼠的出血、凝血時間，說明其具有一定的止血作用。此外，給予抗衰老口服液7 d使產(chǎn)后小鼠Hb、RBC增加，說明抗衰老口服液具有促進(jìn)機(jī)體生血、補(bǔ)血的作用，然而給予14 d后，Hb、RBC的增加并不顯著，這可能與產(chǎn)后小鼠經(jīng)過一定時間后機(jī)體的自愈能力有關(guān)。產(chǎn)后出血發(fā)生的主要原因之一為宮縮乏力。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，抗衰老口服液中的皂苷類成分可加強(qiáng)子宮平滑肌收縮，增加對肌間血管的壓力從而有效止血[8-9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗衰老口服液能提高產(chǎn)后小鼠子宮的收縮張力、收縮頻率及子宮活動力，其中以高劑量組最為顯著，這說明抗衰老口服液對產(chǎn)后小鼠子宮的功能恢復(fù)具有一定的促進(jìn)作用。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜與子宮肌層重塑使得子宮恢復(fù)到妊娠前的大小[10]，這與細(xì)胞凋亡和自噬密切相關(guān)[11-12]。妊娠期間，由于MCL1介導(dǎo)的抗凋亡信號增強(qiáng)，子宮caspase-3保持非凋亡狀態(tài)。足月到分娩期間，子宮中MCL1介導(dǎo)的抗凋亡信號減弱，激活子宮內(nèi)膜凋亡信號。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后離體子宮內(nèi)膜組織中抗凋亡蛋白MCL1無明顯變化，而Bax、cleaved caspase-3介導(dǎo)的凋亡信號表達(dá)水平升高，正說明了保護(hù)性的抗凋亡信號中斷，子宮內(nèi)膜凋亡信號激活。給予抗衰老口服液后，凋亡信號表達(dá)明顯降低。說明抗衰老口服液抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞過度凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)膜修復(fù)。有研究表明，子宮收縮及縮復(fù)導(dǎo)致肌層血流量減少，從而使子宮肌細(xì)胞處于饑餓狀態(tài)[13]。因此，自噬被激活，通過降解非必要的細(xì)胞成分，釋放營養(yǎng)物質(zhì)，而MCL1調(diào)節(jié)著凋亡與自噬的平衡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后小鼠離體子宮肌層組織中MCL1和抑制自噬過程的p-mTOR水平顯著降低，而抑制mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的p-P53則顯著增加，使得子宮肌層自噬作用進(jìn)一步增強(qiáng)，這一點(diǎn)也通過自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ[15]的表達(dá)增加得到了證實(shí)。有研究發(fā)現(xiàn)，LC3-Ⅱ在產(chǎn)后第1天小鼠的子宮肌層組織中表現(xiàn)出顯著地增加[16]。類似的，本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)后小鼠離體子宮肌層中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平顯著升高，給予抗衰老口服液和催產(chǎn)素均能使其顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，抗衰老口服液對于調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜凋亡信號通路和子宮肌層自噬信號通路具有一定調(diào)節(jié)作用，或能促進(jìn)產(chǎn)后子宮組織快速重塑。綜上所述，抗衰老口服液對產(chǎn)后子宮復(fù)舊具有積極的促進(jìn)效果，可能與其調(diào)控凋亡和自噬相關(guān)蛋白有關(guān)。