徐 晴，許甫超，秦丹丹，彭嚴(yán)春，朱展望，董 靜

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是由禾谷鐮刀菌引起的一種真菌病害，多發(fā)于溫暖濕潤(rùn)地區(qū)。中國(guó)長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)一直是小麥赤霉病的高發(fā)麥區(qū)。近年來(lái)，隨著氣候變化和耕作制度的改變，赤霉病逐漸向其他麥區(qū)擴(kuò)展，目前已經(jīng)是黃淮冬麥區(qū)的常發(fā)病害。作為穗部病害，赤霉病不僅造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，染病籽粒中含有的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)等真菌毒素還嚴(yán)重影響人畜健康。因此，綜合分析影響小麥赤霉病發(fā)生的遺傳和環(huán)境因素，對(duì)采取不同手段對(duì)小麥赤霉病進(jìn)行防控，減輕赤霉病危害具有重要意義。

矮稈基因可降低株高，減少倒伏的發(fā)生，提高收獲指數(shù)和籽粒產(chǎn)量。目前小麥中共有24個(gè)矮稈基因(～)被命名。在中國(guó)分布最廣泛的矮稈基因有4個(gè)，分別為4BS染色體上的()、4DS染色體上的()、2DS染色體上的以及6AL染色體上的。研究發(fā)現(xiàn)，小麥株高與赤霉病抗性呈顯著正相關(guān)，即矮稈基因型材料的赤霉病抗性通常低于野生型材料。Buerstmayr等研究報(bào)道，大約40%的株高QTL與赤霉病抗性相關(guān)QTL共定位。、和基因位點(diǎn)被共定位到多個(gè)赤霉病抗性基因。其中，被認(rèn)為是對(duì)赤霉病抗性負(fù)效應(yīng)最大的矮稈基因，Voss等證實(shí)，可使植株的赤霉病嚴(yán)重度增加22%～53%。Srinivasachary等發(fā)現(xiàn)，主要影響植株穗部對(duì)赤霉病的抗侵染能力(Type I抗性)及赤霉病的嚴(yán)重度，而主要影響植株穗部對(duì)赤霉病的抗擴(kuò)展能力(Type II 抗性)，對(duì)赤霉病嚴(yán)重度的影響不顯著。除株高外，小麥的其他農(nóng)藝性狀如小穗密度、花藥長(zhǎng)短等均被發(fā)現(xiàn)與小麥赤霉病抗性有顯著關(guān)聯(lián)，小穗密度大、花藥短，被認(rèn)為與增加赤霉病感病率有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，可增加小麥赤霉病嚴(yán)重度，且與基因共定位的赤霉病感病位點(diǎn)同時(shí)也控制麥穗的小穗密度，說明增加赤霉病嚴(yán)重度可能與其增加了小穗密度有關(guān)。

、和矮稈基因與赤霉病抗性的關(guān)系已有研究，但是利用自然群體對(duì)其遺傳效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證鮮有報(bào)道。因此，本研究通過分析、和矮稈基因在我國(guó)不同麥區(qū)的分布情況以及調(diào)查不同麥區(qū)的赤霉病抗性和小穗密度，研究、和矮稈基因?qū)Τ嗝共】剐砸约靶∷朊芏鹊倪z傳效應(yīng)，試圖解析矮稈基因增加小麥赤霉病感病性的深層原因，討論矮稈基因的利用對(duì)不同麥區(qū)赤霉病抗性育種的影響，以期為不同麥區(qū)協(xié)同選擇矮稈基因和赤霉病抗性育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

211份供試材料來(lái)自中國(guó)5個(gè)不同麥區(qū)。其中，北部冬麥區(qū)10份(Zone I)、黃淮冬麥區(qū)117份(Zone II)、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)54份(Zone III)、西南冬麥區(qū)16份(Zone IV)、西北春麥區(qū)14份(ZoneⅧ)，這些材料包含濟(jì)麥22、寧麥9號(hào)、小偃6號(hào)、西農(nóng)979、鄭麥9023等在各大麥區(qū)廣泛種植的品種，基本代表了中國(guó)當(dāng)前小麥生產(chǎn)現(xiàn)狀和育種 進(jìn)展。

1.2 DNA提取

2020年10月底，將211份小麥材料播種于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南湖試驗(yàn)田，每個(gè)材料取60粒種子種植成一行，行長(zhǎng)1 m，行間距25 cm。于小麥拔節(jié)期，取每個(gè)材料最上部葉片組織于2 mL離心管中，用CTAB法提取DNA。用Nanodrop測(cè)定DNA的濃度。

1.3 矮稈基因 Rht1、 Rht2和 Rht8的分子檢測(cè)

用Rasheed等設(shè)計(jì)的KASP標(biāo)記對(duì)矮稈基因和進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)記序列見表1，其中，F(xiàn)AM為野生型，HEX為矮稈基因型。KASP標(biāo)記的檢測(cè)由武漢市景肽生物科技有限公司完成，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參照Xu等的方法。用Korzun等發(fā)表的SSR標(biāo)記Xgwm261對(duì)矮稈基因進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)記序列由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行引物合成，PCR反應(yīng)體系為15 μL，包含7.5 μL 2× Taq PCR Mix，上下游引物(10 μmol·L)各1 μL，100 ng DNA模板，用ddHO補(bǔ)充至15 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃ 延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，銀染法進(jìn)行染色。

表1 本研究矮稈基因檢測(cè)所用引物序列

1.4 赤霉病抗性的鑒定

供試材料赤霉病抗性的鑒定分別于2014、2015和2016年在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南湖試驗(yàn)基地開展。試驗(yàn)材料采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，2次重復(fù)。每個(gè)材料種植2行，行長(zhǎng)1 m，行間距25 cm。赤霉菌菌株為有較強(qiáng)致病力的黃岡1號(hào)，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所楊立軍研究員提供。于小麥開花期，各小區(qū)隨機(jī)選擇10個(gè)麥穗，用防水紙膠帶標(biāo)記，然后用濃度為5×10·mL的孢子懸浮液噴霧接種標(biāo)記穗子。試驗(yàn)期間用微電腦控制定時(shí)迷霧裝置增濕，促進(jìn)發(fā)病，接種后 21 d，調(diào)查各小區(qū)標(biāo)記穗子的病小穗數(shù)和總小穗數(shù)，計(jì)算赤霉病病情指數(shù)(disease index，DI)。赤霉病病情指數(shù)=(發(fā)病嚴(yán)重度×發(fā)病率)×100%，其中，發(fā)病嚴(yán)重度=病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%；發(fā)病率=發(fā)病穗數(shù)/總穗數(shù)×100%。其中，以蘇麥3號(hào)為抗性對(duì)照，以武漢1號(hào)為中抗對(duì)照，以Gammenya為感病對(duì)照。詳細(xì)鑒定方法參考Zhu等的步驟。

1.5 小穗密度的測(cè)定

小穗密度的調(diào)查隨材料的赤霉病抗性鑒定進(jìn)行，以小穗間距表示。每個(gè)材料調(diào)查10個(gè)麥穗的穗長(zhǎng)(不含芒長(zhǎng))和總小穗數(shù)，小穗間距=穗長(zhǎng)/總小穗數(shù)。取10個(gè)麥穗的小穗間距平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 5進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rht1、 Rht2和 Rht8 矮稈基因在不同麥區(qū)小麥品種中的分布頻率

利用和矮稈基因的功能標(biāo)記對(duì)211份供試材料進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果(表2和表3)顯示，攜帶和的品種(系)分別為81份和100份，分布頻率分別為38.39%和 47.39%。在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)的分布頻率最高，為72.23%，在其他麥區(qū)的分布頻率大小依次為西南冬麥區(qū)(37.50%)>黃淮冬麥區(qū) (30.00%)>北部冬麥區(qū)(25.00%)>西北春麥區(qū) (7.14%)。與不同，的分布頻率在黃淮冬麥區(qū)最高，為 65.38%，在其他麥區(qū)的分布頻率大小依次為北部冬麥區(qū)(50.00%)>西南冬麥區(qū) (43.75%)>西北春麥區(qū)(14.29%)>長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(8.51%)。不同省份小麥品種(系)中矮稈基因和的分布頻率也存在較大差異，其中，在黃淮冬麥區(qū)陜西小麥材料中分布頻率最高，為76.19%；在黃淮冬麥區(qū)河南小麥材料中分布頻率最高，為 84.21%，其次為山東小麥材料，為73.08%。在西北春麥區(qū)甘肅小麥材料中未發(fā)現(xiàn)攜帶和的品種。利用緊密連鎖SSR標(biāo)記Xgwm261對(duì)供試品種(系)進(jìn)行PCR檢測(cè)，若能夠擴(kuò)增出192 bp的片段，說明該品種攜帶矮稈基因。結(jié)果(表2和表3)顯示，攜帶的品種(系)有125份，占59.24%。其在北部冬麥區(qū)的分布頻率最高，為75.00%，在其他麥區(qū)的分布頻率大小依次為黃淮冬麥區(qū)(64.62%)>西南冬麥區(qū)(56.25%)>長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(53.19%)>西北春麥區(qū)(30.77%)。不同省份小麥品種(系)中矮稈基因的分布頻率存在較大差異，其中，黃淮冬麥區(qū)的安徽 (100%)、河南(77.19%)和陜西 (66.67%)三個(gè)省份小麥材料中的分布頻率較高，而山東小麥材料中的分布頻率較低(34.62%)；長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)湖北小麥材料中的分布頻率也較低，僅35.00%。

表2 211份供試小麥材料中 Rht1、 Rht2和 Rht8矮稈基因的檢測(cè)結(jié)果

(續(xù)表2 Continued table 2)

表3 Rht1、 Rht2和 Rht8矮稈基因在不同麥區(qū)的分布頻率

從矮桿基因組合來(lái)看，攜帶+組合的品種分布頻率最高，為27.9%；其次為+組合，分布頻率為25.1%，主要分布在黃淮冬麥區(qū)。僅黃淮冬麥區(qū)品種邯5316中檢測(cè)到++的組合，其他品種中均未同時(shí)檢測(cè)到3個(gè)基因。

2.2 赤霉病抗性與株高和小穗密度的相關(guān)性

相關(guān)性分析表明，赤霉病病情指數(shù)在自然群體中與株高和小穗間距均呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.48和-0.33，說明株高越矮，小穗密度越大，植株感病的可能性越高。

2.3 矮稈基因?qū)π←溨旮?、赤霉病抗性和小穗密度的影?/h3>

由表4可以看出，在株高方面，矮稈基因、和均可使株高降低，其中的降稈效應(yīng)達(dá)到顯著水平，和達(dá)到極顯著水平，的降稈效應(yīng)最強(qiáng)。在赤霉病病情指數(shù)方面，攜帶矮稈基因和的小麥品種，赤霉病病情指數(shù)均極顯著高于其對(duì)應(yīng)野生型品種，增幅分別為30.97%和15.62%，說明和顯著降低了小麥赤霉病抗性；攜帶矮稈基因的小麥品種，赤霉病病情指數(shù)則極顯著低于其對(duì)應(yīng)野生型品種，降幅為17.72%，說明極顯著提高了小麥赤霉病抗性。在小穗間距方面，攜帶矮稈基因和的小麥品種，小穗間距極顯著小于其對(duì)應(yīng)野生型品種，即攜帶矮稈基因和的小麥品種小穗密度增大，平均小穗密度增幅分別為4.35%和 8.33%；攜帶矮稈基因的小麥品種，小穗間距則極顯著大于其對(duì)應(yīng)野生型品種，增幅為4.54%。

表4 矮稈基因在自然群體中對(duì)株高、赤霉病病情指數(shù)和小穗間距的影響

3 討 論

3.1 矮稈基因的分子檢測(cè)與分布

利用功能基因標(biāo)記進(jìn)行基因型分析是基因檢測(cè)最為準(zhǔn)確的方法。本研究利用Rasheed等開發(fā)的和的KASP功能基因標(biāo)記以及Korzun等報(bào)道的緊密連鎖SSR標(biāo)記Xgwm261對(duì)211份小麥自然群體材料的矮稈基因進(jìn)行分析。為了對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，選取本研究與前人研究中共同品種的矮稈基因鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比表明，小偃6號(hào)、豫麥70、鄂麥11等品種攜帶；周麥18、鄭麥9023、濟(jì)麥17、濟(jì)麥19等品種攜帶，與楊松杰等的研究結(jié)果一致；豫麥70、小偃6號(hào)、小偃22等均攜帶，而鄭麥9023、濟(jì)麥17、鄂麥11、鄂麥12、鄂恩1號(hào)等品種不含矮稈基因，與周 陽(yáng)等對(duì)的研究結(jié)果一致。本研究矮稈基因分布頻率分析結(jié)果顯示，矮稈基因在我國(guó)不同麥區(qū)分布頻率差異較大，3個(gè)主要矮稈基因在我國(guó)的分布頻率大小依次是(59.24%)>(47.39%)>(38.39%)。就矮稈基因組合來(lái)說，以+和+組合的分布頻率較高，且主要分布在黃淮冬麥區(qū)。就單個(gè)矮稈基因來(lái)說，主要分布在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)(江蘇省和湖北省)以及黃淮冬麥區(qū)的陜西??；和均主要分布在黃淮冬麥區(qū)，分布頻率分別為65.38%和64.62%，其中在河南小麥品種中分布頻率最高，在河北小麥品種中分布頻率最高。矮稈基因、和在中國(guó)不同麥區(qū)的分布頻率與前人研究結(jié)果基本一致，表明在我國(guó)小麥近年來(lái)的育種進(jìn)程中，不同麥區(qū)對(duì)矮稈基因、和的利用有一定的偏好性。原因可能與不同麥區(qū)形成的育種模式有關(guān)，也可能與不同麥區(qū)的育種目標(biāo)(矮稈基因控制的其他農(nóng)藝性狀、抗性等)有關(guān)。

3.2 矮稈基因與赤霉病抗性的關(guān)系

一般認(rèn)為，矮稈基因增加赤霉病感病性的原因可能有三個(gè)：第一，植株高度降低，縮短了地表孢子到達(dá)麥穗的距離，使麥穗感染病菌的概率增加；第二，株高降低后，麥穗所處微環(huán)境發(fā)生變化，高溫高濕更利于病原菌的繁殖和擴(kuò)展；第三，矮稈基因本身遺傳效應(yīng)的影響。雖然前人研究發(fā)現(xiàn)，株高基因與赤霉病抗性相關(guān)QTL共定位，但大部分株高QTL與赤霉病嚴(yán)重度沒有關(guān)系，說明矮稈基因?qū)Τ嗝共】剐缘挠绊懜锌赡苁腔虻倪z傳效應(yīng)引起的，而不僅僅是矮稈基因造成的植株形態(tài)改變。例如，Draeger等提出矮稈基因增加赤霉病感病性可能是基因連鎖或者一因多效造成的，而不是株高造成的躲避效應(yīng)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，位于6A染色體的株高基因不與任何赤霉病抗性相關(guān)QTL位點(diǎn)重合。Gervais等對(duì)Renan/Recital群體研究發(fā)現(xiàn)，雖然5A染色體上株高與赤霉病抗性基因位點(diǎn)共定位，但是位于4A染色體的株高控制基因與赤霉病抗性沒有關(guān)聯(lián)。本研究對(duì)211份自然群體材料中、和矮稈基因進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合不同環(huán)境下自然群體的赤霉病病情指數(shù)，分析矮稈基因?qū)Τ嗝共】剐缘倪z傳效應(yīng)。結(jié)果表明，攜帶和矮稈基因的品種，赤霉病病情指數(shù)顯著高于野生型品種，說明矮稈基因和對(duì)赤霉病抗性的遺傳效應(yīng)較大，驗(yàn)證了本課題組前期的研究結(jié)果。不同于，對(duì)赤霉病抗性影響的研究結(jié)果有所不同。Srinivasachary等利用Soissons/Orvantis構(gòu)建的DH群體研究矮稈基因與赤霉病抗性的關(guān)系，結(jié)果顯示，可以顯著增加小麥赤霉病感病性， 而對(duì)赤霉病抗性的效應(yīng)不顯著；進(jìn)一步利用2個(gè)近等基因系研究發(fā)現(xiàn)，高病壓大田條件下，和均可以顯著增加赤霉菌對(duì)植株的侵染；但中等壓力的大田條件下，對(duì)小麥赤霉病感病性的影響不顯著；特別是單花滴注條件下，則表現(xiàn)為顯著提高小麥赤霉病的抗性。同時(shí)，Miedaner等的研究結(jié)果也表明，對(duì)小麥赤霉病抗性的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于和；且不同遺傳背景材料對(duì)矮稈基因造成的赤霉病抗性影響較大，矮稈基因?qū)Τ嗝共「胁〉挠绊懺诳剐圆牧现锌赡鼙恢泻汀Ｔ诒狙芯恐?，攜帶矮稈基因小麥材料的赤霉病病情指數(shù)顯著降低，這可能與自然群體結(jié)構(gòu)影響有關(guān)，但也從側(cè)面說明對(duì)赤霉病抗性的影響較小，且受遺傳背景材料影響較大。因此，并不是所有的矮稈基因均嚴(yán)重影響赤霉病抗病性，不同矮稈基因?qū)Τ嗝共】剐缘挠绊懸泊嬖诓煌?，因此，在需要協(xié)同考慮赤霉病抗性育種的麥區(qū)，可以優(yōu)先選擇與赤霉病抗性沒有關(guān)聯(lián)或者影響較小的矮稈基因進(jìn)行育種利用，例如與赤霉病抗性沒有關(guān)聯(lián)的。

除了株高外，小穗密度是影響小麥赤霉病發(fā)生的另一個(gè)重要性狀。本研究中，3個(gè)矮稈基因?qū)π∷朊芏鹊倪z傳效應(yīng)存在差異。與野生型品種相比，攜帶矮稈基因品種的小穗密度變大，與本課題組前期研究結(jié)果一致。因此，對(duì)赤霉病感病性的影響除受株高的影響外，與小穗密度可能也有關(guān)。本研究中對(duì)赤霉病和小穗密度的遺傳效應(yīng)與基本一致。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，與野生型品種相比，攜帶矮稈基因品種的小穗密度顯著變小，而小穗密度變小則可降低赤霉病的擴(kuò)展能力，從而使植株抗性增加。因此，綜合考慮我國(guó)不同麥區(qū)矮稈基因的分布頻率及赤霉病抗性差異，認(rèn)為對(duì)赤霉病抗性影響小可能與其可以降低小穗密度有關(guān)，在赤霉病高發(fā)的長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)，的分布頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于和，這符合長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)長(zhǎng)期開展的赤霉病抗性育種目標(biāo)要求。對(duì)于黃淮冬麥區(qū)，赤霉病發(fā)生概率較低，且育種目標(biāo)多為高產(chǎn)，和矮稈基因不僅可以降低株高，同時(shí)可以增加小穗密度，進(jìn)而增加穗粒數(shù)，提高產(chǎn)量，因此，這2個(gè)矮稈基因很容易在育種過程中被選擇，從而導(dǎo)致和在黃淮冬麥區(qū)的分布頻率較高。鑒于和對(duì)赤霉病感病的效應(yīng)值更大，黃淮冬麥區(qū)小麥品種普遍易感赤霉病可能與此有關(guān)，在赤霉病發(fā)生的特殊年份則存在較大的生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。本研究是利用自然群體進(jìn)行的初步分析，因此，和對(duì)小穗密度的遺傳效應(yīng)仍需在遺傳群體中進(jìn)行進(jìn)一步研究。