陳 瑩，周祖平，3，邢 兵，蒲仕明，3*

(1.廣西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 廣西 桂林 541006；2.廣西高校干細(xì)胞與醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西師范大學(xué))，廣西 桂林 541004；3.廣西師范大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 桂林 541004)

肺癌(lung cancer)是全球范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，其中近一半病例(49.9%)發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。肺癌是全球男性最常見癌癥且是男性癌癥死亡的主要原因[2]。我國肺癌發(fā)病率和死亡率位居所有癌癥之首，每年新發(fā)肺癌病例約78.7萬例，每年因肺癌死亡例數(shù)為63.1萬[3]。

Schlafen(SLFN)蛋白家族最初在小鼠細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，該家族蛋白在一些惡性腫瘤中可以抑制癌細(xì)胞的遷移和入侵[4-6]、腫瘤錨定依賴生長[7-9]、促進(jìn)癌細(xì)胞對化療的敏感性[6，11-12]，表明SLFNs家族蛋白在腫瘤領(lǐng)域有可能成為一種新的治療靶點(diǎn)。SLFN2作為SLFNs的關(guān)鍵成員，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化[12-13]。劉夢伊等[14]研究表明腫瘤細(xì)胞中Slfn2基因穩(wěn)定表達(dá)后，其生長增殖速度明顯減緩，遷移能力也顯著降低，提示Slfn2基因在抑制腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。目前Slfn2基因參與腫瘤細(xì)胞活動(dòng)的作用及分子機(jī)制尚不清楚，為深入研究Slfn2基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本文利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Slfn2-/-LLC細(xì)胞，為開展后續(xù)機(jī)制研究的相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料

肺癌細(xì)胞系LLC、胚腎細(xì)胞293T購自中科院典型培養(yǎng)物昆明細(xì)胞庫；感受態(tài)Stb13、pLenti CRISPR v2、pMD2.G、psPAX2購自武漢淼靈生物科技有限公司；質(zhì)粒測序由天一輝遠(yuǎn)生物有限公司完成。

1.1.2 主要試劑

T4連接酶、Esp3I(BsmBI)酶、胎牛血清、DMEM、Agarose、單鏈DNA oligo與引物合成均購自Thermo Fisher Scientific；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、氨芐青霉素、嘌呤霉素、PCR mix購自天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

PCR儀器，購自Biometra公司；恒溫水槽，購于上海力辰邦西儀器科技有限公司；恒溫?fù)u床，購于上海駙瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，購于Thermo Fisher公司；霉菌培養(yǎng)箱，購于上海智城分析儀器制造有限公司；水平電泳槽、通用電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購于Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA序列的設(shè)計(jì)

在CHOPCHOP基因編輯網(wǎng)站(http:∥chopchop.cbu.uib.no/)的“Mus muscμLus(mm10/GRCm38)”物種下查詢Slfn2(NM_011408.1)基因“CRISPR/Cas9”的全部“Knock-down”突變位點(diǎn)，選取脫靶預(yù)測最低的2個(gè)sgRNA序列，并根據(jù)pLenti CRISPR v2酶切位點(diǎn)黏性末端序列設(shè)計(jì)oligo與之對應(yīng)的黏性末端，即在正義鏈5′端添加CACC，反義鏈5′端添加AAAC(圖1)。此外，sgRNA的5′端不為“G”的則額外添加“G”。

1.2.2 pLenti CRISPR-Slfn2組質(zhì)粒的構(gòu)建

1)oligo的退火。將合成的oligo sgRNA稀釋至50 μmol/L，各取10 μL與Annealing Buffer(5×，10 μL)混合并定容至50 μL；隨后加熱至95 ℃后緩慢降溫至25 ℃。稀釋200倍后使用(50 nmol/L)。

2)sgRNA表達(dá)。載體酶切重組的酶切連接反應(yīng)體系：pLenti CRISPR v2(100 ng/μL)1 μL、oligo(50 nmol/L)1 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、5× DNA Ligase Reaction Buffer 4 μL、Esp3I 1 μL、10× Buffer Tango 2 μL、DTT(20 mmol/L)1 μL、ddH2O 9 μL，總體積20 μL。將20 μL反應(yīng)物置于PCR儀，按程序進(jìn)行酶切連接反應(yīng)：37 ℃ 3 min、23 ℃ 3 min, 20個(gè)循環(huán)；37 ℃ 10 min，50 ℃ 30 s，80 ℃ 5 min，4 ℃ 無限循環(huán)。

3)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將構(gòu)建的質(zhì)粒4 μL加入至50 μL Stb13感受態(tài)細(xì)胞中，輕微混勻后冰上孵育30 min，隨后將感受態(tài)置42 ℃水浴熱激90 s，并快速將其轉(zhuǎn)移到冰上冰浴5 min。向每管感受態(tài)中加入500 μL LB培養(yǎng)基后，將其轉(zhuǎn)移到37 ℃搖床培養(yǎng)箱(200 r/min)恒溫培養(yǎng)1 h。

4)重組質(zhì)粒鑒定。將感受態(tài)10 μL均勻涂抹到含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上，并將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到37 ℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～16 h。挑取良好的菌落加入到PCR體系(含PCR mix、Primer-pLenti-F：GGTACCGAGGGCCTATTTCC，Primer-pLenti-R：ACTTTCCCAGTTTACCCCGC)中，對插入sgRNA區(qū)域的片段擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳驗(yàn)證和測序驗(yàn)證。

1.2.3 質(zhì)粒提取

將驗(yàn)證的菌落活化后，加入到含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床培養(yǎng)箱(300 r/min)培養(yǎng)12～16 h。質(zhì)粒提取嚴(yán)格按照天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP118-02)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行。提取的質(zhì)粒測定濃度后待用。pMD2.G、psPAX2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、擴(kuò)大、提取均按1.2.2節(jié)方法進(jìn)行。

1.2.4 慢病毒包裝

首先，將pLenti CRISPR v2、pMD2.G、psPAX2按摩爾比1∶1∶1(共30 μg)加入到DMEM培養(yǎng)基中(最終體積為500 μL)，充分混勻制備成質(zhì)粒體系；將90 μL PEI(1 g/L)加入到410 μL DMEM培養(yǎng)基中，充分混勻制備成轉(zhuǎn)染體系。接著，兩體系室溫孵育5 min后，將質(zhì)粒體系逐滴加入渦旋震蕩的轉(zhuǎn)染體系中，并室溫孵育20 min。隨后，經(jīng)轉(zhuǎn)染體系逐滴加入生長良好且細(xì)胞融合度為70%～80%的293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染4 h。然后，去除轉(zhuǎn)染體系，加入DMEM完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%FBS、體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗，下同)在二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2，下同)培養(yǎng)12 h后，換新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。最后，收取病毒液，并用0.45 μm過濾器過濾病毒液。病毒液經(jīng)慢病毒滴度快速檢測卡(購于北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司)檢測病毒滴度后待用。

1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞

將病毒液加入到生長良好、細(xì)胞融合度為30%的LLC細(xì)胞中感染48 h。隨后將培養(yǎng)基換成含有嘌呤霉素(終濃度為4 mg/L)的DMEM完全培養(yǎng)基，篩選2個(gè)48 h。

1.2.6 單克隆培養(yǎng)

將篩選得到的LLC細(xì)胞經(jīng)消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，用有限稀釋法將細(xì)胞接種到96孔板中。待細(xì)胞貼壁后用顯微鏡觀察含有1個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)孔，并做好標(biāo)記。

1.2.7 細(xì)胞DNA提取

單克隆細(xì)胞擴(kuò)大后，取部分細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液(10 mmol/L Tris-Cl、0.1 mol/L EDTA、0.5% SDS、10 mg/L蛋白酶k)裂解2 h，加入2倍體積乙醇混勻，15 000×g離心沉淀DNA，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70%乙醇清洗2次后，加入適量ddH2O溶解DNA。

1.2.8 目的基因敲除鑒定

將提取的DNA加入到PCR體系(含PCR mix、Primer-Slfn2-F：CTGGGAAAATGGGCATCAGTG，Primer-Slfn2-R：CAGCTCCGGATTTGTGCACTT)中，對敲除區(qū)域的片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲取擴(kuò)增片段進(jìn)行電泳驗(yàn)證和測序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 sgRNA序列設(shè)計(jì)

在CHOPCOHP網(wǎng)站選取脫靶率低、編輯效率較高且位于Slfn2外顯子上的sgRNA位點(diǎn)2個(gè)(sgRNA-1：GCTCTTTGATGCGTTTTCGC，sgRNA-2：TGTGCTGTCCTGAATTCGGG)，并結(jié)合酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)和合成oligo序列(圖1)。

藍(lán)色部分為插入接頭序列，紅色部分為sgRNA，黑色部分為sgRNA的反向互補(bǔ)序列

2.2 pLenti CRISPR-Slfn2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

針對Slfn2基因序列，設(shè)計(jì)2個(gè)sgRNA寡核苷酸序列，將sgRNA與pLenti CRISPR v2連接后，轉(zhuǎn)化至Stb13感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，pLenti CRISPR v2原始質(zhì)粒大小為2 374 bp，而經(jīng)過構(gòu)建的質(zhì)粒pLenti CRISPR-Slfn2-1&2的PCR產(chǎn)物大小為514 bp(圖2(A)、(B))。隨后對pLenti CRISPR-Slfn2-1&2 PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果表明，sgRNA序列已經(jīng)成功結(jié)合到pLenti CRISPR v2中，pLenti CRISPR-Slfn2-1&2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2(C))。

圖2 pLenti CRISPR-Slfn2重組質(zhì)粒的驗(yàn)證

2.3 突變克隆篩選與鑒定

將重組質(zhì)粒、pMD2.G、psPAX2轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞包裝病毒，利用收集的病毒感染LLC細(xì)胞。經(jīng)篩選后，進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，并對4個(gè)單克隆(Slfn2-1a、Slfn2-1b為sgRNA-1位點(diǎn)突變的單克隆，Slfn2-2a、Slfn2-2b為sgRNA-2位點(diǎn)突變的單克隆)進(jìn)行PCR和測序驗(yàn)證。結(jié)果表明：Slfn2-ctr擴(kuò)增的PCR片段大小為691 bp，Slfn2-1a、Slfn2-1b、Slfn2-2a擴(kuò)增的PCR片段均無明顯堿基丟失，Slfn2-2b的PCR片段有明顯的堿基丟失(圖3(A))。Slfn2-2a測序結(jié)果表明，在sgRNA-2剪切處出現(xiàn)了8個(gè)堿基丟失，造成移碼突變(圖3(B)、(C))。Slfn2-2b測序結(jié)果表明，在sgRNA-2剪切處出現(xiàn)了180個(gè)堿基丟失，造成60個(gè)氨基酸的丟失突變(圖3(D)、(E))。Slfn2-1a、Slfn2-1b在sgRNA-1突變位點(diǎn)處出現(xiàn)堿基測序混亂，可能獲得非純凈的單個(gè)克隆。這些結(jié)果證明利用sgRNA-2獲得了2個(gè)Slfn2基因敲除LLC細(xì)胞系。

3 討論

Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中Slfn2基因穩(wěn)定表達(dá)后，其生長增殖速度明顯減緩，遷移能力也顯著降低，提示Slfn2基因在抑制腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。為深入研究Slfn2在腫瘤細(xì)胞中的作用及分子機(jī)制，本文利用pLenti CRISPR v2構(gòu)建的重組質(zhì)粒與pMD2.G、psPAX2包裝病毒，并利用病毒實(shí)現(xiàn)LLC細(xì)胞中Slfn2的敲除，構(gòu)建Slfn2-/-LLC細(xì)胞用于后續(xù)研究。

Slfn2共5 567 bp，含有2個(gè)外顯子，共379個(gè)氨基酸，其中第2個(gè)外顯子含362個(gè)氨基酸，突變位點(diǎn)的選擇位于第2個(gè)外顯子上。經(jīng)篩選后，獲得sgRNA-1、sgRNA-2這2個(gè)不同突變位點(diǎn)的SgRNA，其中CHOPCHOP網(wǎng)站預(yù)測突變效率sgRNA-1為48.11%，sgRNA-2為67.27%。在實(shí)驗(yàn)獲取的單克隆中，sgRNA-1的單克隆并沒有獲得單一的細(xì)胞突變，測序后突變位點(diǎn)處序列混亂，可能是制備單克隆后實(shí)現(xiàn)的部分細(xì)胞突變；而突變效率較高的sgRNA-2的單克隆獲得單一的細(xì)胞突變。sgRNA-2獲得的2個(gè)單克隆中，Slfn2-2a剪切處出現(xiàn)了8個(gè)堿基丟失。8個(gè)堿基的缺失不僅僅丟失了2個(gè)氨基酸，更重要的是實(shí)現(xiàn)突變位點(diǎn)后外顯子的移碼突變(圖3(B)、(C))。Slfn2-2b在剪切處出現(xiàn)了180個(gè)堿基丟失，造成60個(gè)氨基酸的缺失突變(圖3(D)、(E))。此外，sgRNA-1位于第2個(gè)外顯子的下游，形成的移碼突變區(qū)域小，而sgRNA-2位于第2個(gè)外顯子的上游，形成的移碼突變Slfn2-2a剪區(qū)域較大。

4 結(jié)語

本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)Slfn2基因在LLC細(xì)胞中的敲除，并獲得移碼突變和60個(gè)氨基酸序列缺失的Slfn2-/-LLC細(xì)胞各1株，為后續(xù)深入研究Slfn2在腫瘤細(xì)胞中的作用及分子機(jī)制提供穩(wěn)定的研究對象。