陳怡帆，程蕾蕾，沈毅輝，張 卉，汪雪君，許宇辰，葛均波

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200032；

2.上海市心血管病研究所，上海 200032；

3.國(guó)家放射與治療臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海 200032；

4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心臟超聲診斷科，上海 200032

免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）已成為惡性腫瘤治療的新熱點(diǎn)［1］，但也誘發(fā)了以ICI相關(guān)心肌炎（ICIassociated myocarditis，ICIAM）為代表的免疫相關(guān)不良反應(yīng)［2］，其發(fā)生率雖僅為0.21%～3.30%，但死亡率卻高達(dá)27.0%～67.0%，居免疫相關(guān)不良反應(yīng)之首［2-4］。程序性死亡 ［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）抑制劑是應(yīng)用最廣的ICI，其誘發(fā)的ICIAM已成為腫瘤治療不可忽視的問題［5］，亟待通過動(dòng)物模型探究治療靶點(diǎn)。既往的小鼠心肌炎癥損傷模型均存在成模率低、病變范圍小、造模方式與臨床治療方案差異大等問題［6-10］，尚未有成熟的PD-1抑制劑誘導(dǎo)的自身免疫性心肌炎模型。因此，本實(shí)驗(yàn)擬建立一種能模擬PD-1抑制劑誘導(dǎo)的自身免疫性心肌炎發(fā)病過程的小鼠模型，為其機(jī)制研究及藥物篩選評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只6周齡健康雄性BALB/c小鼠，體重（22.5f 2.5）g（南京卡萊斯生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：320114000129353）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作符合3R原則。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立

30 只小鼠編號(hào)并隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組（control組）、自身免疫性心肌炎組（TnⅠ組）和ICI相關(guān)心肌炎組（TnⅠ+anti-PD-1組），每組10只。除control組外，分別于第1、7天給小鼠皮下注射0.1 mL含有0.25 mg小鼠TnⅠ［生工生物工程（上海）股份有限公司，設(shè)計(jì)序列：HARVDKVDEERYDVEAKVTKNITEIADLTQKI YDLRGKFKRPTLRRVRIS］肽段的完全弗氏佐劑（美國(guó)Sigma公司）。TnⅠ+anti-PD-1組自第7天起，按每次5 mg/kg給予腹腔注射PD-1抑制劑（InVivoMab anti-mouse PD-1），每2 d給藥1次，共5次，累積劑量為25 mg/kg。Control組每次給予與TnⅠ+anti-PD-1組同等劑量的生理鹽水腹腔注射。本研究使用的TnⅠ（0.25 mg）和anti-PD-1劑量（每次5 mg/kg）是基于已發(fā)表的研究［7，11］。各組于造模第1、21、56天檢測(cè)心臟功能和分子水平變化。

1.3 一般狀態(tài)

造模前：分別給小鼠稱重。造模后：記錄小鼠每日進(jìn)食量，觀察其一般情況變化，記錄死亡情況。

1.4 心臟指數(shù)

第56天將小鼠全部處死，開胸，沿主動(dòng)脈根部游離出心臟，用手術(shù)剪將大血管殘端、筋膜和脂肪組織剔除，分離出全心，灌注預(yù)先配制好的磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）沖去殘留血液，濾紙吸水，分析天平稱量全心濕質(zhì)量，計(jì)算心臟指數(shù)（cardiac index）：心臟指數(shù)=全心濕質(zhì)量（mg）/小鼠體重（g）。

1.5 二維超聲心動(dòng)圖

第1、56天用Vevo2100超聲系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖檢查，采用30 MHz高頻掃描探頭采集圖像。小鼠吸入異氟烷麻醉后平臥，胸前區(qū)備皮。在胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面左室內(nèi)徑最大處顯示M型圖像，連續(xù)采集15 s，分析左心室射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）。

1.6 病理學(xué)檢查

第56天將小鼠處死后，小鼠心臟用10%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蠟包埋，然后制成厚5 μm的水平切片。用H-E染色，選取光鏡下的代表性圖像（放大40倍）進(jìn)行分析。出現(xiàn)以下病理學(xué)特征之一可被判定為發(fā)生心肌炎：急性心肌炎期，心外膜下及心肌間質(zhì)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞壞死和間質(zhì)水腫［12］；擴(kuò)張型心肌病期，心肌細(xì)胞邊界模糊、纖維紊亂，細(xì)胞核排列不規(guī)則，部分細(xì)胞核固縮、碎裂，心肌間質(zhì)空泡樣改變［13］。

小鼠肺、肝臟、腎臟、小腸分別用10%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蠟包埋，然后制成5 μm厚的水平切片。分別進(jìn)行H-E、Masson染色并選取光鏡下的代表性圖像（放大40倍）進(jìn)行分析。出現(xiàn)以下病理學(xué)特征之一可被判定為發(fā)生TnⅠ、PD-1對(duì)其他器官的損害：出現(xiàn)彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫、空泡樣改變、纖維化增加，細(xì)胞壞死和細(xì)胞核固縮、碎裂［13］。

1.7 血清生物標(biāo)志物

第56天眼眶取500～1000 μL血液，2000hg離心20 min，取上清液300 μL，24 h內(nèi)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（武漢云克隆科技股份有限公司，SEA109Mu，MEA479Mu）檢測(cè)血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和CK同工酶（CK isoenzyme，CK-MB）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均用xfs表示。多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），使用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行Turkey法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

造模前control組、TnⅠ組和TnⅠ+anti-PD-1組小鼠體重分別為（22.4f 1.6）、（21.8f 1.8）和（22.4f 1.2）g，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模第21、56天，與control組相比，TnⅠ組和TnⅠ+anti-PD-1組的體質(zhì)量均顯著下降 ［第21天：（22.8f 1.5）gvs（19.5f 1.2）和（18.7f 1.0）g，P均＜0.05；第56天：（22.7f 1.4）gvs（19.0f 1.3）和（17.1f 0.4）g，P均＜0.01］，且TnⅠ+anti-PD-1組較TnⅠ組的體質(zhì)量也顯著下降 ［第21天：（18.7f 1.0）gvs（19.5f 1.2）g，P＜0.05；第56 天：（17.1 f 0.4）gv s（19.5f 1.2）g，P＜0.05，圖1A］。

造模開始后，與control組相比，TnⅠ組和TnⅠ+anti-PD-1組進(jìn)食量均顯著下降 ［第21天：（4.7f 0.2）gvs（4.0f 0.3）g，P＜0.05，（4.7f 0.2）gvs（3.5f 0.1）g，P＜0.01；第56天：（4.8f 0.2）gvs（3.4f 0.1）g，P＜0.05，（4.8f 0.2）gvs（2.4f 0.2）g，P＜0.01，圖1 B］，伴精神狀況差、活動(dòng)強(qiáng)度減弱，TnⅠ+anti-PD-1組更嚴(yán)重。Control組至第56天均無小鼠死亡；TnⅠ組至第21天無小鼠死亡，死亡率為0%，與control組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第56天累計(jì)1只死亡，死亡率為10%，與control組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TnⅠ+anti-PD-1組第21天累計(jì)1只死亡，死亡率為10%，第56天累計(jì)2只死亡，死亡率為20%，與control組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，圖1C）。

2.2 心臟指數(shù)

第56天將小鼠全部處死，分離全心并稱量心臟濕質(zhì)量，計(jì)算各組心臟指數(shù)。第56天，與control組相比，TnⅠ組的心臟指數(shù)未顯著增加［（4.6f 0.2）mg/gvs（4.4f 0.2）mg/g，P＞ 0.05］，而TnⅠ+anti-PD-1組的心臟指數(shù)顯著增加 ［（5.4f 0.1）mg/gvs（4.4f 0.2）mg/g，P＜0.05，圖1D］。

圖1 小鼠一般狀態(tài)、死亡率及心臟指數(shù)Fig.1 General status,mortality and cardiac index of mice

2.3 二維超聲心動(dòng)圖

采用Vevo2100超聲系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖檢查。圖2A為造模第56天擴(kuò)張型心肌病期典型M型超聲圖像。與control組相比，TnⅠ+anti-PD-1組的左心室EF顯著下降（45.3%f 5.2%vs63.7%f 4.6%，P＜0.001），且較TnⅠ組下降更顯著（58.6%f 2.8%vs63.7%f 4.6%，P＜0.01，圖2B）。

圖2 擴(kuò)張型心肌病期典型M型超聲心動(dòng)圖圖像及左心室EFFig.2 Typical M-mode echocardiographic images and left ventricular EF during dilated cardiomyopathy stage

2.4 心肌病理學(xué)改變

造模第21、56天分別取小鼠心臟以多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片行H-E染色。每組1只小鼠的典型病理學(xué)切片如圖3所示。

第21天急性心肌炎期：control組心肌細(xì)胞排列整齊、組織致密，該組10只小鼠均具有此特征；TnⅠ組見心外膜下少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整，該組9只小鼠具有此特征；TnⅠ+anti-PD-1組心外膜下大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞邊界不清、壞死，間質(zhì)水腫形成，該組10只小鼠均具有此特征，死亡的1只小鼠病理學(xué)改變最典型（圖3）。

圖3 心肌H-E染色Fig.3 H-E staining of myocardium

第56天擴(kuò)張型心肌病期H-E染色：control組心肌細(xì)胞仍排列整齊、形態(tài)正常，該組10只小鼠均具有此特征；TnⅠ組較第21天，浸潤(rùn)的急性炎癥細(xì)胞明顯減少，但心肌細(xì)胞有輕度邊界不清、間質(zhì)空泡化，該組10只小鼠均具有此特征，死亡的1只小鼠該改變最典型；TnⅠ+anti-PD-1組急性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少，但細(xì)胞邊界不清、纖維紊亂、間質(zhì)空泡化更顯著，部分細(xì)胞核呈異形、多核、核固縮、碎裂等病理學(xué)改變，該組9只小鼠具有此特征，其中死亡的2只小鼠病理學(xué)改變更顯著（圖3）。

2.5 其他器官病理

造模第56天分別取小鼠肺、肝臟、腎臟、小腸，以多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片行H-E、Masson染色。每組1只小鼠的典型病理學(xué)切片如圖4所示。Control組和TnⅠ+anti-PD-1組肺、肝臟、腎臟、小腸的細(xì)胞排列規(guī)則、形態(tài)基本正常，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫、纖維化增加，無明顯細(xì)胞壞死及細(xì)胞核固縮、碎裂，control組和TnⅠ+anti-PD-1組的10只小鼠均具有以上特征。H-E染色下，TnⅠ組肺、肝臟、腎臟、小腸則出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞排列及形態(tài)紊亂，相比于以上兩組，出現(xiàn)明顯間質(zhì)水腫、空泡樣改變，以及細(xì)胞壞死和核固縮、碎裂；Masson染色下，各器官出現(xiàn)較明顯的纖維增生性改變，TnⅠ組的10只小鼠均具有以上特征。

圖4 其他器官H-E和Masson染色Fig.4 H-E and Masson staining of myocardium

2.6 血清生物標(biāo)志物

第56天各組小鼠眼眶取血，2000×g離心20 min，取上清液檢測(cè)CK和CK-MB水平。與control組相比，TnⅠ+anti-PD-1組小鼠血清CK和CK-MB顯著升高 ［CK：（2833.0f 115.7）U/Lvs（1025.0f 74.8）U/L；CK-MB：（86.4f 2.6）U/ Lvs（40.3f 3.5）U/L，P均＜0.001］，且較TnⅠ組升高更顯著 ［CK：（2833.0f 115.7）U/Lvs（1578.0f 99.7）U/ L，P＜0.01；CK-MB：（86.4f 2.6）U/Lvs（58.8f 5.6）U/L，P＜0.05，圖5］。

圖5 血清生物標(biāo)志物Fig.5 Serum biomarkers

3 討論

防治PD-1抑制劑誘發(fā)的ICIAM是免疫治療的熱點(diǎn)［14］，小鼠模型具有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性高的特點(diǎn)。因此，建立模擬PD-1抑制劑誘導(dǎo)心肌炎發(fā)病的小鼠模型，是促進(jìn)其機(jī)制研究及藥物篩選評(píng)價(jià)的有效方法。

目前已有小鼠自身免疫性心肌炎模型和PD-1抑制劑誘導(dǎo)的心肌損傷模型。其中，第一種多以重組肌球蛋白重鏈-α誘導(dǎo)［9］、直接細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）和PD-1基因敲除［15］、柯薩奇病毒感染［16］構(gòu)建，但其大多只能建成急性心肌炎模型，未能模擬出慢性期心臟擴(kuò)張、纖維結(jié)構(gòu)紊亂等特點(diǎn)，成模率不足60%，心肌病變范圍僅15%～40%，甚至有脾臟、胰腺等免疫反應(yīng)強(qiáng)于心臟本身的情況［15］，且成本高、重復(fù)性差、與臨床PD-1抑制劑給藥方法差異大［9，11，15］，這些均極大地干擾了模型的有效性評(píng)估。第二種雖成模率能達(dá)到70%～90%，但通常需與程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制劑聯(lián)合、短時(shí)間大劑量給藥（6～10 d，每天各5～10 mg/kg），難以反映真實(shí)的ICIAM用藥和發(fā)病過程，其心肌損傷程度較第一種模型更輕，心肌病變面積僅為10%～20%，血清心肌酶波動(dòng)常無顯著差異［7，17］，與部分患者能由PD-1抑制劑誘發(fā)3～4級(jí)免疫性心肌炎差距大。綜上，這兩種模型均不是模擬人類ICIAM發(fā)病過程及特點(diǎn)的理想模型。

PD-1抑制劑多以每2 d給藥5～10 mg/kg以模擬臨床治療方案，但其累積劑量超過30 mg/kg時(shí)小鼠急性炎癥期的死亡率高達(dá)40%，且造成廣泛的肺、腸、腎、肝等靶器官外急性炎癥浸潤(rùn)，嚴(yán)重影響造模成功率［7，18］。TnⅠ是引起ICIAM的主要自身免疫反應(yīng)抗原，有研究［11］曾以2次0.25 mg TnⅠ皮下注射構(gòu)建自身免疫性心肌炎模型。構(gòu)建小鼠TnⅠ肽段誘導(dǎo)自身免疫性心肌炎，再以PD-1抑制劑強(qiáng)化，有望增加成模率，減少靶器官外損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)采用的造模方案為：每次5 mg/kg腹腔注射PD-1抑制劑，每2 d給藥1次，共持續(xù)5次，累積劑量25 mg/kg，同時(shí)輔以2次0.25 mg TnⅠ誘導(dǎo)，既可以使小鼠生物學(xué)變化更接近患者的真實(shí)情況，又可以避免短時(shí)大量給藥而增加死亡率。小鼠體重、進(jìn)食和死亡率是評(píng)價(jià)其一般狀態(tài)和造模成功率的重要指標(biāo)［19］，TnⅠ+anti-PD-1組在急、慢性心肌炎期體重和進(jìn)食情況下降更顯著，提示在TnⅠ誘發(fā)自身免疫心臟損傷的同時(shí)，ICI更加重了此損傷，與小鼠死亡率隨anti-PD-1累積劑量增加而上升的趨勢(shì)相近。盡管如此，本方法anti-PD-1組小鼠死亡率仍不高于20%，保證了造模成功率。

左心室EF是心功能評(píng)估較重要的指標(biāo)之一，有研究［20］報(bào)道，PD-1抑制劑誘發(fā)ICIAM致左心室EF下降。TnⅠ+anti-PD-1組左室EF下降較TnⅠ組更顯著，提示PD-1抑制劑不僅能在有TnⅠ等心肌炎誘發(fā)基礎(chǔ)的環(huán)境下誘導(dǎo)ICIAM，更可能下調(diào)免疫負(fù)反饋通路，加重炎癥和心肌損傷。心臟指數(shù)的變化也為此提供了佐證，心臟指數(shù)能直接反映心肌增生肥厚并間接提示心室重構(gòu)、左心功能不全［21］。TnⅠ組該指數(shù)無顯著增加，而TnⅠ+anti-PD-1組則顯著增加，進(jìn)一步證明了聯(lián)用TnⅠ和anti-PD-1能造成更典型的自身免疫性心肌損傷。

H-E染色是評(píng)估心肌細(xì)胞形態(tài)變化、判斷炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的重要手段［22］。既往自身免疫性心肌炎模型以心肌壞死、間質(zhì)水腫、小簇狀單核細(xì)胞和CD62L-CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)為特征，未見明顯心肌纖維化［8-9］。PD-1抑制劑誘導(dǎo)的心肌損傷模型也僅見4%～8%的間質(zhì)性心肌纖維化［7，10］。本研究模型的心肌病理學(xué)改變與上述兩種模型差異較大，除能觀察到大量急性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，還能繼續(xù)隨訪慢性擴(kuò)張型心肌病期的特點(diǎn)，TnⅠ+anti-PD-1組無論急、慢性心肌炎期細(xì)胞形態(tài)異常都最顯著，尤其是出現(xiàn)心肌纖維紊亂、空泡化等慢性特征性改變。CK和CK-MB在心肌損傷的全程中都可維持較高水平［23］。本研究模型在慢性期仍有明顯的CK和CK-MB升高，提示聯(lián)合用藥造成顯著而長(zhǎng)期的心肌損傷，這是既往模型不具備的，突出了本研究模型的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和有效性。

本研究探索出一種全新的、效果良好的小鼠自身免疫心肌炎模型的構(gòu)建方法。通過給予小鼠腹腔注射PD-1抑制劑和皮下注射經(jīng)特殊設(shè)計(jì)的小鼠TnⅠ肽段來構(gòu)建模型，并確定了合理而成熟的劑量和給藥間隔，有效地提高了建模的成功率和穩(wěn)健性，且方法簡(jiǎn)單易行，便于推廣。同時(shí)，也為ICIAM發(fā)病機(jī)制研究、治療藥物篩選、藥物療效評(píng)價(jià)提供了經(jīng)濟(jì)實(shí)用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

本研究模型仍存在一定的局限性。首先，劑量關(guān)系上，不同的單次給藥和累積給藥劑量對(duì)各評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響需進(jìn)一步探索，以模擬臨床PD-1抑制劑多種治療方案的心肌損傷效果。其次，時(shí)間關(guān)系上，指標(biāo)采集點(diǎn)時(shí)間間隔較長(zhǎng)，可設(shè)置更多采集點(diǎn)，以評(píng)估各指標(biāo)隨時(shí)間推移的動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)建立了一種PD-1抑制劑誘導(dǎo)的、低死亡率的小鼠心肌炎模型，以心肌急慢性自身免疫炎性改變、左心室EF下降、心肌酶譜升高為突出特征。同時(shí)，設(shè)計(jì)合成了一種特殊的小鼠心肌TnⅠ肽段，強(qiáng)化了PD-1抑制劑的造模效果。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。